一种金毛狗脊孢子组培繁育方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物栽培技术领域，具体而言，涉及一种金毛狗脊孢子组培繁育方法。
【背景技术】
[0002] 金毛狗脊（Cibotium barometz(L. ) J. Sm.)为蕨类蛛壳蕨科植物，主产于广西，在 广东、贵州、江西、东南亚一带也有分布，为国家Π 级保护植物。
[0003] 狗脊是金毛狗脊的干燥根茎，具有祛风湿、补肝肾、强腰膝等作用，历年版《中国药 典》均有收载。壮医、瑶医常将其用于治疗风湿痹痛、腰膝酸软、下肢无力等疾病；壮族、瑶族 人民常将其配以肉、骨类食品煲汤饮用、用根茎烹茶饮用，以嫩叶炒菜食用，滋补防病、享受 美味。其根茎外面生长的金黄色柔毛用于外伤止血。现代研究发现：金毛狗脊具有抗骨癌、 防治骨质疏松、止血、镇痛、抑菌、抗炎等功效，是国内多家著名制药企业用于生产壮腰健肾 丸、活血应痛丸、壮骨关节丸、金鸡虎补丸、金毛狗脊酒等近百个中成药的主要原料。
[0004] 由于加工企业对药材的需求量不断增加，导致民间疯狂采挖，野生资源日见稀少， 中国已明令禁止采挖野生资源，并加大了处罚力度，越南等国也严控金毛狗脊的出口，药材 供需矛盾十分突出。因此，开展金毛狗脊的人工种植，已成燃眉之急。
[0005] 在人工种植金毛狗脊的各个环节，最突出的矛盾是如何繁育出高性价比的种苗。 前人对金毛狗脊栽培方法进行了研究，使用根状茎切段繁殖种苗，获得了种苗繁育方法，但 要浪费大量药材，而且采集野生资源违法，育苗成本高，没有进行推广；有实验表明金毛狗 脊孢子在人工环境繁殖系数低；由此可见，当前传统技术手段连金毛狗脊的成功繁殖都难 以保证，遑论解决金毛狗脊种苗规模化繁育及成本控制问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种金毛狗脊孢子组培繁育方法，所述的培养方法可用于 金毛狗脊的快速繁育，解决了金毛狗脊无法规模化繁育的问题。
[0007] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0008] -种金毛狗脊孢子组培繁育方法，包括以下步骤：
[0009] 1)、采集金毛狗脊孢子叶上成熟的孢子囊并消毒；
[0010] 2)、将孢子囊接种到金毛狗脊萌发培养基中培养至孢子萌发；
[0011] 3)、将萌发出的组织转接到金毛狗脊增殖培养基中培养，诱导丛生原叶体的生 成；
[0012] 4)、将原叶体转接到新的金毛狗脊分化培养基中培养，诱导分化成幼孢子体；
[0013] 5)、将幼孢子体转接到金毛狗脊生根培养基中培养成孢子体。
[0014] 蕨类植物具有明显的世代交替，从单倍体的孢子开始，到配子体上产生出精子和 卵，这一阶段为单倍体的配子体世代（亦称有性世代），从受精卵开始，到孢子体上产生的 孢子囊中孢子母细胞在减数分裂之前，这一阶段为二倍体的孢子体世代（亦称无性世代）。 这两个世代有规律地交替完成其生活史。本申请所述的金毛狗脊孢子组培繁育方法就是适 应蕨类植物的这种世代交替的特性所设计的。
[0015] 其中，在步骤1)中，由于金毛狗脊的孢子粉非常细小，收集后无法进行消毒灭菌。 因此只能在孢子成熟、且孢子囊没有打开时连同孢子囊一起采集，进行消毒灭菌。消毒方法 为，用0. 1 %升汞溶液或5%次氯酸钠溶液进行消毒8~lOmin ;
[0016] 在步骤2)中，孢子囊接种到金毛狗脊萌发培养基中的目的是诱导萌芽。可用夹子 将孢子囊夹碎，使孢子粉散落在金毛狗脊萌发培养基中进行培养；或是将消毒灭菌好的孢 子囊放在超净工作台上，用无菌滤纸垫好，打开孢子囊，使孢子粉掉落到滤纸上，再将滤纸 上的孢子粉接种到金毛狗脊萌发培养基中进行培养；
[0017] 在步骤3)中，将从孢子囊中萌发出的组织转接到金毛狗脊增殖培养基中培养的 主要目的是将孢子培育为原叶体；
[0018] 步骤4)的目的是将原叶体诱导培养为幼孢子体；
[0019] 步骤5)是诱导幼孢子体进一步成长并生根，为其今后移栽做准备。
[0020] 以上步骤的操作均优选在超净工作台上进行。
[0021] 该组培繁育方法简单易行，便于操作，可用于金毛狗脊的快速繁育。本发明采用孢 子进行组培繁育，只需要采集金毛狗脊孢子叶上成熟的孢子囊即可进行繁育，对母体没有 伤害，不影响整个植株的生长。此外，本发明具有组培方法固有的培育出无病毒种苗的特 点，繁育出的金毛狗脊苗健壮，成活率高，获得的种苗生理年龄一致，生长整齐，适合工厂化 育苗管理和规模化栽培。
[0022] 如上所述的金毛狗脊孢子组培繁育方法，在步骤2)中，所述金毛狗脊萌发培养基 包括改良MS培养基、队培养基、Pragre培养基。
[0023] 优选的，所述金毛狗脊萌发培养基中还包括如下原料组份：
[0024] 6-BA 0 ~0· 3mg/L、NAA 0 ~0· 2mg/L。
[0025] 优选的，如上所述的金毛狗脊孢子组培繁育方法，在步骤3)~5)中，所述金毛狗 脊增殖培养基、金毛狗脊分化培养基及金毛狗脊生根培养基均为改良1/2MS培养基；如上 所述的三种培养基中还包括如下原料组份：6-BA 0~1. Omg/L、NAA 0~1. Omg/L。
[0026] 表1改良MS培养基母液配制示例（单位:mg)
[0027]
