这支持了以人（Vh-D-Jh)为条件的 转基因座与内源性IgH基因座活性相似的看法 ' 突变的人Igy和IgK L-链序列的数量 是约30%，因此相当大地低于IgG H-链。原因是来自全部产生细胞而非来自IgG+或分化 的浆细胞的L-链的总扩增。
[0168] 血清中的Ig水平
[0169] 为了获得关于抗体产生的明确信息，我们比较了来自OmniRat和正常wt动物的血 清Ig的质量和数量。在还原条件下，在SDS-PAGE上分离的IgM和IgG的纯化（图4)表明， 预期的尺寸，对于μ是-约75kDa，对于γΗ-链是约55kDa，并且对于L-链是约25kDa-这 在OmniRat和wt动物之间看起来不能区别。针对两个、几个OmniRat和wt动物，测定从血 清获得的Ig，对于IgM为100-300 μ g/ml，而对于IgG为l-3mg/ml。但是，因为在蛋白A或 G上的大鼠 IgG纯化被视为次优的因此大鼠 Ig水平可能表现偏低。考虑到这些年轻的 (约3月龄）大鼠在无病原体的设施中饲养并且尚未受到免疫，这与对在开放设施中饲养的 大鼠报道的〇· 5-lmg/ml的IgM水平和几 mg/ml的IgG水平比较吻合有意思的是，如 在单克隆中所证实的I我们能够使大鼠 IgG同种型在SDS-PAGE上的类型特异性迀移率可 见。在IgG分离中（图4b)，在wt而非OmniRat Ig中，可见到显著更低的γΗ-链带。已将 此带归因于γ 2a H-链，其在OmniRat(HCH)转基因座中不存在。因为IgG水平在OmniRat 和wt动物之间是相似的，我们假定类型转换相似地有效。在OmniRat中缺乏C γ 2a的原因 没有限制性，可能是转基因基因座的若干拷贝有利地提高转换产物的水平。通过用抗L-链 捕获来纯化人Ig κ和Ig λ也是成功的（图4c和4d)并且预测H-和L-链带具有预期的 尺寸。通过ELISA还获得了 IgM/G效价的确认，所述ELISA测定wt和OmniRat同种型分布 并鉴定IgGl和IgG2b的相似数量（未示出）。
[0170] 在固相滴定（solid phase titration)中人Ig L-链效价的直接比较（图4e和 4f)表明，在OmniRat中的水平比人血清中的水平低5-10倍。但是，这是预期的，因为与儿 童到青少年中的Ig水平相比，来自成熟成人的人对照血清有时可以包含超过10倍高的Ig 水平'这可能与在年轻大鼠中的人IgK和IgX效价相似。有意思的是，wt大鼠产生非常 少的内源性IgA而转基因大鼠可以有效表达两种类型的人L-链IgK和IgA。
[0171] 完全人抗原特异性IgG
[0172] 使用快速一次免疫方案并收集淋巴结，或者使用加强免疫和脾细胞，实施若干次 细胞融合（表2)。例如，在用人颗粒蛋白前体（PG) -次免疫并在22天后骨髓瘤融合之后， 获得相当大量的稳定的杂交瘤。在SD对照和OmniRat杂交瘤克隆中，分别在约3, 520和约 1，600个孔中观察到细胞生长。由生物传感器测量表征的抗颗粒蛋白前体特异性IgG是由 148个OmniRat克隆产生的。有限的稀释以排除混合的孔并重复亲和力测定，揭示OmniRat 克隆保留它们的抗原特异性。抗体从SD和OmniRat克隆结合和解离的速率的比较显示出 介于0. 3和74nM之间的相似亲和力（表4并且数据未示出）。用人生长激素受体（hGHR)、 与匙孔血蓝蛋白偶联的TAU受体（TAU/KLH)、鸡蛋溶菌酶（HEL)或卵白蛋白（OVA)进行单 次免疫，随后进行淋巴结融合，也产生出通常与wt相比具有相似数量的许多高亲和力人抗 体。
