葡萄的再生系统及其应用的制作方法

专利名称：葡萄的再生系统及其应用的制作方法
背景技术：
本发明涉及使葡萄植株再生的方法和用这种方法产生的葡萄种质。
葡萄藤是具有古老起源的温带落叶水果作物。葡萄产量(6×106公吨)超过了任何其它温带水果作物的产量，在柑桔类和香蕉产量之后据第三位。另外，由于其在新鲜水果、果汁、果冻、葡萄干和葡萄酒方面的用途，葡萄的价值超过了所有其它水果作物。因此，改良葡萄的成功努力可能对工业化葡萄栽培具有重要影响。
目前改良葡萄藤的方法是耗时费力的。例如，通过传统的育种进行的葡萄遗传改良受诸如结果期前(pre-bearing age)时间长和倍性水平改变的许多因素的严重限制。栽培葡萄也是高度杂合的，一般不能由种子纯育。而且，葡萄育种程序是昂贵的长期计划。尽管植物生物技术是葡萄遗传改良的一个有吸引力的替代方法(Kuksova等，Plant CellTiss.Org.Cult.4917-27，1997)，但仅当有有效的再生系统时，才能应用体外遗传操作。因此，减少任何这些问题的方法均代表本领域的重大进展。
发明概述我们已经发现了使多年生葡萄胚胎发生培养物生长的方法和采用液体悬浮培养物在相对短时间内由这种多年生胚胎发生培养物生长大量葡萄体细胞胚的方法。本发明的方法提供几个优点。例如这些方法促进非常高频率的体细胞胚的形成和植物再生。先前尚未报道过任何已知的栽培品种的葡萄藤再生具有这种频率，这种频率使得该方法可用于大规模生产葡萄植株的克隆栽植材料。另外，所述方法产生的胚胎无诸如融合和体细胞胚扁化(fasciation)等常见的异常。本发明的方法也导致胚胎发生培养物起始频率提高，使得能够产生高胚胎发生培养物，这种高胚胎发生培养物然后可以成功地通过再生过程的随后阶段至完整植株水平。由于具有这些优点，本发明的方法尤其可用于应用这种作物遗传改良的生物技术。
因此，第一方面，本发明特征性描述了产生成熟体细胞胚的方法。该方法包括以下步骤(a)提供包括胚胎发生细胞在内的液体培养物；(b)由该培养物回收胚胎发生细胞；(c)将胚胎发生细胞转移至第二培养物；和(d)由所述胚胎发生细胞生长出葡萄成熟体细胞胚。
所述胚胎发生细胞最好得自花药、子房、胚珠、花组织、营养组织、蔓、叶、根、珠心组织、茎、种子、原生质体、中柱鞘、顶端分生组织、胚胎发生组织、体细胞胚或合子胚。在再一优选实施方案中，步骤(a)的液体培养基包括植物生长调节物(例如生长素、NOA(萘氧乙酸)、吲哚-3-乙酸(IAA)、麦草畏、毒莠定(picloram)、萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、细胞分裂素、苄基腺嘌呤(BA)、噻二唑素(thidiazuron)、玉米素、脱落酸(ABA)或赤霉酸(GA)。在其它优选的实施方案中。起始培养基包括至少0.01mg/L细胞分裂素；至少0.1mg/L一种糖；和至少0.1mg/L含氮化合物。典型的糖包括蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和甘油。典型的含氮化合物包括硝酸钾、硝酸钙、硝酸铵和硫酸铵。如果需要，可以用DNA(例如编码能够赋予抗病性的基因的DNA)转化所述胚胎发生细胞或体细胞胚。可以通过过滤、沉降或选择，从第一培养物回收所述胚胎发生细胞。另外，可以筛分第一培养物，以使分化的葡萄体细胞胚的形成同步。
步骤(a)的胚胎发生细胞最好得自选自以下的来源按照第一方面的步骤(a)和(b)产生的胚胎发生细胞；按照第一方面的步骤(a)-(d)产生的葡萄体细胞胚；按照第一方面的方法产生的成熟体细胞胚；按照第五方面的小植株；和来自按照第一方面的方法产生的成熟体细胞胚产生的植物的花药、子房、胚珠、花组织、营养组织、蔓、叶、根、珠心组织、茎、种子、原生质体、中柱鞘、顶端分生组织、胚胎发生组织、体细胞胚或合子胚。
在优选实施方案中，该方法还包括将所述体细胞胚转移至萌发培养基以生长出葡萄小植株。
在其它优选实施方案中，如果需要，在包括植物生长调节物在内的培养基上培养所述胚胎发生细胞。
第二培养物可以是液体培养物或固体培养物。液体培养物的优选培养基包括B-5主要盐和MS次要盐。
第二方面，本发明特征性描述了产生葡萄体细胞胚的方法。该方法包括以下一般步骤(a)提供包含胚胎发生细胞的液体培养物；(b)从所述培养物中选择所述胚胎发生细胞；(c)将所述胚胎发生细胞转移至第二培养物；和(d)由所述胚胎发生细胞生长出葡萄体细胞胚。
第三方面，本发明特征性描述了产生葡萄体细胞胚的方法。该方法包括以下一般步骤(a)提供包含胚胎发生细胞和包括B-5主要盐和MS次要盐的培养基的液体培养物；(b)从所述培养物中回收所述胚胎发生细胞；(c)将所述胚胎发生细胞转移至第二培养物；和(d)由所述胚胎发生细胞生长出葡萄体细胞胚。
第四方面，本发明特征性描述了按照第一方面的方法产生的葡萄成熟体细胞胚。
第五方面，本发明特征性描述了由第四方面的葡萄成熟体细胞胚产生的小植株。
第六方面，本发明特征性描述了长期贮存葡萄成熟体细胞胚的方法。该方法包括将所述胚胎干燥并将所述胚胎贮存于低于8℃的温度的一般步骤。
所述葡萄成熟体细胞胚最好用第一方面的方法产生。
第七方面，本发明特征性描述了葡萄体细胞胚的直播方法。该方法包括将所述葡萄体细胞胚置于包含沙子和盆栽混合物的盆栽培养基中。
第八方面，本发明特征性描述了用液体培养基由多年生葡萄胚胎发生培养物产生葡萄体细胞胚的方法。该方法包括的步骤是(a)在第一液体培养基中培养多年生葡萄胚胎发生培养物，以生长出细胞悬浮培养物，第一液体培养基包含一种植物生长调节物；(b)从所述细胞悬浮培养物回收胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团；和(c)在第二液体培养基中培养得自步骤(b)的细胞悬浮培养物的胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团，以产生葡萄体细胞胚。
在优选实施方案中，该方法还包括将葡萄体细胞胚转移至萌发培养基以生长出葡萄小植株。
在第八方面的其它优选实施方案中，所述植物生长调节物为生长素、NOA、BA、玉米素、麦草畏、毒莠定、NAA、IAA、2，4-D、细胞分裂素、噻二唑素、ABA或GA。在另外的优选实施方案，将步骤(a)的液体细胞培养物传代培养，从所述细胞悬浮培养物回收所述葡萄细胞或葡萄细胞簇包括过滤、沉降或选择。在其它优选实施方案中，所述第二液体培养基还包括一种植物生长调节物(例如细胞分裂素)。可以筛分步骤(c)的液体细胞培养物，以使分化的葡萄体细胞胚的形成同步。如果需要，步骤(a)的葡萄体细胞胚或胚胎发生细胞可以各自用DNA转化。在步骤(b)中回收的胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团也可以用DNA转化。同样，所述回收的体细胞胚可以用DNA转化。
第九方面，本发明特征性描述了用固体培养基由多年生葡萄胚胎发生培养物产生葡萄体细胞胚的方法。该方法包括以下步骤(a)在第一液体培养基中培养胚胎发生细胞，以生长出细胞悬浮培养物，所述第一液体培养基包含一种植物生长调节物；(b)从所述细胞悬浮培养物回收胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团；和(c)在固体培养基中培养来自步骤(b)的细胞悬浮培养物的胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团，以产生葡萄体细胞胚。
在第九方面的优选实施方案中，所述固体培养基还包含一种植物生长调节物(例如细胞分裂素、ABA或GA)。在其它优选实施方案中，筛分所述回收的胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团，以使葡萄成熟体细胞胚的形成同步。
第十方面，本发明特征性描述了用液体培养基选择对植物病原体具有抗性的葡萄体细胞胚的方法。该方法包括以下步骤(a)在第一液体培养基中培养葡萄体细胞胚，以生长出细胞悬浮培养物，所述第一液体培养基包含一种植物生长调节物和植物病原体培养物的滤液；(b)从所述细胞悬浮培养物回收胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团；和(c)在第二液体培养基中培养所述胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团，以产生葡萄体细胞胚。