[0028] 在步骤2)中，优选的改良MS培养基的作用是诱导金毛狗脊孢子萌芽；在步骤 3)~5)中，培养基的作用是诱导萌芽的孢子形成丛生原叶体、诱导丛生原叶体分化成幼孢 子体、幼孢子体培养成可移栽的孢子体。此外，采用改良1/2MS培养基也可以有效降低后期 培养的成本。
[0029] 其中，MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点 是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和 比例合适，但是，高盐离子浓度反而不利于金毛狗脊原叶体分化成孢子体。因此，本申请对 其中大量元素中的KN(\S NH 4N03含量进行改良，其具体含量如表1所示。
[0030] 改良MS培养基的配制方法简述如下：
[0031] 取1000mL烧杯一只，先加入600mL的蒸馏水，再依次加入大量元素母液100mL，微 量元素母液10mL，铁盐母液10mL，妈盐母液100mL，有机物质母液20mL，鹿糖若干，待鹿糖充 分溶解后，加入琼脂粉及活性炭若干。
[0032] 把盛有培养基的烧杯放在电磁炉上加热，将琼脂完全融化（可在此时加入6-BA及 NAA，并调节pH)，最后定容到1000mL。定容后分装、包裹并高温灭菌；灭菌后培养基冷却，凝 固才能使用。
[0033] 其中，6-1^(6-1^112713111；[110口111'；[116)，即6-节氨基腺噪呤，属广谱性植物生长调节 剂，具有促进植物细胞生长与分裂，抑制植物叶绿素的降解，提高氨基酸的含量，延缓叶片 衰老等功能。
[0034] NAA(l_Naphthaleneacetic acid)，即萘乙酸，属广谱型植物生长调节剂，具有促 进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根等功能。
[0035] 优选的，所述改良MS培养基中将ΚΝ03调整为800~900mg/L，ΝΗ 4Ν03调整为700~ 800mg/L ；
[0036] 所述改良1/2MS培养基是通过将改良MS培养基的大量元素减半而其他组份的含 量不变而配制的培养基。具体参见上文中改良MS培养基的成分及配制方法进行调整。
[0037] 优选的，所述改良MS培养基和改良1/2MS培养基中包括如下原料组份：
[0038] 琼脂4~5g/L，鹿糖20~35g/L，活性炭0~0· 3g/L。
[0039] 琼脂是由海藻中提取的多糖体，具有凝固性，稳定性，能与一些物质形成络合物等 物理化学性质。在植物培养基中，主要起到凝固的作用。
[0040] 蔗糖在植物组织培养基中起到能源物质和渗透调节剂的作用。
[0041] 活性炭具有很强的吸附能力，可减少一些有害物质（如酚类物质与过氧化物酶） 的影响，从而有效地防止褐变；此外，活性炭对高压灭菌时培养基成分降解产生的抑制性物 质（如HMF)也有吸附作用；活性炭对高质量浓度的BA和NAA也产生吸附作用；活性炭使培 养基变黑，从而提供暗环境，促进培养基中光敏性生长素的积累，有利于植物生根。
[0042] 优选的，所述MS改良培养基和1/2MS改良培养基的pH均为5~6。
[0043] 在步骤2)中，所述培养的培养时间为20~35天；
[0044] 在步骤3)中，所述培养的培养时间为30~40天；
[0045] 在步骤4)中，所述培养的培养时间为20~30天；
[0046] 在步骤5)中，所述培养的培养时间为30~40天。
[0047] 优选的，在如上所述的金毛狗脊孢子组培繁育方法的步骤3)和步骤4)中，具体包 括：
[0048] 对培育出的原叶体进行增殖，增殖倍数为5~10倍；再将增殖好的原叶体转接到 金毛狗脊分化培养基中培养，诱导分化成幼孢子体。
[0049] 在自然条件下，金毛狗脊的繁殖方法通常用分根繁殖法，也可采用孢子繁殖法，但 是孢子繁殖要求条件高，很难分化出苗。而在无菌条件下，经过增殖培养形成丛生原叶体后 进行分化培养，分化率高，可以得到大规模的整齐瓶苗。
[0050] 优选的，在如上所述步骤2)~5)培养的过程中，培养条件为：
[0051] 光照强度1000~15001x、光照时间7~9小时/天、培养温度23~25°C，培养湿 度65~70%。
[0052] 金毛狗脊为蕨类植物，要防止光照过多过强，同时也不应该光照时间过短，否则植 株发黄，显得衰弱或萎蔫。
[0053] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0054] 1)、本发明提供了一种高效的金毛狗脊孢子组培繁育方法，工艺流程简单，以原叶 体形式进行增殖，可获得大量的原叶体，通过孢子萌发、原叶体增殖、孢子体诱导、孢子体生 根等过程，获得大量可用于生产栽培的种苗，且获得的种苗生理年龄一致，生长整齐，适合 工厂化育苗和规模化栽培。
[0055] 2)、本发明采用孢子进行组培繁育，只需要采集金毛狗脊孢子叶上成熟的孢子囊 即可进行繁育，对母体没有伤害，不影响整个植株的生长，外植体用量少，繁育成本低。
[0056] 3)、用本法繁育的金毛狗脊种苗，种苗无病毒或其他疾病感染，植株生长健壮，成 活率高。
[0057] 4)、金毛狗脊为国家二级保护蕨类植物，禁止采挖。用本法可繁育得到大量金毛狗 脊种苗，利于野生金毛狗脊的保