具有协同效应的线虫毒性组合物、具有协同效应的线虫毒性组合物的用图
【专利说明】具有协同效应的线虫毒性组合物、具有协同效应的线虫毒 性组合物的用途 发明领域
[0001] 本发明落入绿色化学的范围内，总体上涉及用于控制农业害虫的组合物，并且在 具有的实施方案中，涉及可用于防治线虫的组合物。
[0002] 现有技术的描述 在持续性的概念中，环境化学和/或绿色化学已经向引入替代污染技术的工艺和产 品的方向发展。已经证实，使用植物起源的原材料和/或与天然存在的那些相同的物质以 及将其引入生态上正确的工艺/产品为世界性的趋势，尤其是具有大的生物质利用度的国 家。
[0003] 在巴西，癭线虫（爪唾根结线虫Jaraflica))在密集农业区中为重 要作物例如咖啡豆、甘蔗、大豆、豆类、烟草、果树和蔬菜植物的危害最大的害虫之一。这些 植物病原体所导致的损伤包括形成导致土壤水分和营养吸收失衡的虫癭、使植物对任何环 境改变或对害虫和病原体攻击更为敏感。根结线虫（ifeJojObgKne 5Α?)属的线虫为强制在 多种植物上的固定内寄生虫。宿主包括超过3, 000个植物种类。每年与这些生物的作用 相关的损失达到US$ 1500亿，其中90%与南方根结线虫、爪唾 根结线虫0? /a raflica)、花生根结线虫0? 和北方根结线虫0? AajOJa)有关 (Abad，等，2008 ;Bakhetia等，2005)。在本文中，南方根结线虫作为对经济损失最具表现力 的物种而格外突出（Huang等，2006)。
[0004] 用于控制此植物寄生物的策略包括轮作、使用抗性变种、综合处理害虫以及主要 施用合成的农业防御物（Chitwood，2002)。在轮作方案中使用拮抗植物是一个备选方案， 但伴随生产力和农民利润降低（Dufour等，2003 ;Ferraz & Freitas，2000)。使用抗性变种 是一个值得推荐的控制害虫和疾病的方法，但抗性栽培品种的数目以及与此抗性相关的遗 传多样性有限（Dofour等，2003 ;Ferraz & Freitas，2000)。害虫的综合处理为一个期需策 略，但其需要严格计划、密集管理作物、较高的时间消耗，并且成本可能高于使用农业防御 物（Gentz，2010)。最广泛使用的控制策略在于合成杀线虫药的大量使用，这导致自然环境 和公众健康受到损害（Abad等，2008)。在此方面，利用天然线虫毒性植物化合物（Newman 等，2003)为控制该植物线虫的一个策略。
[0005] 植物代谢组学领域的显著进步，以及其与基因组学、转录组学、蛋白质组学和生物 信息学的整合提供了用于开拓和扩展生物系统的复杂相互作用的新的可能（Weckwerth， 2009 ;Shulaev，2008 ;Weckwerth，2008 ;Huang 等，2008 ;Roessner 等，2006 ;Roessner 等， 2001)。对获自拮抗植物种子的提取物的作用的研究证明了相当有效的杀线虫和抑线虫 (nematostatic)作用。这些作用与次级代谢产物例如生物碱、萜、单宁、类黄酮和糖苷的存 在有关（Chitood, 2002; Ferraz & Freitas, 2000)。
[0006] 因此，寻找具有广泛结构和生物多样性的新颖天然化学物质极其重要（Newman 等，2003 ;Kirkpatrick，2002)，其目的在于获得新型有效和环境安全的线虫毒性产品。在这 种情况下，植物成为超过100, 〇〇〇种天然小分子产品（称为植物化合物或代谢产物）的来 源（Clardy，2004 ;Dixon，2001)。在植物中，这些化合物可与细胞分化、生长调节、植物与其 它生物之间相互作用的测量以及尤其与植物保护有关（Dobson，2004)。
[0007] 在本文中，本发明提供一种对使用损害环境并且可损伤人类健康的线虫毒性化合 物的可行替代。此替代通过用于控制线虫并且可用在植物、植物的部分和土壤上的线虫毒 性组合物体现。相应的技术来自于使用直生刀豆（CaflaraJia eftsi/hrazis)植物的提取物 进行实验所获得的意外结果，其导致一种前所未有的包含提取物中天然存在的物质的特殊 组合的线虫毒性组合物。
[0008] 发明概述 本发明提供包含天然存在并且协同作用于植物线虫控制的物质的特殊组合的组合物。
[0009] 本发明协同线虫毒性组合物包含： 反式乌头酸， 葡萄糖，和任选地 S-羧甲基半胱氨酸 作为活性化合物。