第十一方面，本发明特征性描述了产生对植物病原体具有抗性的葡萄植株的方法。该方法包括以下一般步骤(a)在第一液体培养基中培养葡萄体细胞胚，以生长出细胞悬浮培养物，所述第一液体培养基包含一种植物生长调节物和植物病原体培养物的滤液；(b)从所述细胞悬浮培养物回收胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团；(c)在第二液体培养中培养所述葡萄细胞或葡萄细胞簇，以产生葡萄体细胞胚；(d)回收葡萄体细胞胚，其中所述葡萄体细胞胚对所述植物病原体具有抗性；和(e)由所述葡萄体细胞胚生长出植株。在第十或第十一方面的优选实施方案中，所述方法还包括将所述葡萄体细胞胚转移至萌发培养基，以生长出葡萄小植株。在其它优选实施方案中，所述病原体滤液得自病毒、线虫、昆虫、真菌(例如痂囊腔菌(Elsino
ampelina))或细菌。在其它优选实施方案中，步骤(a)的植物生长调节物为生长素。在另外的优选实施方案中，所述第二液体培养基还包含一种植物生长调节物。
本发明的其它特征和优点将从以下详细的说明书和权利要求书中明显看出。
附图描述图lA为植物培养平板的照片，显示得自液体培养基的“Chardonnay”胚胎发生团。该照片拍自液体细胞培养起始后约10周。


图1B为显示子叶期体细胞胚的植物培养平板的照片。该照片拍自胚胎发育起始后约12周。
图1C显示在液体培养物中开始早熟萌发的成熟体细胞胚的植物培养平板的照片。注意到在许多胚胎中根的延长。该照片拍自胚胎发育开始后约20周。
图1D培养5周后显示在固体培养基中体细胞胚分化的初始阶段的植物培养平板的照片。这些体细胞胚得自在液体培养基中培养的胚胎发生细胞团(来自
图1A)。
图1E为显示在固体培养基中体细胞胚发育早期阶段的植物培养平板的照片。非常早期的体细胞胚是玻璃样的，并在数天后开始变为不透明。
图1F为显示在具有3％蔗糖的MS基础培养基上萌发的成熟体细胞胚的植物培养平板的照片。
发明详述我们已经开发了可用于葡萄再生的使多年生葡萄胚胎发生培养物生长的方法。已经观察到由我们的培养系统产生的特有种质产生的葡萄植物再产生胚胎发生培养物的能力增强。此外，我们已经开发出一种方法，采用液体悬浮培养物在相对短时间内由这种多年生胚胎发生培养物生长出大量的葡萄体细胞胚。
本文所用的术语定义如下“多年生葡萄胚胎发生培养物”是指一种胚胎发生培养物，其中的胚胎发生细胞或细胞团已经重复选择、传代培养和作为体外培养物维持。这种多年生葡萄胚胎发生培养物维持了至少半年，优选维持至少3年，最优选4年或4年以上。
“胚胎发生细胞”、“胚胎发生细胞团”或“胚胎发生培养物”是指具有发育为体细胞胚且最终发育为植物的固有潜力的细胞或细胞集合。通常这类细胞具有大的细胞核和致密的细胞质。另外，这类细胞是全能性的，因为它们具有最终变为完整植株的所有遗传和结构潜力。
“胚胎发生水平提高”是指在多年生葡萄胚胎发生培养物中产生胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团的能力高于对照非多年生葡萄胚胎发生培养物的水平。一般而言，这种胚胎发生水平的提高高于对照胚胎发生培养物水平至少20％，优选50％，更优选100％，最优选250％。用常规方法测定胚胎发生水平。
“外植体”是指得自植物、并且体外培养用于起始植物细胞培养物或植物组织培养物的器官、组织或细胞。例如，外植体葡萄组织事实上可以得自葡萄藤的任何部分，包括但不限于花药、子房、胚珠、花组织、营养组织、蔓、叶、根、珠心组织、茎、种子、原生质体、中柱鞘、顶端分生组织、胚胎发生组织、体细胞胚或合子胚。
“植物生长调节物”是指影响植物细胞生长和分裂的化合物。优选的植物生长调节物包括天然或合成的生长素或细胞分裂素。典型的生长素包括但不限于NOA、2，4-D、NAA、IAA、麦草畏和毒莠定。典型的细胞分裂素包括但不限于BA和玉米素。
“体细胞胚胎发生”不通过有性生殖、而由植物细胞和组织体外起始和发育胚胎的过程。
“体细胞胚”是指由体细胞或胚胎发生细胞通过细胞有丝分裂在体外形成的胚胎。
“成熟体细胞胚”是指有根和苗端迹象并表现出两极结构的完全发育的胚胎。优选的成熟体细胞胚为具有清晰子叶的那些成熟体细胞胚。
“小植株”是指由体细胞胚衍生的小的萌发植株。
“再生”是指在植物组织培养物中产生器官、胚胎或完整植株。
“病原体”是指其对活植物组织的感染在所述植物组织中引发病害反应的生物。这类病原体包括但不限于细菌、支原体、真菌、昆虫、线虫、病毒和类病毒。在Agrois，Plant Pathology，第3版，Academic Press，Inc.，New York，1988的第11-16章中描述了由这些病原体引起的植物病害。典型的细菌病原体包括但不限于葡萄土壤杆菌(Agrobacteriumvitis)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、苛养木杆菌(Xylellafastidosa)和葡萄酒黄单胞菌(Xanthomonas ampelina)。典型的真菌病原体包括但不限于葡萄钩丝壳(Uncinula necator)、葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、葡萄球座菌(Guignardia bidwellii)、Phomophsis viticola、痂囊腔菌、弯孢壳属真菌(Eutypa lata)、假蜜环菌(Armillaria mellea)和大丽花轮枝孢(Verticlliumdahliae)。典型的致病线虫包括但不限于根癌线虫(例如根结线虫属线虫(Meloidogyne sp.))、孢囊线虫(例如异皮线虫属线虫(Heteroderasp.))、侵袭根的线虫(例如轮转线虫属线虫(Rotylenchulus reniformis))和地上线虫(例如Anguina funesta)。致病害虫(例如昆虫)的实例包括但不限于根瘤蚜科(Phylloxera)、鞘翅目(Coleoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、同翅目(Homoptera)、革翅目(Dermptera)和双翅目(Diptera)。病毒病原体的实例包括但不限于葡萄扇叶病毒和葡萄卷叶病毒。
“抗性水平提高”是指在抗性葡萄藤(或其嫩枝(scion)、根状茎、细胞或种子)中对致病病原体或害虫的抗性或耐性水平高于对照植物的抗性或耐性水平，或抗性和耐性均高于对照植物(即尚未经受对任何植物病原体或其含毒素滤液进行体外选择的葡萄藤)。在优选实施方案中，本发明抗性植物的抗性水平比对照植物的抗性高至少5-10％(优选30％或40％)。在其它优选实施方案中，对致病病原体的抗性水平比对照植物的抗性水平高50％、60％，更优选甚至高75％或90％；最优选与对照植物的抗性水平相比高多达100％以上。采用常规方法测定抗性或耐性水平。例如，可以通过比较抗性葡萄植株与对照葡萄植株的物理特征和特性(例如株高和植株重量，或通过比较病症，例如侵蚀斑发生延迟、侵蚀斑大小减小、叶蔫萎、皱缩和缩叶、水果串腐烂、水浸斑、叶焦和叶缘烧以及细胞变色)可以确定对病原体抗性的水平。
“转化的”是指包含人工插入细胞并成为由该细胞发育出的生物的基因组部分(或者以整合方式或者以染色体外方式，例如包含亚基因组启动子的病毒表达构成物)的核酸分子(例如DNA序列)的任何细胞。本文所用的转化的生物或细胞一般是转化的葡萄藤或葡萄藤部分，并将所述核酸分子(例如转基因)人工插入所述植物细胞的细胞核或质体区室内。
“转基因”是指人工插入细胞并成为由该细胞发育出的生物的部分(整合入所述基因组或于染色体外维持)的核酸分子(例如DNA)的任何片段。这种转基因可以包括对所述转基因生物为部分或全部异源(即外来的)的基因，或可以代表对该生物内源基因同源的基因。
本文所述的再生方法已经用来通过多种葡萄藤根状茎和嫩枝栽培品种的体细胞胚胎发生，成功地进行再生，所述葡萄藤根状茎和嫩枝栽培品种包括Autumn Seedless、Blanc du Bois、Cabernet Franc、Cabemet Sauvignon、Chardonnay(例如CH01和CH02)、Dolcetto、Merlot、Pinot Noir(例如PN和PN Dijon)、Semillon、White Riesling、Lambrusco、Stover、Thompson Seedless、Niagrara Seedless、Seval Blanc、Zindindel、Vitis rupestris St.George、圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)Carlos、圆叶葡萄Dixie、圆叶葡萄Fry和圆叶葡萄Welder。
