一种莲藕茎尖组织初代培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种莲藕茎尖组织初代培养方法，属于农业、生物技术领域。
【背景技术】
[0002]植物组织培养是指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。该技术在快速繁殖珍稀植物或高经济价值的植物、植物体脱病毒和植物种质资源的保存等方面有广泛的应用前景。
[0003]莲藕是无性繁殖植物，母体植株易产生地下茎，地下茎的节上能产生新的植株，繁殖出后代。这一繁殖方法，容易将母体的病害及生理障碍等传递给后代，并且会逐代积累，导致后代植株的产量和品质下降。利用莲藕茎尖组织进行人工培养繁殖后代，可以有效防止病源的传播，确保后代能保持优良种性。莲藕茎尖组织培养分初代培养、增殖培养，生根培养和驯化等4个步骤，其中茎尖组织初代培养是指将莲藕茎尖组织接种到特定的培养基上获得无病源植株的过程，是获得无病源植株的重要步骤，也是莲藕茎尖组织培养的关键技术。
[0004]目前莲藕茎尖初代培养中存在的问题是:接种后茎尖组织易发生褐变率高，新生叶的叶片不能展开，叶柄不能伸长，生长畸形，接种成活率低，变异率高，成苗率低。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种莲藕茎尖组织初代培养方法。该方法能使莲藕茎尖顶端分生组织的成苗率达到90%以上。
[0006]申请人经研究发现:莲藕茎尖组织初代培养过程可以分为外植体膨大和茎叶生长两个阶段。
[0007]现有的莲藕茎尖组织培养方法，采用的是固体培养基培养，接种后外植体易发生褐变死亡。经申请人研究和实验，发现不同类型的培养基及培养方式对外植体的褐变和膨大存在明显差异，研制出了莲藕外植体膨大培养基，采用该培养基进行液体震荡培养可以防止褐变的发生，使外植体的褐变率降低到5 %以内。
[0008]现有的莲藕茎尖组织培养方法，茎尖组织接种后发育异常，新生叶的叶片不能展开，叶柄不能伸长，生长畸形。申请人经过大量的研究和实验，发现培养基对莲藕茎叶展开有显著的影响，研制出了莲藕茎尖组织展叶培养基，外植体接种后在膨大培养基中培养30-40d后，转换到莲藕展叶培养基中培养，可以防止畸形发生，使膨大的外植体组织能正常生长发育Ο
[0009]基于上述研究，本发明通过采用适宜的培养基及培养的方法来防止外植体组织褐变；通过采用展叶培养基防止叶片畸形变异的发生，使其茎叶发育；其具体技术方案如下:
[0010]一种莲藕茎尖组织初代培养方法，包括如下步骤:
[0011]1.莲藕芽体的采集:采集时间为5-8月，选取地下茎的顶芽；
[0012]2.芽体的前处理:将顶芽留取顶部3-5cm，用84消毒液处理及流水清洗；
[0013]3.消毒与接种:消毒和接种均在超净工作台内进行，具体如下:
[0014]3.1 消毒:
[0015]3.1.1用75%的酒精消毒30秒；
[0016]3.1.2有效氯浓度为1%的次氯酸钠溶液，消毒30分钟；
[0017]3.1.3灭菌水清洗后，备用；
[0018]3.2 接种:
[0019]3.2.1外植体的摘取:在放大倍数为10-40x解剖镜下由外向内依次剥除生长点外围包裹的叶片，直到生长点暴露。
[0020]3.2.2用解剖针针尖挑取生长点上部组织，接种到莲藕膨大培养基中:培养基的组成是:1/2MS+NAA(0.1-0.3mg/L) +BA(0.2-0.5mg/L) + 蔗糖(3% )，pH 为 5.8-6.0 ;培养容器为直径为25_的试管，培养基用量为15-20ml。
[0021]4.茎尖组织膨大培养:接种好的试管放置在旋转震荡摇床上进行震荡培养，振速为2rmp，培养条件温度23-25°C，光强2000_30001χ，光照时间为16hr ;培养周期30_40d形成膨大的芽体；
[0022]5.展叶培养:
[0023]茎尖组织在膨大培养基培养30-40d后，将培养基更换成展叶培养基，培养基的组成是 MS+BA(0.1-0.3mg/L) +GA(0.2-0.5mg/L) + 蔗糖(5% )，pH 为 5.8-6.0 ;培养容器为300ml三角瓶，培养基用量100ml，培养条件温度23_25°C，光强2000-30001x，光照时间为16hr，培养周期40-50天。
[0024]步骤1)中，为了保证品种的纯度，芽体采集要在品种园中进行，采集长度为5-10cm,以确保匍匐茎的质量。
[0025]步骤2)中的前处理是用400倍84消毒液浸泡芽体10_15分钟，再用蒸馈水冲洗10-15分钟，前述400倍是指用水按400:1的体积比稀释84消毒液。
[0026]步骤2)中从头部剪取匍匐茎3-5cm的原因是便于消毒接种时操作方便；
[0027]步骤3)中用灭菌水清洗3-5次。
[0028]步骤3)中所述解剖镜的放大倍数为10-40X，以便于清晰观察生长点，方便取样。
[0029]步骤3)中，为保证外植体大小< 0.5mm，所述解剖针针粗度为Φ = 0.2-0.4mm，操作时以此为对比，针尖所取生长点组织不超过针的粗度。
[0030]步骤3)中，所述初代培养时培养容器为试管Φ = 2.5cm，每管培养基加入量为15_20mlο
[0031]本发明具有如下优点:
[0032]1、采用液体膨大培养基可以加快膨大速度，进行震荡培养可以防止褐变的产生，保证外植体成活达到90%以上。
[0033]2、采用的展叶培养基能使外植体组织形成的芽体能正常的展叶，防止变异的发生，保证了后代种性的纯度。
[0034]3、采用粗度Φ = 0.2-0.4mm的解剖针，取样时以此为对照，可以有效控制外植体的直径小于0.5_，保证了外植体是不带有病源，其繁殖出的后代完全无毒化。
【附图说明】
[0035]图1是本发明莲藕茎尖实物图。
[0036]图2是本发明茎尖组织膨大培养实物图。
[0037]图3是本发明芽体展叶培养实物图。
[0038]图4是本发明莲藕初代培养植株实物图。
【具体实施方式】
[0039]实施例
[0040]1、芽体的采集:分别选取莲藕品种为‘鄂莲4号’、‘美人红’、‘飘花’三种进行培育。为了保证品种的纯度芽体采集在品种园中进行，采集时间为5-8月，选取肥大的地下茎的顶芽，田间取样芽体长度为5-8cm。
[0041]2、芽体处理:将采集的芽体用自来冲洗15-20分钟后，用400倍84消毒液浸泡10-15分钟，再用蒸馏水冲洗10-15分钟。
[0042]3、消毒与接种:消毒和接种均在超净工作台内进行
[0043]3.1 消毒:
[0044]3.1.1将上述处理的芽体，从顶部开始剪取3_5cm。
[0045]3.1.2用75%的酒精消毒15-20秒；
[0046]3.1.3有效氯浓度为1 %的次氯酸钠溶液，消毒30分钟
[0047]3.1.4灭菌水清洗3-5次后备用。
[0048]3.2 接种:
[0049]3.2.1外植体的摘取:在10-40x解剖镜下由外向内依次剥除生长点外围包裹的叶片，直到生长点暴露。
[0050]3.2.2用针粗度Φ为0.2-0.4mm的解剖针针尖挑取生长点上部组织，接种到培养基中，操作时以解剖针为对比，针尖所取生长点组织不超过针的粗度，培养基的组成是:1/2MS+NAA(0.1-0.3mg/L) +BA(0.2-0.5mg/L) +蔗糖(3% )，pH 为 5.8-6.0 ;培养容器为直径为25mm的试管，培养基用量为15_20ml。
[0051]4、茎尖组织膨大培养:接种好的试管在，放置在旋转震荡摇床上进行震荡培养，振速为2rmp，培养条件温度23-25°C，光强2000_30001χ，光照时间为16hr ;培养周期30_40d形成膨大的芽体；
[0052]5、展叶培养:
[0053]茎尖组织在膨大培养基培养30-40d后，将培养基更换成展叶培养基，培养基的组成是 MS+BA(0.1-0.3mg/L) +GA(0.2-0.5mg/L) + 蔗糖(5% )，pH 为 5.8-6.0 ;培养容器为300ml培养瓶，培养基用量100ml，培养条件温度23_25°C，光强2000-30001x，光照时间为16hr，培养40-50天就可获得初代植株。经过上述培养过程‘鄂莲4号’、‘美人红’和‘飘花’初代培养的苗率分别为93.5%、92.6%和97.8%。