[0010] 本发明组合物呈现的形式为溶液、乳液、可湿性粉末、悬液、粉末、粉剂、糊剂、可溶 性粉末、颗粒、悬液-乳液浓缩物、浸渍所述活性化合物的天然和合成材料以及在聚合物质 中微胶囊化。此外，本发明组合物可进一步包含制剂成分，其尤其包括液体载体/液体溶剂 和/或固体载体和/或表面活性剂和/或增稠剂和/或染料。
[0011] 本发明的第二个实施方案涉及将协同线虫毒性组合物用于控制植物线虫的用途。
[0012] 附图简述 图1 -拮抗植物种子的水性粗提物对南方根结线虫的（J2)的作用。条形柱代表暴露 48小时之后活线虫的百分比。生物测定中使用每种提取物I mg/终体积0.3 ml的浓度和 100只第二阶段幼虫，每种三个重复，蒸馏水作为阴性对照。
[0013] 图2 - 0· 5mg (0· 5mg/0. 3ml终体积）外部（DECE)和内部（DICE)透析液对南方 根结线虫的J2的作用。条形柱代表死亡线虫的百分比。对照用蒸馏水（dH20)、牛血清白蛋 白（BSA)和直生刀豆的水性粗提物（ECACe)进行。进行恢复测定以证明杀线虫作用。
[0014] 图3 -预热的（50°C )的直生刀豆的DE对南方根结线虫的J2的作用，证明了所 分析级分的热稳定性。该生物测定一式三份进行，条形柱代表死亡线虫的百分比。蒸馏水 用作阴性对照。进行恢复测定以证明杀线虫作用。
[0015] 图4 - 500 Pg/O. 3mL直生刀豆DE对自由生活的腐生线虫（FL/VL)和南方根结线 虫的J2的作用。条形柱代表死亡线虫的百分比。该生物测定的对照为分别浸渍在蒸馏水 中的线虫（VL)和南方根结线虫的J2。
[0016] 图5 -使用用溶解在PBS中的不同浓度的直生刀豆外部透析液孵育的牛血（A)或 纯化红细胞（B)的溶血活性试验。溶血活性的测量通过使用567 nm波长以分光光度法监 测。蒸馏水（100%溶血）和PBS用作阳性和阴性对照。
[0017] 图6 -直生刀豆外部透析液（DE)在温室模拟田地条件下对南方根结线虫的J2的 作用。条形柱表示处理后番茄植物根内存在的卵块数目。该实验一式五份进行，蒸馏水和 市售杀线虫药分别用作阴性和阳性对照。
[0018] 图7 -光学显微镜：(A)加入DE前的J2 - 200x。（B)加入DE前的J2的肠内区 域-400x。（C)加入DE后24小时的J2 - 200x。（D)加入DE后的J2的肠内区域- 400x〇
[0019] 图8 - (A)直生刀豆外部透析液（DE)的色谱（λ = 216 nm)，显示具有22个峰的 概况。（B)-生物测定，显示暴露48小时后抗南方根结线虫的J2的活性级分（1、3、6、17 和18)。（C)-恢复测定，证明了级分1、3和18的杀线虫作用以及级分6和17的抑线虫 作用。
[0020] 图9 - (A)-生物测定，显示暴露48小时后市售化合物对南方根结线虫的第二阶 段幼虫的作用。I-对照dH20, 2- DECE，3- 10%葡萄糖，4- 20%葡萄糖，5- D-松醇（80 ug)， 6- D-松醇（150 ug)，7- L-刀豆氨酸（80 ug)，8- L-刀豆氨酸（150 ug)，9-棕榈酸（80 ug)，10-棕榈酸（150 ug)，11-柠檬酸（80 ug)，12-柠檬酸（150 ug)，13-苹果酸（80 ug)，14-苹果酸（150 ug)，15-顺式乌头酸（80 ug)，16-顺式乌头酸（150 ug)，17-反式 乌头酸（80 ug)，18-反式乌头酸（150 ug)，19- 50 mM Tris/HCl pH 8, 20- 50 mM 乙酸 pH 5, 21-L-苯胺（80 ug)，22- L-苯胺（150 ug)，23- L-甲硫氨酸（80 ug)，24- L-甲硫氨酸 (150 ug)，25- L-色氨酸（80 ug)，26- L-色氨酸（150 ug)，27- S-羧甲基半胱氨酸（80 ug)，28- S-駿甲基半脫氨酸（150 ug)，29- Zantotoxine (80 ug)，30- Zantotoxine (150 ug)和31- 20%葡萄糖+L-刀豆氨酸（15 ug)。B-使用蒸馏水恢复测定后对不同市售化合 物的作用的评估。
[0021] 图10 - (A)-生物测定，显示暴露48小时之后市售化合物及其组合物对南方根结 线虫的第二阶段幼虫（J