采用本文所述的植物组织培养方法，我们也已经开发了使得本领域技术人员能够开发植物抗性葡萄藤的选择方法。一个这种应用是在葡萄细胞培养物中选择突变。在该应用中，根据生长增强或选择性生长，选择对特定条件抗性或敏感的细胞。所述细胞可以进一步暴露于诱变剂，导致所暴露细胞的DNA改变。然后可以采用标准技术鉴别诱变的DNA。第二种相关应用是抗病原体细胞的选择。在病原体存在下培养细胞。然后，可以用显示抗性的细胞再生出抗病原体植株。第三种应用是将遗传信息转移入葡萄细胞中。所述遗传信息可以包括编码选择标记的核酸序列。在选择压力下培养细胞，导致仅具有所需遗传信息的细胞增殖或存活。本文所述的方法也使得本领域技术人员能够开发、选择和繁殖具有新的或有用特性的葡萄藤变异体。
本发明的方法一般可应用于多种葡萄植物(例如Vitis spp.、Vitisspp.杂种和Euvitis和Muscadinia亚属的所有成员)，包括嫩枝或根状茎栽培品种。典型的嫩枝栽培品种包括但不限于称为食用葡萄或做葡萄干用葡萄的Alden、Almeria、Anab-E-Shahi、Autumn Black、BeautySeedless、Black Corinth、Black Damascus、Black Malvoisie、黑王子(BlackPrince)、黑玫瑰(Blackrose)、Bronx Seedless、Burgrave、Calmeria、Campbell Early、Canner、Cardinal、Catawba、Christmas、Concord、Dattier、Delight、钻石(Diamond)、Dizmar、公爵夫人(Duchess)、EarlyMuscat、Emerald Seedless、Emperor、Exotic、Ferdinand de Lesseps、Fiesta、Flame seedless、Flame Tokay、Gasconade、Gold、Himrod、Hunisa、Hussiene、Isabella、Italia、July Muscat、Khandahar、Katta、Kourgane、Kishmishi、Loose Perlette、Malaga、Monukka、Muscat of Alexandria、Muscat Flame、Muscat Hamburg、New York Muscat、Niabell、Niagara、Olivette blanche、Ontario、Pierce、皇后(Queen)、Red Malaga、Ribier、Rish Baba、Romulus、Ruby Seedless、Schuyler、Seneca、Suavis(IP365)、Thompson seedless和Thomuscat。它们也包括用于葡萄酒生产的栽培品种，诸如Aleatico、Alicante Bouschet、Aligote、Alvarelhao、Aramon、Baco Blanc(22A)、Burger、Cabernet franc、Cabernet、Sauvignon、Calzin、Carignane、Charbono、Chardonnay(例如CH01、CH02、CH Dijon)、Chasselas dore、Chenin blanc、Clairette blanche、Early Burgundy、EmeraldRiesling、Feher Szagos、Fernao Pries、Flora、French Colombard、Fresia、Furmint、Gamay、Gewurztraminer、Grand noir、Gray Riesling、GreenHungarian、Green Veltliner、Grenache、Grillo、Helena、Inzolia、Lagrein、Lambrusco de Salamino、Malbec、Malvasia bianca、Mataro、Melon、Merlot、Meunier、Mission、Montua de Pilas、Muscadelle du Bordelais、Muscat blanc、Muscat Ottonel、Muscat Saint-Vallier、Nebbiolo、Nebbiolofino、Nebbiolo Lampia、Orange Muscat、Palomino、Pedro Ximenes、PetitBouschet、Petite Sirah、Peverella、Pinot noir、Pinot Saint-George、Primitivodi Gioa、Red Veltliner、Refosco、Rkatsiteli、Royalty、Rubired、RubyCabernet、Saint-Emilion、Saint Macaire、Salvador、Sangiovese、Sauvignonblanc、Sauvignon gris、Sauvignon Vert、Scarlet、Seibel 5279、Seibel 9110、Seibel 13053、Semillon、Servant、Shiraz、Souzao、Sultana Crimson、Sylvaner、Tannat、Teroldico、Tinta Madeira、Tinto cao、Touriga、Traminer、Trebbiano Toscano、Trousseau、Valdepenas、Viognier、Walschriesling、White Riesling和Zinfandel。根状茎栽培品种包括Couderc 1202、Couderc 1613、Couderc 1616、Couderc 3309(Vitis ripariaX rupestris)、Dog Ridge、Foex33 EM、自由(Freedom)、Ganzin 1(AxR#1)、Harmony、Kober 5BB、LN33、Millardet & de Grasset 41B(欧洲葡萄(Vitis vinifera)X berlandieri)、Millardet & de Grasset 420A、Millardet& de Grasset 101-14(Vitis riparia X rupestris)、Oppenheim 4(SO4)、Paulsen 775、Paulsen 1045、Paulsen 1103、Richter 99、Richter 110、RipariaGloire、Ruggeri 225、Saint-George、Salt Creek、Teleki 5A、Vitis rupestrisConstantia、Vitis california和Vitis girdinana、Vitis rotundifolia、圆叶葡萄Carlos、Teleki 5C(Vitis berlandieri X riparia)、5BB Teleki(选择Kober，Vitis belandieri X riparia)、SO4(Vitis berlandieri X rupestris)和039-16(欧洲葡萄X Muscadinia)。
以下有每种上述方法的描述。提供这些实施例是为了说明本发明，不应解释为限制性的。多年生葡萄胚性培养系统以下方法已经证明可有效地用于产生多年生葡萄胚性培养物，以及用于通过体细胞胚胎发生再生葡萄藤。
外植体组织和培养的起始在培养起始步骤中，由田间、温室或葡萄藤的体外苗微繁殖培养物收集外植体材料，并将其置于体外培养。该外植体材料通常由叶、花药或蔓收集，但也得自葡萄藤的其它营养组织或繁殖组织。一旦收集好，如果需要，则按照标准方法将所述外植体组织表面消毒，然后置于培养皿中的合适固体培育起始培养基上。
可以使用多种熟知培养基中的任何一种，例如Murashige和Skoog(MS)培养基以及Nitsch氏培养基。这类培养基通常包括无机盐、维生素、微量营养物、氮源和碳源(诸如蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、甘油、肌醇等)。例如，可以加入浓度为约1g/L至约200g/L的蔗糖；最好浓度为约30g/L至约90g/L。此外，可以修改这类植物组织培养基的组成，以使所用的特定植物细胞的生长最佳。例如，可以由表1中所发现的任一基础培养基制备所述培养起始培养基。
表1实施例中常用培养基的组成
