专利名称：Heterorhabditis bacteriophora杀虫剂组合物及有关方法
技术领域：
本发明的领域本发明涉及含有具有增强的杀虫效应的含有传染期异型杆状(heterorhabditid)杂交线虫的新的杀虫剂组合物；具有该特征的新的线虫；以及通过在已感染土壤处施用有效效量的该杀虫组合物以减少土壤习居害虫虫口的方法。
本发明的背景含有生物杀虫剂或者昆虫病原性线虫成份的杀虫剂组合物开辟了一个引人瞩目的用生物控制剂抗土壤习居害虫的领域。它们比市售的化学杀虫剂具有许多重要的优势。线虫杀虫剂的优越性包括高毒性，广谱的宿主范围，安全性，政府注册免税及易于大批生产。
异型杆状型族的线虫构成了和Photorhabdus细菌的特有的共生联系。它们对多群昆虫具有病原性。异型杆状体是雌雄同体的。一般地，传染性的幼体通常是通过肠或气门穿入其宿主昆虫如白蛴螬的血腔。异型杆状体带有一个背齿从而便于穿入其它区域(如节间膜)。线虫消化系统的细菌释放于宿主体内，并且该宿主一般会在48小时内死于败血症。该线虫在宿主尸体内喂养，发育，成熟并繁殖，且通常在多代后，又产生感染性的幼虫，羽化，再寻找新的宿主昆虫。
希望提供含有那些具有改进的抗土壤习居害虫效应的杀虫剂线虫的杀虫剂组合物；具有该改进效应的新的线虫；使用该改进的杀虫剂线虫以控制土壤习居有害昆虫的方法；以及生产该改进的杀虫剂线虫的工艺和设备。
本发明的概述本发明所提供的是新的杀虫剂组合物以及通过在已有虫害处施用含有有效剂量的本发明的传染期的昆虫病原性线虫的新的杀虫剂组合物从而控制土壤习居的有害昆虫的改进方法。本发明的杀虫剂组合物包括有效剂量的带有Heterorhabditis bacteriophora杂交株HB(NJ)及其有效的变异体，突变体或者杂种的杀虫剂特性的幼态的传染期的杀虫的昆虫病原性线虫以及为此的生者杂种的杀虫剂特性的幼态的传染期的杀虫的昆虫病原性线虫以及为此的生物适应性载体。本发明所提供的还有本发明的杀虫组合物中的新的昆虫病原性线虫，其在控制土壤习居昆虫方面有高效性，包括对多种昆虫宿主有提高的病原性和增强的生殖力。本发明的详细说明该Heterorhabditis bacteriophora HB(NJ)杂交株是通过杂交一大系列从四个不同的栖息所收集的土壤标本中所得的H.bacteriophora的野生型分离株而获得的。该栖息所是草地，长有零散树的草地，长满杂草的原野以及长有零散树的长满杂草的原野，该栖息所代表许多收集点。
该杂交株的增强的特性包括对多种昆虫宿主增强的病原性或者传染性以及提高的生殖力。
通过下述试验测定传染性。所用的传染性标准化试验是把50个传染性的幼虫放置于砂柱(5cm直径×5cm高)的顶部，砂柱底部有一种靶昆虫(蜡蛾，Galleria mellonella)。该试验一般是在25℃下进行，并且砂中含有10％的重量百分比的水分。允许该线虫有24小时来寻找靶昆虫，在那一时刻取出该昆虫，在蒸馏水中漂洗并在25℃下再培育24小时以使该线虫有时间在宿主中发育。然后，解剖宿主并计数那些成功地定居于宿主中的线虫的数目。在每组重复20次的两组试验中，HB(NJ)的平均感染率为每个宿主有10.45和11.1个线虫(标准差(SE)分别为1.053和1.095)，全部宿主均被传染且在实验过程中死亡。在可比较的试验中，该HB(NJ)株表现的结果要比两种已知的H.bacteriophora株(HBNC和HBHP88)的好得多。它们仅分别杀死50％和70％的宿主，并且平均感染率分别是每个宿主只有0.08和1.20个线虫。该HB(NJ)株对其它昆虫的传染率也显示了其类似的优势。
生殖力通过以下试验测定。标准的生殖力试验是在25℃下定量那些从已用传染性的幼虫常规接种(n＝20)的标准重量(0.24-0.26克)的单个宿主(Galleria mellonella)中产生的新的传染性的幼虫的数目。关于用HB(NJ)的30次重复实验，得到的平均生殖力水平为383,046.7(标准差(SE)为15212.9)。说明HB(NJ)的生殖力是优越的。
本发明所提供的Heterorhabditis bacteriophora杂交菌株HB(NJ)具有保藏号ATCC_。
该杀虫剂组合物可以以含水的喷雾剂组合物形式；以使用藻酸钙或者其形式存在。
用于固定线虫或者部分干燥它们的载体可以减缓它们的新陈代谢并改善其对极端温度的耐受性。虽然由于线虫的生活能力迅速下降使得在室温下持久地贮藏的效果一般较差，但还是可以购得生存于潮湿的基质诸如泡沫，蛭石，和泥炭上的线虫。本发明的Heterorhabditis组合物适于贮存于10℃-15℃下且该有机体应保持在有氧的环境中。