【主权项】
1.一种莲藕茎尖组织初代培养方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)莲藕芽体的采集:采集时间为5-8月，选取地下茎的顶芽； 2)芽体的前处理:将顶芽留取顶部3-5cm，用消毒液处理及流水清洗； 3)消毒与接种: 所述接种方法为: a.外植体的摘取:在解剖镜下由外向内依次剥除生长点外围包裹的叶片，直到生长点暴露; b.用解剖针针尖挑取生长点上部组织，接种到莲藕膨大培养基中；所述培养基的组成是:1/2MS+NAA(0.1-0.3mg/L) +BA(0.2-0.5mg/L) + 蔗糖(3% )，pH 为 5.8-6.0 ； 4)茎尖组织膨大培养:接种后进行震荡培养，振速为2rmp，培养条件温度23_25°C，光强2000-30001x，光照时间为16hr ;培养周期30_40d形成膨大的芽体； 5)展叶培养:茎尖组织在膨大培养基培养30-40d后，将培养基更换成展叶培养基，培养基的组成是MS+BA(0.1-0.3mg/L) +GA(0.2-0.5mg/L) +蔗糖(5% )，pH为 5.8-6.0 ;培养条件温度23-25°C，光强2000-30001x，光照时间为16hr，培养周期40-50天。2.根据权利要求1中所述的莲藕茎尖组织初代培养方法，其特征在于，步骤1)中，为了保证品种的纯度，芽体采集要在品种园中进行，采集长度为5-lOcm，以确保匍匐茎的质量。3.根据权利要求1中所述的莲藕茎尖组织初代培养方法，其特征在于，步骤2)中从头部剪取匍匐茎3-5cm的原因是便于消毒接种时操作方便。4.根据权利要求1中所述的莲藕茎尖组织初代培养方法，其特征在于，步骤2)中的消毒液处理及流水清洗是用400倍84消毒液浸泡芽体10-15分钟，再用蒸馏水冲洗10-15分钟，所述400倍是指用水按400:1的体积比稀释84消毒液。5.根据权利要求1所述的莲藕茎尖组织初代培养方法，其特征在于，步骤3)中消毒方法为: a.用75%的酒精消毒30秒； b.有效氯浓度为1%的次氯酸钠溶液，消毒30分钟； c.灭菌水清洗后，备用。6.根据权利要求1所述的莲藕茎尖组织初代培养方法，其特征在于，步骤3)中所述解剖镜的放大倍数为10-40x，以便于清晰观察生长点，方便取样。7.根据权利要求1所述的莲藕茎尖组织初代培养方法，其特征在于，步骤3)中，为保证外植体大小< 0.5mm，所述解剖针针粗度为Φ = 0.2-0.4mm，操作时以此为对比，针尖所取生长点组织不超过针的粗度。8.根据权利要求1中所述的莲藕茎尖组织初代培养方法，其特征在于，步骤3)中消毒和接种均在超净工作台内进行。9.根据权利要求1所述的莲藕茎尖组织初代培养方法，其特征在于，步骤4)中培养容器为直径为25_的试管，培养基用量为15-20ml。10.根据权利要求1所述的莲藕茎尖组织初代培养方法，其特征在于，步骤5)中培养容器为300ml三角瓶，培养基用量100ml。
【专利摘要】本发明公开了一种莲藕茎尖组织初代培养方法。包括如下步骤：1)莲藕芽体的采集；2)芽体的前处理；3)消毒与接种；4)茎尖组织膨大培养；5)展叶培养。本发明研通过采用适宜的培养基及培养的方法来防止外植体组织褐变；通过采用展叶培养基防止叶片畸形变异的发生，使其茎叶正常发育。该方法能使莲藕茎尖顶端分生组织的成苗率达到90％以上。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105325298
【申请号】CN201510800063
【发明人】高红胜, 陈学好, 李良俊, 王悠, 陈立宝
【申请人】扬州大学
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月18日