如果需要，所述起始培养基可以含有一种生长素或生长素的混合物，根据目的栽培品种，其浓度为约0.01mg/L至约100mg/L，该浓度对于诱导在所述外植体组织上产生胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团是有效的。例如，可以在琼脂固化的Nitsch型培养基上维持外植体组织，其中所述培养基补充有约0.01mg/L至约10mg/L 2，4-D，最好补充有约0.5mg/L至约3.0mg/L2，4-D。2，4-D仅仅是可用于本发明方法的生长素的一个实例。其它生长素包括例如NAA、NOA、IAA、麦草畏和毒莠定。另外，如果需要，在所述培养基中可以包括标准浓度的其它植物生长调节物。例如，如果存在细胞分裂素(例如天然存在的或合成的细胞分裂素，诸如BA或玉米素)，其使用浓度可以为约0.01mg/L至约10mg/L，优选约0.3mg/L，取决于目的栽培品种。在某些情况下，可以包括合适标准浓度的其它类别的生长调节物，诸如ABA或GA。例如，可以加入浓度为约0.5mg/L至约20mg/L的ABA，其浓度最好为约5mg/L；可以加入浓度为约0.1mg/L至约30mg/L的GA，其浓度最好为约5mg/L。对于胚胎发生的诱导，在该阶段加入植物生长调节物不是必需的。另外，所述起始培养基也可以包含活性炭(0.1-2.0g/L)或本领域技术人员已知的相似的吸附剂。
在该阶段培养外植体组织最好在黑暗、22-30℃下进行，尽管也可以在非常低的光照条件下或在全光照下进行。培养约1-4周后，则将外植体组织培养物置于16小时光周期的全光照下。每周观察培养物，检查出现的胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团的存在。根据形态学鉴别胚胎发生细胞或细胞团。胚胎发生细胞团的颜色一般往往是白色或苍白色，常常为玻璃样的。根据它们的颜色和脆性、颗粒状外观，可以从非常小的早期阶段(10-20个细胞聚集体)将它们识别出。根据它们具有富含细胞质的细胞(如在显微镜下所见)的致密性质，也克鉴别出胚胎发生培养物。胚胎发生培养物出现的频率不同，取决于许多因素，包括但不限于基因型、外植体的性质和类型、培养基组成和收获季节。培养物的维持需要小心的目测选择，以确保合适的胚胎样结构的转移。一旦鉴别出胚胎发生细胞或细胞团，则如本文所述，将它们转移至培养物维持培养基上。
培养物的维持小心地取出胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团，将其转移至培养物维持培养基上。同样，可以使用多种熟知培养基中的任何一种，例如MS和Nitsch氏培养基。尽管一般不需要，但可以如上所述加入植物生长调节物。
一般而言，可以如本文所述，以有规律的间隔(例如每1-4周，或每4-8周)，将胚胎发生组织传代培养至新的维持培养基上，维持胚胎发生组织。或者，可以将胚胎发生组织置于液体培养基(例如MS、B-5或Nitsch)中，如本文所述作为液体胚胎发生悬浮液培养。使胚胎发生细胞团生长，以增加转移期间分割扩增的培养物所需的胚胎发生细胞生物量。通过对所述培养物的重复操作，包括在转移期间小心地选择胚胎发生细胞和细胞团，可以激励所述培养物，以朝增加的胚胎发生发育或朝较少的胚胎发生和更加未器官发生化的胚胎发生细胞的生长发育。已经发现重复转移胚胎发生细胞或细胞团不仅富集胚胎发生组织的生长，而且促进体细胞胚胎发生的过程。所述培养物是多年生的，因为它们通常持续2年以上。
本发明方法的关键组分包括从外植的组织中小心地选择胚胎发生细胞，然后将选定的胚胎发生组织轮回选择并传代培养。该材料不仅发现可用于由体细胞胚再生整株葡萄植株，而且发现具有显著增强的胚胎发生能力，包括产生体细胞胚。通过实施该方法，可以使胚胎发生细胞的生长富集，加速体细胞胚形成的过程和后续的植物再生。
当与从未经培养以产生胚胎发生细胞的克隆外植体组织取到的外植体材料相比时，观察到从由体细胞胚生长出的植物取到的外植体材料表现出增强的胚胎发生潜力。在两个或两个以上连续的起始、培养和植株再生循环(例如克隆植株-→外植体-→胚胎发生培养物起始-→体细胞胚-→体细胞胚衍生的植株-→外植体)后，观察到胚胎发生潜力的这种提高。不必使用体细胞胚衍生的植株作为外植体源；体细胞胚或甚至已经转移至新培养基的胚胎发生培养物也会产生胚胎发生潜力增加的体细胞胚。这种外植体材料方便地作为用作营养外植体源的体外腋生枝培养物维持；然而，其它植物维持方法也是可接受的。
萌发和小植株的生长按照标准方法，将得自上述培养基的体细胞胚随后萌发为葡萄小植株。例如，将体细胞胚置于无菌培养皿中的萌发培养基(例如MS培养基)表面上。将含有所述胚胎的培养物在光照条件(16小时光周期)下在生长室中培养。在萌发期间，出现根，上胚轴开始生长。当在萌发培养基上生长的葡萄小植株达到足够的大小(1cm，至少2片叶)时，可以将它们从培养皿中取出，置于无菌盆栽混合物中。通常将小植株转移到无土盆栽混合物(例如Vermiculite、Perlite或PtoMixTM，V.J.Growers，Apopka，FL)中的孵化室(nursery container)。如果需要，可以将小植物置于生长室中或温室湿气室中，在高湿度条件(90％湿度)下培养，以使小植株生长和适应气候。随后，将适应气候的小植株转移至室外葡萄园或温室。
在一个实施例中，我们描述了欧洲葡萄栽培品种“ThompsonSeedless”的胚胎发生多年生培养物。母本植株衍生的培养物得自表面消毒的叶片，并接种至Nitsch描述(1968)并由Gray D.J.改进的培养起始培养基(“葡萄的体细胞胚胎发生”载于Somatic embryogenesus inwoody perennials，第2卷，Gupta P.K.，Jain S.M.和Newton R.J.(编辑)，Kluwer Academic，Dordrecht，The Netherlands，第191-217页，1995)。该培养基含有约1.1mg/L2，4-D和约0.05mg/L BA。将该组织外植后，培养容器在完全黑暗中培养6周。在这6周期间，观察到大多数外植的组织形成大量的未分化的高度液泡化细胞。将根据其致密的性质和富含细胞质细胞的存在而鉴别出的胚胎发生培养物重复传代培养。通过上述选择方法，获得所得的培养物，然后传代培养(约6周)直至可得到足够的胚胎发生培养物。萌发出初始得自所述母本植株的体细胞胚(即第一代胚胎)，其芽尖用来产生体外微量繁殖培养物。然后，用该培养物衍生的植株的叶片产生新的胚胎发生培养物(第2代)。同样用得自该培养物的体细胞胚产生第3代。来自体外微量繁殖培养物衍生叶片的欧洲葡萄栽培品种“Thompson Seedless”的胚胎发生反应示于表2(下文)。这些结果显示盆栽母本植株源培养物的叶片与得自第3代萌发的体细胞胚的培养物衍生植株的叶片的比较。
表2
>*其它试验已经产生了一个胚胎发生培养物。#已经发现每片叶的反应百分率高达30％。
另外，用本文所述方法，也已经产生了来自其它葡萄藤的多年生胚胎发生培养物，包括Vitis longii、Vitis rotundifolia(栽培品种Carlo和Dixie)、Vitis rupestris、欧洲葡萄(栽培品种Autumn Seedless、CabernetSauvignon、Cabernet Franc、Chardonnay、Dolcetto、Gamay Beaujolais、Lambrusco、Pinot Noir、Semillon、Tokay、White Riesling、Zinfindel等)和几种葡萄属杂种(栽培品种Blanc du Bois、Niagara Seedless、SeyvalBlanc、Stover、Southern Home等)。用液体悬浮培养物或固体培养物产生高度胚胎发生葡萄细胞已经开发了一种方法，用于采用或者液体细胞悬浮培养物或固体培养系统产生大量葡萄藤体细胞胚。这些方法特别可用于产生能够再生为整株植株的高度胚胎发生细胞。以下提出了一种简单的方案，采用或者液体细胞悬浮培养物或固体培养系统可有效地使葡萄藤体细胞胚胎发生。
一般而言，该方法包括一个多级培养过程，该过程通常包括(i)培养起始；(ii)鉴别和分离胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团；(iii)产生多年生胚胎发生培养物；和(iv)浓缩高度胚胎发生细胞簇。该方法包括以下步骤。
