小黄鱼精子冷冻保存液及小黄鱼精子冷冻保存方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及小黄鱼精子冷冻保存液及小黄鱼精子冷冻保存方法。
【背景技术】
[0002]小黄鱼(Larimichthys polyactis)是我国重要经济鱼类，在我国沿海均有分布，由于地理隔离已经形成了包括山东青岛、江苏启东、浙江舟山和福建宁德等几个地理种群。小黄鱼生性敏感，极易受惊，远距离运输死亡率极高，难易运用常规方法使不同地理种群进行自然交配达到杂交育种的目的。而鱼类精子超低温冻存则是解决这一难题的有效途径:将某一地理群体的雄性小黄鱼精液进行冷冻保存，然后再与另一种群雌性小黄鱼进行人工授精，即可达到杂交育种的目的。
[0003]小黄鱼精子冷冻保存技术还在鱼类种质资源保护、远缘杂交和鱼类的雌核发育、雄核发育等方面具有应用参考价值。
[0004]不同鱼类的精子对外界环境的敏感性不同，其冷冻方式和复温方法均会大幅影响精子的活力。目前鱼类多采用离心管和麦细管进行冷冻保存，但在降温和复温的过程中，管中心位置的温度变化与管壁并不同步，会降低精子复活后的活力，从而导致受精率和孵化率的下降。
【发明内容】
[0005]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供小黄鱼精子冷冻保存液及小黄鱼精子冷冻保存方法的技术方案。
[0006]所述的一种小黄鱼精子冷冻保存液，其特征在于由保存液和抗冻剂组成，所述的保存液由氯化钠6?10g，氯化钾0.2?0.6g，氯化钙0.3?0.7g，柠檬酸钠0.1?0.4g，用灭菌后的超纯水溶解，然后定容至1000ML得到；所述的抗冻剂包括甘油和乙二醇；所述的保存液:甘油:乙二醇的体积比为85?95:6?10:1?5。
[0007]所述的一种小黄鱼精子冷冻保存液，其特征在于所述的保存液由氯化钠7?9g，氯化钾0.3?0.5g，氯化钙0.4?0.6g，柠檬酸钠0.2?0.3g，用灭菌后的超纯水溶解，然后定容至1000ML得到。
[0008]所述的一种小黄鱼精子冷冻保存液，其特征在于所述的保存液:甘油:乙二醇的体积比为88?92:7?9:2?4。
[0009]利用一种小黄鱼精子冷冻保存液进行小黄鱼精子的冷冻保存方法，其特征在于包括以下步骤:
(1)挑选性腺发育良好的雄性小黄鱼，用纯水冲洗其生殖孔后擦干，轻压其腹部，用一次性吸管收集精液；
(2)将收集的小黄鱼精液用小黄鱼精子冷冻保存液按1:4的比例稀释，制成混合液；
(3)准备一块长10cm，宽5cm的医用纱布； (4)将其置于高压灭菌锅内灭菌30min；
(5)将5ml的混合液均匀喷在医用纱布上，纱布应双面喷洒；
(6)将纱布置于0°C环境下，保持伸展状态，稳定1min；
(7)将纱布置于-80°C冰箱内，保持伸展状态，稳定8min；
(8)将纱布直接投入液氮罐内，应置于液面以下-196°C冷冻保存，得到小黄鱼冷冻精液。
[0010]所述的冷冻保存方法，其特征在于所述的小黄鱼冷冻精液的使用步骤如下；设定供箱温度为43 C，待供箱温度稳定后，将液氣冷冻后的纱布置于一 1000ML烧杯中，放入43°C烘箱3min 1s后取出即可。
[0011]本发明以纱布为平面，无论是降温，还是复温，精液的温度变化都很均匀，保证了精子活力的一致性。采用本发明的冷冻保存液及方法进行冷冻保存的精子复活后能够保持鲜精活力，利用复活的精子进行受精后，受精率达到85%以上，孵化率达到79%以上。
【具体实施方式】
[0012]为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
[0013]实施例1:一种小黄鱼精子冷冻保存液的制备
该冷冻保存液由小黄鱼精子保存液和抗冻剂组成，其中小黄鱼精子保存液的配制方法为:氯化钠Sg，氯化钾0.4g，氯化钙0.5g，柠檬酸钠0.2g，用灭菌后的超纯水溶解，然后定容至1000ML ;抗冻剂为甘油和乙二醇；将小黄鱼精子保存液、甘油和乙二醇按体积比90:8:2的比例混合，即得到小黄鱼精子冷冻保存液。
[0014]实施例2:—种小黄鱼精子冷冻保存液的制备
该冷冻保存液由小黄鱼精子保存液和抗冻剂组成，其中小黄鱼精子保存液的配制方法为:氯化钠6g，氯化钾0.2g，氯化钙0.3g，柠檬酸钠0.lg，用灭菌后的超纯水溶解，然后定容至1000ML ;抗冻剂为甘油和乙二醇；将小黄鱼精子保存液、甘油和乙二醇按体积比85:10:5的比例混合，即得到小黄鱼精子冷冻保存液。
[0015]实施例3:—种小黄鱼精子冷冻保存液的制备
该冷冻保存液由小黄鱼精子保存液和抗冻剂组成，其中小黄鱼精子保存液的配制方法为:氯化钠10g，氯化钾0.6g，氯化钙0.7g，柠檬酸钠0.4g，用灭菌后的超纯水溶解，然后定容至1000ML ;抗冻剂为甘油和乙二醇；将小黄鱼精子保存液、甘油和乙二醇按体积比92:7:I的比例混合，即得到小黄鱼精子冷冻保存液。
[0016]实施例4:小黄鱼精子的冷冻保存方法
(1)挑选性腺发育良好的雄性小黄鱼，用纯水冲洗其生殖孔后擦干，轻压其腹部，用一次性吸管收集精液；
(2)将收集的小黄鱼精液用实施例1制得的小黄鱼精子冷冻保存液按1:4的比例稀释，制成混合液；
(3)准备一块长10cm，宽5cm的医用纱布；
(4)将其置于高压灭菌锅内灭菌30min； (5)将5ml的混合液均匀喷在医用纱布上，纱布应双面喷洒；
(6)将纱布置于0°C环境下，保持伸展状态，稳定1min；
(7)将纱布置于-80°C冰箱内，保持伸展状态，稳定8min；
(8)将纱布直接投入液氮罐内，应置于液面以下_196°C，48h后取出进行复活实验；
(9)小黄鱼冷冻精液的复活:设定烘箱温度为43°C，待烘箱温度稳定后，将该实施例得到的液氮冷冻后的纱布置于一 1000ML烧杯中，放入43°C烘箱3min 1s后取出，即可；
(10)挑选性腺发育良好的雌性小黄鱼，用纯水冲洗其生殖孔后擦干，轻压其腹部，采集卵子；
(11)取100ML新鲜卵子置于放有解冻后纱布的烧杯中；
(12)向烧杯中加入500ML20°C新鲜海水，期间不停搅拌，使纱布与卵子充分接触；
(13)30s后取出纱布，拧干；
(14)向烧杯中加水至800ML；
(15)Ih后统计其受精率为8