一种甘蓝子叶培养高频分化体系建立方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种甘蓝子叶培养高频分化体系建立方法。
【背景技术】
[0002]甘蓝、Brassica oleracea L.)又称结球甘蓝、包心菜、洋白菜、圆白菜、茴子白、椰菜等，是十字花科芸薹属甘蓝种形成叶球的一个变种，二年生草本植物。甘蓝具有重要营养价值和医用作用，其中甘蓝的维生素C含量在蔬菜
中位居前列。结球甘蓝味甘，性平，归脾，胃经；能医脾和胃，缓急止痛；能防治胃、十二指肠溃疡病；能增强人体内苯并芘与甲基蒽对致癌物质的抵抗力。甘蓝类蔬菜在世界各地普遍种植，尤其在欧美栽培较多。由于其具有适应性广、耐寒和耐热性较强、病害少、产量高、营养丰富、耐贮运等特点，在我国各地普遍种植。
[0003]植物组织培养技术是获得整齐一致材料的快捷途径，目前国内外对甘蓝离体培养的研宄己经有了一定的基础，但至今未能应用于生产实践。本发明以甘蓝种子为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织诱导、丛生芽诱导、增殖、生根诱导等过程建立了甘蓝子叶培养高频分化体系，为甘蓝的工厂化生产和推广应用提供了技术支持。
【发明内容】
[0004]本发明以甘蓝种子为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织诱导、丛生芽诱导、增殖、生根诱导等过程建立了甘蓝子叶培养高频分化体系，从而实现了本发明的目的。
[0005]本发明的一种甘蓝子叶培养高频分化体系建立方法，包括以下的步骤:
(I)无菌苗的制取:选择甘蓝种子先用洗衣粉水浸泡10?30min，再用自来水漂洗干净，然后置于超净台上，用75%酒精消毒30?60s,再用0.1 %升未溶液消毒10?30min，无菌水冲洗4?6遍后消毒滤纸吸干水分后置于MS培养基中，放入培养箱中进行发芽培养，温度为25°C，3天统计污染率，7天统计发芽率和污染率。
[0006](2)愈伤组织诱导:将步骤(I)培养获得的5?7天苗龄的无菌苗，切取带I?2mm子叶柄的子叶接种于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养。接种后先黑暗条件下培养，待出现愈伤组织后再移至置于每天光照12?14小时，光照强度为1000?20001χ，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计诱导率。
[0007](3)丛生芽诱导:将步骤(2)诱导得到的愈伤组织转接至芽诱导培养基中进行诱导分化培养。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为2000?30001χ，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计分化情况。
[0008](4)增殖培养:将步骤(3)诱导培养得到的丛生芽从基部切下并转接到增殖培养基中进行继代。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为2000?30001χ，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计增殖情况。
[0009](5)生根培养:将经步骤(4)分化培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为2000?30001χ，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计生根情况。
[0010](6)炼苗移栽:试管苗生根20天后，具备发达健壮的根时将组培苗不揭瓶盖在自然光下炼苗7天。移栽时用镊子从瓶中取出组培苗，小心洗净基部残留的培养基，选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水，遮荫处理。移栽后经常喷水，保持空气湿度。植株成活后转入正常土壤中定植。
[0011]上述步骤(2)所述的诱导培养基为:MS+3.0?6.0mg/L 6-BA+ 0.1?1.0mg/LNAA+25 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0012]上述步骤(3 )所述的芽诱导培养基为:MS+1.0?3.0mg/L6_BA+0.1?0.3mg/LNAA+25 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
上述步骤(4)所述的增殖培养基为:MS+0.1?0.5mg/LNAA+3.0?6.0mg/L6-BA+20?30g/L 鹿糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
上述步骤(5)所述的生根培养基为:1/2MS+1.0?3.0mg/LIBA+20?30g/L蔗糖+3.5?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0013]本发明的优点是:本发明以甘蓝种子为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织诱导、丛生芽诱导、增殖、生根诱导等过程建立了甘蓝子叶培养高频分化体系，从而实现了本发明的目的。
【具体实施方式】
[0014]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0015]实施例1
(I)无菌苗的制取:选择甘蓝种子先用洗衣粉水浸泡lOmin，再用自来水漂洗干净，然后置于超净台上，用75%酒精消毒30s，再用0.1 %升汞溶液消毒15min，无菌水冲洗4遍后消毒滤纸吸干水分后置于MS培养基中，放入培养箱中进行发芽培养，温度为25°C，3天污染率低至5%，7天发芽率达到100%。
[0016](2)愈伤组织诱导:将步骤(I)培养获得的5?7天苗龄的无菌苗，切取带I?2mm子叶柄的子叶接种于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养。接种后先黑暗条件下培养，待出现愈伤组织后再移至置于每天光照13小时，光照强度为ΙΟΟΟΙχ，置于培养温度为250C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后诱导率达至84.8%。所述的诱导培养基为:MS+3.5mg/L 6-BA+ 0.6mg/L NAA+28g/L 蔗糖 +3.8g/L 琼脂，pH 为 5.6。
[0017](3)丛生芽诱导:将步骤(2)诱导得到的愈伤组织转接至芽诱导培养基中进行诱导分化培养。接种后置于每天光照13小时，光照强度为25001χ，置于培养温度为25°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后分化率达到96.4%。所述的芽诱导培养基为:MS+1.8mg/L6-BA+0.lmg/LNAA+28g/L 蔗糖 +5.5g/L 琼脂，pH 为 5.6。
(4)增殖培养:将步骤(3)诱导培养得到的丛生芽从基部切下并转接到增殖培养基中进行继代。接种后置于每天光照12小时，光照强度为20001χ，置于培养温度为25°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后增殖系数为7.9。所述的增殖培养基为:MS+0.2mg/LNAA+3.5mg/L6-BA+25g/L 蔗糖 +3.8g/L 琼脂，pH 为 5.6。
[0018](5)生根培养:将经步骤(4)分化培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根。接种后置于每天光照12小时，光照强度为25001x，置于培养温度为25°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后生根率达95%以上。所述的生根培养基为:1/2MS+1.5mg/LIBA+25g/L 蔗糖 +3.5g/L 琼脂，pH 为 5.6。
[0019](6)炼苗移栽:试管苗生根20天后，具备发达健壮的根时将组培苗不揭瓶盖在自然光下炼苗7天。移栽时用镊子从