如本文所述，将外植体组织置于合适的培养起始培养基上。在培养起始培养基上约6周后，鉴别出胚胎发生细胞和胚胎发生细胞团。一旦鉴别出胚胎发生培养物，如本文所述，则将所述胚胎发生培养物(可能直径小于1mm)分离出，在新鲜起始培养基上培养，以激励生长。所述胚胎发生培养物的传代培养通常导致体细胞胚的形成。然后，将胚胎发生培养物和得自这些培养物的早期体细胞胚在合适的液体植物生长培养基中进一步培养。例如，包含B-5培养基(Gamborg等，Exp.Cell.Res.50151-158，1968；Sigma Chemicals，St.Louis，MO)、如DeWald等(J.Amer.Soc.Hort.Sci.114712-716，1989)和Litz等(“芒果的体细胞胚胎发生”1995，见上文)所述进行改进的植物组织培养营养培养基。这种改进的培养基包含B-5主要盐、MS次要盐和维生素、谷胺酰胺(约400mg/L)和蔗糖或市售的食用糖(约60g/L)。在高压灭菌之前，将该培养基的pH调至约5.8。尽管2，4-D(约0.5-2.0mg/L)是优选用于该培养基的生长调节物，但也可以使用例如上述的合适浓度的其它生长调节物，诸如麦草畏、毒莠定、NOA或2，4，5-三氯苯氧乙酸。随后，将含有所述胚胎发生细胞培养物、体细胞胚或这两者的烧瓶于约26℃在旋转式振荡器上以125rpm在黑暗中或漫射光中培养。然后，如本文所述，将所述培养物传代培养，通常每10-14天一次，但传代培养方式可以根据胚胎发生细胞簇的生长和增殖而改变。
在约6-8周内，产生很好的细胞悬浮培养物，它包含高度液泡化伸长的细胞(非胚胎发生细胞)，也包含较少数目的小的富含细胞质的等径细胞(胚胎发生细胞)。一旦产生足够的培养物，则可以通过筛分从培养物中取出分化的胚胎，弃去所述分化的胚胎。在改进的B-5液体培养物中继续维持筛分的胚胎发生细胞悬浮培养物，定期进行传代培养，已经发现这提高胚胎发生细胞簇的生物量。
约12-16周后，通常观察到大量高度浓缩的葡萄胚胎发生细胞。根据几种因素，包括栽培品种、基因型和培养条件，浓缩胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团所用的时间可能不同。该阶段的胚胎发生细胞在事实上任何类型的遗传转化方法中均尤其有用。也可以按照任何标准方法，例如通过在改进的无生长调节物的B-5液体培养基中培养这些胚胎发生细胞约4-6周，诱导这些胚胎发生细胞，使其分化为体细胞胚。或者，可以将早期体细胞胚植于通过加入合适的胶凝剂(诸如吉兰糖胶、琼脂糖、琼脂或任何其它相似的试剂)而固化的培养基中，以使体细胞胚在完全黑暗中进一步分化。如果需要，可以单独将鱼雷期/子叶期胚胎在标准成熟培养基(例如包含MS营养制剂的成熟培养基)上传代培养。然后，将成熟的体细胞胚转移至生长室中进行萌发并在合适的容器中再生成植株。用该方法的体细胞胚形成的频率通常很高。
现在描述产生从“Thompson Seedless”和Chardonnay的两个不同克隆CH01和CH02的液体悬浮培养物和固体培养物得到的胚胎发生细胞和细胞团的结果。
将得自多年生胚胎发生组织的欧洲葡萄栽培品种“ThompsonSeedless”和Chardonnay CH01和CH02的异步体细胞胚，在液体培养基中培养，以产生愈伤组织悬浮培养物。约14天后和在约2-3次传代培养(约每14天进行一次传代培养)后，产生无定形淡黄色至乳白色愈伤组织。由于产生愈伤组织，组织培养烧瓶中的液体培养基看起来象稠密的悬浮液。显微镜检查表明，愈伤组织细胞伸长并高度液泡化，没有表现出胚胎发生能力的迹象。甚至当从所述培养物中取出用来起始所述培养物的体细胞胚时，无定形愈伤组织也继续增殖。
在改进的B-5液体培养基中约6周后，我们观察到产生作为白色团块的小簇富含细胞质的细胞(
图1A)。观察到这些胚胎发生团以指数增殖，并在约10-12周内生长至该烧瓶的容量。
将这些胚胎发生团作为单一单位(即在一个烧瓶内)继续维持通常是有害的，因为已经发现所述培养物的品质退化，最终变为褐色。在传代培养期间将这些胚胎发生培养物分割为较小的单位，有助于使所分割的培养物增殖并提高生物量。在测试的两种栽培品种中，Chardonnay的两个克隆生长同样快，其生长超过“ThompsonSeedless”。“Chardonnay”的胚胎发生细胞团是乳白色或淡黄色的，而“Thompson Seedless”的胚胎发生细胞团是暗白色或褐色的。此外，“Thompson Seedless”看来对培养密度更为敏感，因为观察到如果不更正培养密度，则所述细胞变暗。优选的培养密度为125ml烧瓶中每40ml液体改进B5培养基约400mg胚胎发生细胞。
在液体培养物中产生体细胞胚使胚胎发生团通过960微米尼龙筛，收集在无菌烧杯中。筛分所述胚胎发生团，以在液体培养物中起始胚胎发生，发现可用于两个目的。首先，得到相当程度的胚胎发育的同步化。其次，减少在分化期间形成体细胞胚异常，诸如扁化或融合。在液体培养基中4-6周后，观察到球形期或早心期的小的白色体细胞胚。在此阶段筛分培养物不促进胚胎分化的增加。
约8周后，体细胞胚清楚可见，发现少数胚胎已经达到胚胎发育的子叶期。然而，筛分分化的胚胎并在单独的烧瓶中将其培养，促进更快地分化以及胚胎发育的同步化。
发现两个“Chardonny”克隆CH01和CH02均容易分化为体细胞胚。适当的筛分和密度调节(通过每40ml培养基培养约1000mg体细胞胚而进行)，确保更加同步化和单一化(singulation)以及进行胚胎发育(
图1B)。在液体胚胎发生培养基中传代培养后约12-14周内，单一化的体细胞胚开始变绿，并且胚根伸长，表明开始早熟萌发(
图1C)。
最初没有发现“Thompson Seedless”的培养物在液体培养物中进行至心期以外。另外，发现所述胚胎更加群集，常常导致形成融合的体细胞胚。去除异常的体细胞胚并将培养密度降低一半，导致在液体培养物中正常的体细胞胚胎发生。这些体细胞胚在约14-18周内达到成熟。
在固体培养基中产生体细胞胚观察到得自液体培养物的胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团早至培养起始后3周分化为体细胞胚。培养4周后，显微镜检查也表明在愈伤组织上形成球形和心形体细胞胚(
图1D)。所述体细胞胚为玻璃状，类似超度含水状态的体细胞胚(
图1E)；然而，所述胚胎继续分化，发现在接下来的3-4周内发育为成熟的体细胞胚。观察到这些体细胞胚发育出胚柄(
图1E)。另外，观察到胚胎发生细胞发育为大量的异步体细胞胚。
由这些实验得出的一个有趣的观察结果是大多数体细胞胚作为单个单位产生，而不是作为小团块产生，尽管有少数体细胞胚团块。在这种情况下，每个团块中体细胞胚的数目为6-10个，这些胚胎容易从愈伤组织分离。在每周基础上分离子叶期中发现的胚胎，将其传代培养使其成熟。每个团块的胚胎发生团在至少12周内继续产生体细胞胚。在含有Gel-Gro(ICN Biochemicals)的固体培养基中胚胎发生细胞团往往变为褐色，但这种变色不会不利地影响培养物的生存力。约4-5周后，成簇的体细胞胚开始出现在褐色的胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团的表面上。
体细胞胚成熟、萌发和植株再生研究了三种成熟培养基，即芒果成熟培养基(Litz等，“芒果的体细胞胚胎发生”，1995，见上文)；用琼脂(7g/L)固化的芒果成熟培养基；和具有3％蔗糖的MS基础培养基，以评估促进体细胞胚萌发和植株再生的能力。我们的结果表明，对于源自固体培养基的两种胚胎和得自液体培养基培养物的早熟萌发的胚胎而言，含有3％蔗糖的MS基础培养基在促进胚胎成熟、萌发和植株再生方面最为有效(
图1D)。尽管在具有琼脂的芒果成熟培养基上萌发好，但再生的质量不如具有3％蔗糖的MS盐好。来自所研究的两种系统(即液体和固体研究)的胚胎其本身在萌发和再生方面表现出变异。尽管胚胎在液体培养物中已经早熟萌发，但未观察到在这些培养物中的继续萌发。然而，转移至固体培养基时，发现所述胚胎继续萌发过程，导致形成具有密集根系的葡萄植株。在胚根出现后在液体培养基中继续维持，导致超度含水，最终减少由这些胚胎再生植株。因此，最好是一旦所述体细胞胚早熟萌发，则应该将所述体细胞胚尽快自所述液体中取出，并转移至固体培养基上。
得自葡萄藤体细胞胚的悬浮液的长期保存和植株的再生我们已经建立了用于长期贮存体细胞胚的方法。在层流罩超净台中，将来自“Chardonnay”悬浮培养物的成熟体细胞胚在无菌滤纸上吸干，然后于6℃贮存于无菌培养皿中。这些培养皿中取样，在具有3％蔗糖的MS培养基上萌发。记录萌发(即由所述体细胞胚出现根)和植株再生。表3显示贮存22个月后得自克隆CH02的数据，表4显示贮存5个月后得自克隆CH01的数据。
表3
p><p>表4<