可以使用包括小型压力喷雾器，喷雾鼓风机，静电喷雾器，风扇喷雾器，以及空中喷洒机的常用农业化学设备来施用线虫。昆虫病原性线虫可以耐受300磅/英寸2的压力并能用所有常规的开口直径小至50微米的喷口型喷雾器(如“01”喷头)喷洒。然而，一些类型的压出设备产生大量的热，而一旦该喷雾器管路中的温度升至32℃以上则对该线虫有副面影响。幸运的是它极少发生并且通常只是在该喷雾器箱几乎是空的以及几乎没有吸热用水的情况下发生的问题。
通常使用的田间浓度超过25亿个线虫/公顷(10亿/亩)以确保有足够虫口的线虫与靶昆虫接触从而产生控制作用。需要高浓度来克服无生命的和有生命的土壤环境的消极影响。也需要高线虫浓度来对付某些在钻入根部前只在土壤中停留几天的昆虫，如卷心菜蛆(D.radicum)，以及对付那些由于体积小且移动灵活而不易受线虫感染的昆虫。例如，需要高浓度的线虫对付早期未成熟阶段的蝼蛄(Scapteriscus spp.)，根蛆(Delia spp.)和玉米根蠕虫(Diabroticaspp.)。
有关适用于提供本发明的杀虫组合物的配方和应用以及有关本发明的工艺的广泛的讨论见于Randy Gaugler博士和Harry K.kaya博士编辑的论文集，“昆虫病原线虫在生防中的应用”，第9章，“Ramon Georgis配方和应用技术”，CRC出版社(Boca Raton，Ann Arbor，Boston)，1990。
用于测评线虫的杀虫活性的Galleria mellonella识别试验按下述方法进行，将Whatman 1号滤纸置于35mm的培养皿中。再将Galleria mellonella宿主置于滤纸上。将100个幼年线虫悬浮于500微升水中。通过打湿该滤纸几处的方法而将水悬浮液置于纸上。如果该Galleria mellonella在试验末期变红则表明Galleria mellonella宿主已死亡。
在用于分离线虫的Galleria mellonella诱铒方法中，感染了Heterorhabditisbacteriophora的Galleria mellonella通常会死亡并变成红色。所取的土壤样的bacteriophora的Galleria mellonella通常会死亡并变成红色。所取的土壤样的直径是2厘米且长度是15厘米。为了提供本发明的Heterorhabditisbacteriophora杂交株HB(NJ)，大约使用了150个Heterorhabditis bacteriophora分离株。
用于提供该HB(NJ)菌株的杂交育种法包括常规的步骤。
所提供的对本发明的改变和修改对于本领域的那些熟练技术人员来说是显而易见的，并且在本发明的精神之内的改变和修改也是在本发明的范围之内的。
权利要求
1.一种用于减少一种或多种土壤习居昆虫虫口的杀虫组合物，其包括有效剂量的一种具有Heterorhabditis bacteriophora杂交株Hb(NJ)或其有效的变异体或突变体的杀虫特性的幼态传染期杀虫的昆虫病原性线虫以及为此的生物适应性载体。
2.权利要求1的组合物，其中的线虫是Heterorhabditis bacteriophora杂交株Hb(NJ)。
3.一种用于降低土壤习居的白蛴螬或其它昆虫虫口的方法，其包括在该昆虫侵扰的土壤处施用含有效剂量的具有Heterorhabditis bacteriophora杂交株Hb(NJ)或其变异体或突变体的杀虫特性的处于传染期的一种杀虫的昆虫病原性线虫的杀虫组合物。
4.权利要求3的方法，其中的线虫是传染期的Heterorhabditisbacteriophora杂交菌株Hb(NJ)线虫。
5.一种Heterorhabditis bacteriophora杂交菌株HB(NJ)的线虫，其在幼态传染期内施于已有虫害的土壤处能降低一种或多种土壤习居的昆虫虫口。
6.权利要求5的一种幼态传染期线虫。
全文摘要
本发明提供了一种杀虫剂组合物,其包含有效剂量的处于幼态传染期的能杀虫的昆虫病原性Heterorhabditisbacteriophora杂交株Hb(NJ)或其突变体或者变异体,以及为此的生物适合性载体。相比于含有已知的H.bateriophora线虫HBHP88的已知杀虫组合物,该杀虫组合物提供了改进了的杀虫活性。本发明还公开了降低土壤中土壤习居昆虫虫口的方法,其是将上述杀虫组合物施于感染有这种昆虫的土壤处而进行。另外,还提供了该Hb(NJ)杂交线虫株。
文档编号A01N25/00GK1180375SQ96192982
公开日1998年4月29日 申请日期1996年1月25日 优先权日1996年1月25日
发明者兰迪·高格勒, 罗宾·斯图尔特 申请人:洛特格斯新泽西州立大学