[0173] 此外，用人PG、hGHR、人⑶14和HEL的常规加强免疫产生具有人独特型的IgG的 高亲和力（pM范围）。OmniRat通常表现出抗原特异性血清IgG的预期4-至5-log的效价 增长，这与Wt大鼠相似并且一样显著（表4a)。虽然结果可能随着动物不同而变化，但是 从wt动物（SD及其他株）和OmniRat获得了相似数量的产生具有相似高亲和力的抗原特 异性抗体的杂交瘤。在表4b中呈现出产生个体IgG的淋巴结和脾细胞融合克隆的总结，示 出了它们的多样性人V h-D-Jh、人V κ -J κ或V λ -J γ的特征和亲和力。免疫和融合结果表 明，从用PG、⑶14、τ、HEL和OVA抗原免疫的OmniRat通常获得远低于InM的亲和力（通 过生物传感器分析测定）。总之，可以与从wt动物中一样容易地从OmniRat中产生抗原特 异性杂交瘤，其中即使在单次免疫后也产生具有亚纳摩尔的亲和力的多种mAb。
[0174] 表4a具有完全人独特型的多样性抗原特异性大鼠 IgG杂交瘤a
[0176] *细胞数为3_91107/融合
[0177] #经生物传感器分析确认的抗原特异性
[0178] @5个最高亲和力的范围
[0179] #8种mAb对于τ-多肽为特异的
[0180] 表 4b
[0181]
[0182] a用人颗粒蛋白前体（PG)、人生长激素受体（hGHR)、人⑶14、τ -多肽（TAU-KLH)、 鸡蛋溶菌酶（HEL)、卵白蛋白（OVA)或β -半乳糖苷酶（β -gal)对OmniRat (HC14/HU κ和 /或Hu λ /JK0JK0/KK0KK0)和对照SD大鼠进行免疫。#在单次或多次分别施用抗原后，融 合淋巴结（LN)或脾细胞（SP)。
[0183] 讨论
[0184] 人和大鼠基因组合以组装新型IgH基因座产生了具有人独特型的抗体的接近正 常的高效表达。此外，人Ig K和Ig λ基因座的整合揭示，容易地产生出具有完全人特异性 的嵌合Ig，并且大鼠 C-区与人L-链的缔合没有不利影响。使用大鼠 IgH基因座的部分的优 点在于，物种特异性C区和增强子控制元件保持它们的天然构型，其中基本上仅仅移植多 样化人V h D义区。此外，具有大鼠 Fc-区的抗体的表达使正常B细胞受体得以组装并且最 佳地激活引发高效免疫应答必要的下游信号传导途径。具体地，对抗原激发的免疫应答的 质量依赖于许多与信号传导相关的受体和调节剂组分的联合作用（参见biocarta. com/pathfiles/h_bcrpathway. asp)〇
[0185] 使用YAC和BAC并在二者之间相互交换的方法，在通过重叠同源性制备具有大区 的构建体时，具有速度和检查完整性的能力两方面的优点。几种建立者大鼠携带低转基因 座拷贝数；如通过C μ和Ca产物的qPCR(未示出）测定，在OmniRat中大鼠 C-基因 BAC可 能被完全整合在5个拷贝中。通过在许多种系中单一位置插入的FISH鉴定（参见表1d)， 证实了 BAC混合物的散布或多重整合是罕见的；实现了育种为纯合性的优点。人们对于广 泛重叠区是否可整合知之甚少，例如为了维持完全功能性，对DNA重排是必需的。之前，已 报道了重叠整合，但是针对小得多的区（〈lOOkb) 2422,并且我们的结果表明通过同源性或串 联的期望的整合是频发事件。这大大方便了转基因技术，因为不必费力地将大YAC整合到 干细胞中并随后从中衍生动物 mis。此外，同样通过DNA注射进行的ZFN技术容易地 产生Ig KO株，并且很可能是选择用于基因破坏和替代的未来技术。在OmniRat中沉默的 内源性Ig基因表达，含有人-大鼠 IgH和人IgL基因座，优点是没有干扰性或不期望的大 鼠 Ig可以产生混合的产物。有意思的是，在仍然产生wt Ig的OmniRat中免疫和杂交瘤生 成揭示尽管是不完全的Ig K0,但许多产物是完全人、人-大鼠 IgH和人IgL。在此，尽管有 大量的wt V基因，值得注意的是，引入的人基因容易地扩增，因此表明为有效表达竞争物。 这与所有的我们所整合的转基因的普遍良好的表达水平的观察一致，这有利于与内源性基 因座竞争。之前，因为在释放Wt Ig时发现人产物的少量表达所以在表达人抗体库的 小鼠中，Ig KO是必需的。