>得自悬浮培养物的葡萄藤体细胞胚的直接播种如本文所述，由液体培养物产生“Chardonnay”和“ThompsonSeedless”葡萄藤体细胞胚。在层流罩超静台中将得自悬浮液的成熟的体细胞胚简单地吸干，直接在含一种以下盆栽混合物的Magenta容器中萌发i)沙；ii)ProMixTM市售盆栽混合物(CPM)；或覆盖有沙的CPM。在接种所述体细胞胚之前，通过高压灭菌30分钟，将含有20ml蒸馏水和所述盆栽培养基的每个容器灭菌，过夜冷却。每个容器防放置3个体细胞胚。在无菌条件下进行播种，封闭容器，于26℃、16hr光周期、75μmols-1m-2光强下培养。结果表明，覆盖有沙的CPM对于植株发育是理想的。尽管沙促进更多萌发，但所得的植株萎黄，其生存率低。在纯CPM上有更多的体细胞胚污染。本研究提供了用悬浮培养物大规模增殖葡萄的范围并设置了用于使体细胞胚在生物反应器中生长的平台(platform)。
上述实验结果采用以下技术进行。
培养起始按照标准方法，例如本文所述的方法，由栽培品种“Chardonnay”(克隆CH0l和CH02)的花药和子房以及由栽培品种“ThompsonSeedless”的叶起始胚胎发生培养物。在改进的MS培养基中起始并维持的这些培养物的体细胞胚用来起始液体细胞悬浮培养物。通常这些培养物在胚胎发育和分化中是高度异步的，因此每种培养物包含不同发育阶段的体细胞胚。
由分化的体细胞胚建立液体培养物由Litz等所述的培养基(见上文)如下改变所述液体培养基的组成。通过在该培养基中加入1mg/L2，4-D，达到愈伤组织的诱导。将该培养基的pH调至约5.8，并以40ml的等份分装到125ml锥形瓶中。所述烧瓶用耐久(heavyduty)铝箔密封，然后高压灭菌。冷却后，在无菌条件下，用无菌匙突将约1克所述体细胞胚转移至液体培养基中。用Prarfilm将烧瓶颈密封，然后将培养物在半黑暗(漫射光)中，在旋转式振荡器上以约120rpm培养。将培养物每2周传代培养至少1次。
从定轨振荡器取出含有悬浮培养物的烧瓶，让培养物静置约15分钟。将上清液轻轻地倾至无菌烧瓶中，以最小体积(约5ml)保留胚胎发生细胞。将约35ml新鲜的液体培养基加至胚胎发生细胞，快速旋转。然后将烧瓶中的全部内容物转移至无菌125ml烧瓶中。含有胚胎发生细胞的这一第二烧瓶然后用Parafilm密封，放回定轨振荡器中。
如下收集由所述体细胞胚产生的无定形愈伤组织。让包括分化的体细胞胚和愈伤组织在内的胚胎发生悬浮培养物在烧瓶中静置。弃去约一半的上清液培养基，振荡剩余的培养基并通过预灭菌的、置于150ml烧杯上的尼龙网(960微米)快速过滤。分化的体细胞胚留在网上，而与液体培养基一起通过的细小的愈伤组织收集在烧杯中。收集在烧杯中的愈伤组织接着通过置于无菌漏斗上的无菌双折叠的Kimwipe过滤。随后用无菌匙突取出粘附于Kimwipe的无定形愈伤组织，将其重悬浮于新鲜的液体培养基中。每个烧瓶中悬浮约100mg的所述愈伤组织。这些液体培养物如本文所述，每14天在含有2，4-D的改进B-5液体培养基中传代培养约一次。
在悬浮培养物中产生体细胞胚用960微米筛筛分在液体悬浮培养物中起始的胚胎发生细胞或细胞团，在无菌条件下将较细小的部分收集在液体胚胎发生培养基中。该培养基的组成与起始培养物的组成相同；然而，该培养基中没有2，4-D，且加入约0.05mg/L BA。将pH调至5.8后，将培养基以40ml的等份分装到125ml锥形瓶中，覆盖铝箔并高压灭菌。每个烧瓶中培养约100mg的愈伤组织。在半黑暗、25℃下在旋转式振荡器上以120rpm维持该培养物，并且每14天传代培养一次。需要时进行培养物的筛分，以便使分化的体细胞胚同步化。如果必要，也可以使用更细目的筛(例如520微米筛)。
由悬浮培养物萌发体细胞胚并再生由悬浮培养物筛分具有伸长的胚根的绿化体细胞胚。将体细胞胚单独挑出并培养。在萌发和植株再生方面测试了三种不同的培养基，即芒果成熟培养基(Litz等，“芒果的体细胞胚胎发生”，1995，见上文)、用琼脂(7g/L)代替Gel-Gro固化的芒果成熟培养基和具有3％蔗糖的MS基础培养基。这些培养基制剂中没有植物生长调节物。每个标准的培养皿中培养25个胚胎，每种培养基测试8个平板。用Parafilm密封后，在生长室中在16小时光周期下培养所述培养物。随后将具有4片真叶的小植株转移至土壤。
在固体培养基中产生体细胞胚如上所述收集在悬浮培养物中产生的胚胎发生细胞和胚胎发生细胞团，然后转移至固体胚胎发生培养基上。该培养基包含与液体胚胎发生培养基相同的化合物，用2.0g/L Gel-Gro或7g/L琼脂固化。将约50mg愈伤组织作为一个团块置于含培养基的培养皿上，每个培养皿有两个这种团块。接种后，用Parafilm密封培养皿，在完全黑暗中培养。在观察到体细胞胚分化后进行传代培养。从培养后6周开始，每周对由胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团产生的体细胞胚计数。计数子叶期的胚胎，并传代培养以使其成熟。
来自固体培养基的体细胞的成熟和萌发从异步团块中分离长约5mm的成熟体细胞胚，将其在成熟培养基上培养。每个标准培养皿中在具有3％蔗糖的MS培养基上培养25个成熟的体细胞胚。在黑暗中保持所述培养基，直至它们萌发。胚轴伸长后，将它们转移至16小时光周期的光照下。具有至少4片真叶的小植株随后转移至土壤。抗病性胚胎发生细胞的选择和葡萄藤植株可以使用本发明的多年生葡萄胚胎发生培养物选择或筛选对毒性物质(诸如植物病原体产生的物质)具有抗性的葡萄细胞。这种病原体包括但不限于细菌、支原体、真菌、昆虫、线虫、病毒和类病毒。在Agrois，Plant Pathology，第3版，Academic Press，Inc.，New York，1988的第11-16章中描述了由这些病原体引起的植物病害，该文献通过引用结合到本文中。典型的细菌病原体包括但不限于葡萄土壤杆菌、根癌土壤杆菌、苛养木杆菌和葡萄酒黄单胞菌。典型的真菌病原体包括但不限于葡萄钩丝壳、葡萄生单轴霉、灰葡萄孢、葡萄球座菌、Phomophsis viticola、痂囊腔菌、弯孢壳属真菌(Eutypa lata)、假蜜环菌和大丽花轮枝孢。典型的致病线虫包括但不限于根癌线虫(例如根结线虫属线虫(Meloidogyne sp.))、孢囊线虫(例如异皮线虫属线虫(Heterodera sp.))、侵袭根的线虫(例如轮转线虫属线虫(Rotylenchulusreniformis))和地上线虫(例如Anguina funesta)。致病害虫(例如昆虫)的实例包括但不限于根瘤蚜科、鞘翅目、鳞翅目、同翅目、革翅目和双翅目。病毒病原体的实例包括但不限于葡萄扇叶病毒和葡萄卷叶病毒。
通过将胚胎发生培养物暴露于得自植物病原体的粗培养物滤液或纯化的毒素，可以选择并繁殖抗性葡萄细胞。预期经受得住选择压力的葡萄细胞不仅抗选择毒素，而且抗产生毒素的原始微生物。此外，由于所述选择方法的动力学，诱导的抗性也可能对用于选择的原始微生物以外的一系列致病生物起作用。因为这种选择是在细胞水平上进行的，所以可能由所述细胞再生的葡萄植株将表现出选定的特征。特别是，该系统使得本领域技术人员能够根据所需特征，从单个培养烧瓶和培养皿中的数千个细胞中进行选择或筛选。
葡萄藤病害各种微生物侵袭葡萄藤并引起许多病害。这些病害包括叶和果实的真菌病害(如黑腐病和炭疽病)、维管系统和根的真菌病害(诸如Esca、Black Measles、Black Dead Arm和Eutypa dieback)、细菌病害(诸如冠瘿和Pierce病)、由病毒和病毒样因子引发的病害(诸如rupestrisstem pitting、葡萄扇叶和葡萄卷叶退化病)以及由线虫和支原体引起的病害。
一种影响葡萄藤的病害是炭疽病，也称为鸟眼斑病(bird’s eye spotdisease)，由真菌痂囊腔菌引起。在合适的条件下，这种真菌侵袭包括果实在内的几乎所有的葡萄藤地上部分，引起对该作物的广泛的损害。在葡萄藤植株上，炭疽病引起的外观为具褐色或黑色边缘边界呈圆形或具棱角的环状侵蚀斑。侵蚀斑的中心变为略带灰白色，最终枯萎并脱落，留下“穿孔”外观。该病害尤其影响幼叶，阻碍正常的发育。也影响新苗，得到明显的灼伤(burnt)外观。果实串在其整个发育期间也易受真菌的感染；浆果上的侵蚀斑扩展至果肉中，通常诱导破裂。(Pearson和Goheen，Compendium of Grape Disease，APS Press，St.Paul，MN，1988)。
病原体滤液如下制备具有毒性活性的痂囊腔菌培养物滤液。将所需量的肉汤混合物溶于去离子(DI)水中，制备全强度Czapekk-Dox肉汤培养物(Fisher Scientific，Springfield，NJ)。将培养基以50ml的等份分装到125ml锥形瓶中。高压灭菌和冷却后，将100μl痂囊腔菌孢子悬浮液加至每个烧瓶中(第1天)；然后将烧瓶在旋转式振荡器中以120rpm在黑暗中培养1周。1周后，将每个烧瓶中的内容物转移至250ml锥形瓶的100ml全强度Czapek-Dox中。该时期(即从第1天起3周)结束时，通过将每个烧瓶中的内容物通过无菌多层干酪包布收集真菌培养物滤液。将粗制培养物滤液贮存于-4℃，直至如前所述进一步使用(Subramanian，J.，“芒果(Mangifera indica L.)胚胎发生培养物对盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides)抗性的选择和特征鉴定”，Penz.，”Ph.D.Dissertation，University of Florida，Gainesville，1995)。
在加入培养基进行体外选择之前，将冷冻的培养物滤液于室温下解冻(不加热)，将pH调至5.8，并通过0.2微米滤器(Nalgene，Rochester，NY)过滤除菌。发现这种过滤除菌的病原体滤液保留其毒性活性。
选择接着将痂囊腔菌培养物滤液加至改进B-5培养基中的欧洲葡萄栽培品种“Chardonnay”胚胎发生细胞和胚胎发生细胞团的液体悬浮培养物中，以选择对毒性真菌培养物滤液具有抗性的细胞。如上所述使所述葡萄胚胎发生细胞和胚胎发生细胞团生长；然而，在这种体外选择中，所述细胞在其中生长的培养基补充有已知体积的痂囊腔菌培养物滤液。通过用连续稀释分析检查该滤液的毒性，确定病原体滤液的合适稀释度。这些实验证明，40％(v/v)的培养物滤液可用于体外选择。
“Chardonnay”胚胎发生细胞和胚胎发生细胞团的培养物在含40％(v/v)真菌培养物滤液的液体培养基中，在约26℃下旋转式振荡器(125rpm)上在漫射光下维持。在10天内进行一次传代培养；在每次传代培养期间，用过滤除菌的培养物滤液稀释培养基。用培养物滤液进行的选择持续4-5个传代培养循环(每个循环＝10天)。大多数胚胎发生细胞死亡，而非常少的细胞(通常少于1％)经受得住所述选择压力。通过在4或5个循环后撤销选择压力，并让存活的细胞在无培养物滤液的改进B-5培养基中生长，建立抗性培养系。增殖这些抗性系，并用本文所述的方法产生体细胞胚。
随后采用多种体外生物测定，测试得自选择过程的胚胎发生细胞对痂囊腔菌的抗性。我们首先分析了葡萄藤抗性系是否产生能够抑制所述真菌生长的活性。为此，测试抗性培养系的培养基(即条件培养基)对所述真菌的抑制活性。由对痂囊腔菌属具有抗性的不同细胞培养物收集条件培养基，并以几种浓度使用，以制备真菌生长培养基。将一个活跃生长的菌丝体菌落置于含真菌生长培养基的培养皿中央，所述培养基用或不用(对照)来自抗性葡萄藤培养系的条件培养基制备，并在标准条件下培养所述菌丝体菌落。这些实验的结果表明，含25％或25％以上的条件培养基的真菌生长培养基抑制所述真菌的生长。
为进一步证实抗性葡萄藤培养物中存在抗真菌活性，将抗性系以及对照系以6点钟和12点钟的位置置于培养皿的固体植物生长培养基中，并在黑暗中培养4周。在该时期后，将一些(plug)得自活跃生长的痂囊腔菌属菌落的菌丝体置于培养皿中央，在标准条件下培养。观察到真菌快速生长，并感染对照培养物。相反，在含对痂囊腔菌属培养物滤液具有抗性的葡萄细胞培养物的培养皿上，真菌的生长受到抑制。在含这些抗性培养物的培养皿中，菌丝不能通过该培养基自由生长，而在含对照(即非抗性)培养物的培养皿中，真菌菌丝通过该培养基生长。在含对照培养物的培养皿中所见的厚厚的菌丝体丛在含痂囊腔菌抗性培养物的培养皿中从未形成。抗性培养物抑制痂囊腔菌生长的这种能力在选择后保持9个月，证明抗性培养物中的遗传改变是稳定的。
另外，测试抗痂囊腔菌的葡萄藤培养物对第二种真菌病原体尖镰孢(Fusarium axysporum)的抗性。将抗性系以及对照系以6点钟和12点钟的位置置于培养皿中的固体植物生长培养基中，在黑暗下培养4周。在该时期后，将活跃生长的尖镰孢菌落置于培养皿中央，并于室温、16小时光周期下培养。观察到真菌快速生长并感染对照培养物。相反，在含对痂囊腔菌培养物滤液具有抗性的葡萄细胞培养物的培养皿上，尖镰孢的生长受到抑制。在含这些抗性培养物的培养皿中，菌丝不能通过该培养基自由生长，而在含对照(即非抗性)培养物的培养皿中真菌菌丝通过该培养基生长。在含对照培养物的培养皿中所见的厚厚的镰孢属菌丝体丛，在含痂囊腔菌抗性培养物的培养皿中从未形成。该实验证明，抗性葡萄藤培养物不仅抗痂囊腔菌，而且抗尖镰孢。
做进一步的分析，以确定抗真菌葡萄藤培养物是否能够产生也抗痂囊腔菌的体细胞胚。让得自抗性培养物和对照(即非抗性)对照的体细胞胚或者在含40％(v/v)真菌培养物滤液的培养基中生长，或者在不含真菌培养物滤液的对照培养基中生长。得自对照培养物的体细胞胚在含真菌培养物滤液的培养基中坏死并最终死亡，但在对培养基中不死亡，而得自抗性培养物的体细胞胚在含真菌培养物滤液的培养基和对照培养基中形成并正常萌发。在含真菌培养物滤液的培养基中对照的坏死快得足以使对照体细胞胚在培养起始后72小时内变暗。这些实验的结果证明，得自抗性细胞培养物的体细胞胚也抗所述真菌滤液。此外，观察到这些抗性体细胞胚经受住的痂囊腔菌培养物滤液的浓度等于其先祖抗性胚胎发生细胞和胚胎发生细胞团经受住的浓度。
抗病性植株体外选择抗痂囊腔菌产生的真菌培养物滤液的胚胎发生培养物。由这些选定的培养物再生植株，并使其适应温室的环境。向得自选择系的植株和得自未选择对照的植株喷散孢子悬浮液(1×106孢子/ml)直至溢流。给植株单独套袋，以维持湿度(条件最适于病原体引起炭疽病)3天。然后去除袋子，记录植株的炭疽病症状。所有未选择的对照均表现出非常高度的敏感性，在大多数情况下，由于该病害在3天内落叶。在得自两个选择系的40株不同的植株中，仅一株表现出轻度炭疽病。这些数据表明，在体外选择期间胚胎发生细胞获得的抗性可以转变为整株植株对该病原体的抗性。
可以按照标准方法测试再生植株对炭疽病的抗性。例如，通过将得自痂囊腔菌新鲜菌落的孢子团悬浮于无菌去离子(DI)水中，制备所述真菌的孢子悬浮液，并用血细胞计数器将孢子密度调至100,000孢子/ml。收集温室生长苗或植株的幼叶，并用DI水轻轻洗涤。在叶片上，将100μl所述孢子悬液以点置于叶片上，以促进真菌的接种，在所述孢子悬液点中心制造一个锋利的刺孔。每片叶中至少制造两个这样的孢子悬液点。叶片在潮湿的条件(即对于症状的发生为理想的条件)下培养至少72小时，然后如前所述(Subramanian，J.，Ph.D.Dissertation，University of Florida，Gainesville，1995，见上文)观察侵蚀斑的发生。单独用DI水的相似试验用作对照。另外，对已知对炭疽病敏感或具抗性的栽培品种的叶片进行接种，这些叶片的侵蚀斑用作评估得自体外选择的胚胎发生细胞的再生植株的敏感性/抗性的标准。根据这些数据的统计学分析，确定对痂囊腔菌和炭疽病的抗性水平。相对于对照植株对痂囊腔菌和炭疽病或这两者的抗性水平提高的葡萄植株，被认为可用于本发明。葡萄藤转化本文所述方法可以用来产生转化植株。可以在制备体细胞胚衍生物的方法中的任何步骤转化细胞。因此，适用于转化的组织或细胞包括外植的组织、胚胎发生细胞、胚胎发生细胞团和体细胞胚(包括成熟体细胞胚)。
按照本发明方法产生的细胞培养物可以用包含所需转基因的DNA转化。例如这种细胞可以用赋予对病原体、病害或害虫或其任何组合抗性的基因转化。例如，编码对许多害虫有毒的蛋白质的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thurigiensis)基因是众所周知的，并可用于本发明方法中。可利用几种标准方法将转基因引入植物宿主中，由此产生转基因植株。