[0186] 因为株特异性顺式作用序列是高水平表达所需的，可能即使在Ig KO小鼠中完全 人Ig基因座的产生是次优的。在小鼠中，Ca下游的增强子区在类别转换重组中起到重 要作用M，并且该区中的元件可能促进超突变 M。这可能是为什么在即使携带大的完全人 基因座的小鼠中在高频率下免疫应答和多样性杂交瘤的生成可能困难的原因。因为在 OmniRat中，嵌合人-大鼠 IgH基因座促成接近wt的分化和表达水平，可得出结论，内源性 大鼠 C区和真正的C α 3'的约30kb增强子序列提供对表达和成熟人Vh基因的最佳基因座 控制。因为IgD的沉默或缺乏似乎不降低免疫功能 37因此已经将另一个区，具有 其3'控制基序簇2^的C δ，从嵌合C-区BAC中除去。通常，在抗原接触时，成熟IgM +IgD+B 细胞下调IgD，这引发类别转换重组21。因此，在没有IgD控制的情况下，转换可能升高，这 得到了我们的研宄结果的支持，即当将C δ区保留在转基因构建体中时，IgG转录体和血清 水平显著较低（数据未示出）。
[0187] 因为我们发现在各种免疫中在序列和表位中具有多样性的mAb，与在wt对照中产 生的那些相似，可以通过脾和淋巴结融合进行分离，在OmniRat中特异性IgG的产生特别令 人鼓舞。V-基因、D和J多样性正如预期，并且发现几乎所有的区段的使用如预测得富有 成效 ' 这与携带完全人转基因座的小鼠是鲜明的对照，其中从数个前体B细胞克隆扩增 产生少量的多样性M。因为移植的V-基因数量仅是在人中使用的大约一半，我们预期在将 OmniRat与wt动物比较时观察到限制的免疫应答和有限的多样性。然而，并非如此，并且在 超过1000个克隆（可以提供序列）中的⑶R3多样性的比较显示，在OmniRat中与在Wt动 物中有相同广泛的连接差异。通过在％至D和/或D至1连接处的N-序列增加或缺失和 还通过超突变，使数个相同基因-区段组合进一步多样化。因此，显然，在控制DNA重排和 人V hDJh的表达方面，大鼠 C区序列是高效的。与之前已经在小鼠中显示的相似Α23·22，对于 引入的人IgK和IgX基因座，也观察到广泛的多样性。因此，在从小鼠产生人抗体方面显 著降低的效率 z，已经在OmniRat中得到克服，其通过类别转换和超突变可靠且广泛地使重 排的H-链多样化，从而大量地而非偶然地得到高亲和力抗体。转基因 IgG的收率和超突变 的水平，令人难忘地是应用于抗原特异性mAb中，表明了克隆多样化和产生水平在OmniRat 与wt动物之间是相似的。通过不同的单次免疫甚至实现了在亚纳摩尔范围内的高亲和力 特异性的常规产生，并且与wt动物相比是有利的；在从完整人基因座中产生人抗体库的转 基因小鼠方面的结果尚未显示
[0188] 总之，为了最大化人抗体产生，对于抗体特异性使用人基因而为了控制分化和高 表达使用啮齿动物基因的IgH基因座应被视为是必需的。L-链柔韧性是额外的好处，因为 即使在存在wt Ig时，它也允许高效的人IgH/IgL组装。对于治疗应用，通过C-基因替代 而不损及特异性的情况下，可以将嵌合H-链容易地转变成完全人Ab。
[0189] 本文提及的所有专利和专利公布以引用的方式并入本文中。
[0190] 本领域技术人员在阅读以上说明时可想到某些修改和改进。应当理解，为了简洁 和可读性，所有此类修改和改进本文已被删除，但是合理地在以下权利要求书的范围内。
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