构建植株表达载体时，可利用几种标准方法将该载体引入植物宿主中，由此产生转基因植株。这些方法包括(1)土壤杆菌介导的转化(根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)或发根土壤杆菌(A.rhizogenes))(参见例如Lichtenstein和Fuller，Genetic Engineering，第6卷，PWJ Rigby编辑，伦敦，Academic Press，1987；和Lichtenstein，C.P.和Draper，J.，DNACloning，第II卷，D.M.Glover编辑，Oxford，IRI Press，1985))；(2)粒子传递系统(参见例如Gordon-Kamm等，Plant Cell 2603(1990)；或BioRad Technical Bulletin 1687，见上文)；(3)微注射方案(参见例如Green等，见上文)；(4)聚乙二醇(PEG)方法(参见例如Draper等，PlantCell Physiol.23451，1982；或例如Zhang和Wu，Theor.Appl.Genet.76835，1988)；(5)脂质体介导的DNA摄入(参见例如Freeman等，PlantCell Physiol.251353，1984)；(6)电穿孔方案(参见例如Gelvin等，见上文；Dekeyser等，见上文；Fromm等，Nature 319791，1986；Sheen PlantCell 21027，1990；或Jang和Sheen Plant Cell 61665，1994)；和(7)涡旋混合方法(参见例如Kindle见上文)。转化方法对于本发明不是关键性的。提供有效转化的任何方法均可以使用。由于可利用更新的方法转化作物或其它宿主细胞，可以直接应用这些方法。
以下是概述一个特定技术即土壤杆菌介导的植物转化的一个实施例。用该技术，可以以两个阶段实施操作待转移入植物细胞基因组中的基因的一般方法。首先，在大肠杆菌中进行克隆和DNA修饰，通过接合或电穿孔，将含有目的基因构成物的质粒转移入土壤杆菌中。第二步，将所得土壤杆菌菌株用来转化植物细胞。因此，对于一般性植物表达载体而言，该质粒含有一个使其能够在土壤杆菌中复制的复制起点和在大肠杆菌中有功能的高拷贝数复制起点。这使得容易产生并测试大肠杆菌中的转基因，然后将其转移至土壤杆菌，以随后引入植物中。抗性基因可以位于该载体上，一个抗性基因用于在细菌中进行选择(例如链霉素)，而另一个抗性在植物中起作用，例如为编码卡那霉素抗性或除草剂抗性的基因。在该载体上也存在用以加入一个或多个转基因的限制性内切核酸酶位点和定向T-DNA边界序列，所述边界序列当被土壤杆菌转移功能识别时，限定将转移至该植物的DNA区。
在另一实施例中，可以通过射入克隆DNA沉淀于其上的细胞钨微弹，转化植物细胞。在用于发射的生物发射仪(Biolistic Apparatus(Bio-Rad)中，弹射筒(gunpowder charge)(22口径Power Piston ToolCharge)或气动冲击波驱动塑料宏弹(macroprojectile)通过枪管。将一等份已经沉淀有DNA的钨粒子悬浮液置于所述塑料宏弹前部。将后者发射到丙烯酸终止板(stopping plate)上，该板上有一通过该板的孔，该孔太小，使得宏弹不能通过。结果，塑料宏弹碰撞终止板，钨微弹通过该板中孔继续飞向其靶。对于本发明，所述靶可以是任何植物细胞、组织、种子或胚胎。在微弹上引入该细胞的DNA整合入或者细胞核中或者整合入叶绿体中。
一般而言，将转基因转移入植物细胞中并在其中表达，现在对本领域技术人员而言已是常规实践，并已经成为实施植物基因表达研究并产生具有农业或工业价值改良的植物变种的主要工具。
其它实施方案在本说明书中提及的所有出版物均通过引用结合到本文中，其程度与单独的出版物具体而单独指明通过引用结合到本文中一样。
尽管已经结合具体实施方案描述了本发明，但应该理解，能够进行进一步的修改。本申请计划包括一般按照本发明原理进行的任何改变、用途或修改，包括根据本说明书在领域内已知或常规实践范围内所作的、本发明涉及的并可以应用于上文所述基本特征且属于所附权利要求书范围内的这种改变。
权利要求
1.产生成熟体细胞胚的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供包含胚胎发生细胞的液体培养物；(b)从所述培养物回收所述胚胎发生细胞；(c)将所述胚胎发生细胞转移至第二培养物；和(d)由所述胚胎发生细胞生长出成熟体细胞胚。
2.权利要求1的方法，其中所述胚胎发生细胞得自花药、子房、胚珠、花组织、营养组织、蔓、叶、根、珠心组织、茎、种子、原生质体、中柱鞘、顶端分生组织、胚胎发生组织、体细胞胚或合子胚。
3.权利要求1的方法，其中所述第二培养物包含含有植物生长调节物的培养基。
4.权利要求3的方法，其中所述植物生长调节物为生长素、NOA、麦草畏、毒莠定、NAA、IAA、2，4-D、细胞分裂素、苄基腺嘌呤、玉米素、噻二唑素、脱落酸或赤霉酸。
5.权利要求1的方法，其中所述胚胎发生细胞用DNA转化。
6.权利要求1的方法，还包括(e)将所述成熟体细胞胚转移至萌发培养基，以生长出葡萄小植株。
7.产生葡萄体细胞胚的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供包含胚胎发生细胞的液体培养物；(b)从所述培养物中选择所述胚胎发生细胞；(c)将所述胚胎发生细胞转移至第二培养物；和(d)由所述胚胎发生细胞生长出葡萄体细胞胚。
8.产生葡萄体细胞胚的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供一种液体培养物，所述液体培养物包含胚胎发生细胞以及包含B-5主要盐和MS次要盐的培养基；(b)从所述培养物中回收所述胚胎发生细胞；(c)将所述胚胎发生细胞转移至第二培养物；和(d)由所述胚胎发生细胞生长出葡萄体细胞胚。
9.权利要求1的方法，其中所述回收的葡萄体细胞胚用DNA转化。
10.权利要求1的方法，其中所述液体培养物包含B-5主要盐和MS次要盐。
11.权利要求1的方法，其中所述第二培养物为液体培养物。
12.权利要求1的方法，其中从所述培养物中回收所述胚胎发生细胞包括过滤、沉降或选择。
13.权利要求1的方法，其中筛分所述第一培养物，以使分化的葡萄体细胞胚的形成同步化。
14.权利要求1的方法，其中所述第二培养物包含固体培养基。
15.按照权利要求1的方法产生的葡萄成熟体细胞胚。
16.由权利要求15的葡萄成熟体细胞胚萌发的小植株。
17.权利要求1的方法，其中步骤(a)的所述胚胎发生细胞得自选自以下的来源按照权利要求1的步骤(a)和(b)产生的胚胎发生细胞；按照权利要求1的步骤(a)-(d)产生的葡萄体细胞胚；按照权利要求1的方法产生的成熟体细胞胚；按照权利要求1的方法产生的小植株；和从按照权利要求1的方法产生的成熟体细胞胚产生的植株得到的花药、子房、胚珠、花组织、营养组织、蔓、叶、根、珠心组织、茎、种子、原生质体、中柱鞘、顶端分生组织、胚胎发生组织、体细胞胚或合子胚。
18.长期贮存葡萄成熟体细胞胚的方法，所述方法包括将所述胚胎干燥并将所述胚胎贮存于低于8℃的温度。
19.权利要求18的方法，其中所述成熟体细胞胚通过权利要求1的方法产生。
20.直接播种葡萄体细胞胚的方法，包括将所述葡萄体细胞胚置于包含沙和盆栽混合物的盆栽培养基中。
21.选择对植物病原体具有抗性的葡萄体细胞胚的方法，所述方法包括以下步骤(a)在第一液体培养基中培养葡萄体细胞胚，以产生细胞悬浮培养物，所述第一液体培养基包含一种植物生长调节物和植物病原体培养物的滤液；(b)从所述细胞悬浮培养物回收葡萄细胞或葡萄细胞簇；(c)在第二液体培养基中培养所述葡萄细胞或葡萄细胞簇，以产生葡萄体细胞胚；和(d)回收对所述植物病原体具有抗性的葡萄体细胞胚。
22.权利要求21的方法，还包括将所述葡萄体细胞胚转移至萌发培养基，以生长出葡萄小植株。
23.权利要求21的方法，其中所述滤液得自病毒、线虫、昆虫、真菌或细菌。
24.权利要求23的方法，其中所述真菌为痂囊腔菌。
25.权利要求21的方法，其中步骤(a)的所述植物生长调节物为生长素。
26.权利要求25的方法，其中所述第二液体培养基包含一种植物生长调节物。
27.产生对植物病原体具有抗性的葡萄植株的方法，所述方法包括以下步骤(a)在第一液体培养基中培养葡萄体细胞胚，以生长出细胞悬浮培养物，所述第一液体培养基包含一种植物生长调节物和植物病原体培养物的滤液；(b)从所述细胞悬浮培养物回收葡萄细胞或葡萄细胞簇；(c)在第二液体培养中培养所述葡萄细胞或葡萄细胞簇，以产生葡萄体细胞胚；(d)回收对所述植物病原体具有抗性的葡萄体细胞胚；和(e)由所述葡萄体细胞胚生长出植株。
全文摘要
本发明特征性描述了由胚胎发生细胞或胚胎发生培养物产生植株或成熟体细胞胚的方法。所述方法包括以下步骤:(a)提供包含胚胎发生细胞的液体培养物;(b)从所述培养物回收胚胎发生细胞;(c)将所述胚胎发生细胞转移至第二培养物;和(d)由所述胚胎发生细胞生长出葡萄成熟体细胞胚。
文档编号A01H4/00GK1273506SQ9980110
公开日2000年11月15日 申请日期1999年5月12日 优先权日1998年5月15日
发明者D·J·格雷, J·苏布拉马尼安, R·E·利茨 申请人:佛罗里达大学