一种减缓长期继代蝴蝶兰类原球茎衰老的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农林领域的园艺植物生物技术，具体涉及一种采用化学方法减缓长期 继代蝴蝶兰类原球茎衰老的方法。
【背景技术】
[0002] 在著名的兰花工业中，真正形成专业化、规模化、商品化生产的只有蝴蝶兰属 )，蝴蝶兰也是我国最重要的年宵花卉，组培蝴蝶兰类原球茎（PLB)在快速 育苗、基因转化、人工种子研制、种质保存等方面具有相当应用潜力。虽然类原球茎扩繁系 数大，但在生产过程中，为提高生产效率(扩大繁殖倍率）及受市场需求、供应时间等多种 因素影响，不可避免的会出现频繁继代培养，经长期继代培养，常常出现类原球茎的形态 正常，但生长减缓，分化率低、甚至再生苗畸形等衰老现象，无法达到获得更多组培无性系 或种质保存的目的。目前长期继代培养(保存）组培材料专利或申请有，"高产原花青素刺 葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法"（申请号201410319042. 1)，采用剥去所述愈伤组 织紫红色表层细胞，选里层愈伤组织接种的方式，而且在两种继代保持培养基交替继代培 养。"快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法（【申请号】201210246117. 9)" 主要采用继代保持在两种培养基交替继代培养的方法。"大豆未成熟子叶体细胞胚增殖、 继代保存和植株再生方法"（申请号02144578. 8)挑选没有被周围的愈伤所吞食掉(或去 掉周边愈伤组织）球形胚，转接到新鲜培养基增殖。其他申请如申请号201310157607. 6、 201010514729. 2、201010249615· Χ、201410166898· Χ、200710084622· 7 主要在常规培养基稍 改的常规培养对愈伤组织进行继代保存。
[0003] 植物培养物继代保持的方法报道不多，几乎都以愈伤组织或体细胞胚为材料，上 述申请培养基配方复杂，或者操作繁琐，常温下长期继代保存效果也不明确。
【发明内容】
[0004] 植物组织培养物随着继代培养时间（次数）的增加，培养材料发生衰老或退化，其 机理包括生理衰老和遗传物质变异。活性氧自由基在植物生理衰老和遗传物质变异上均有 重要的效应。活性氧可使类脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化反应，破坏酶等生物大分子和 细胞膜的结构，引发代谢紊乱；活性氧攻击核酸分子，引起DNA单链破坏与断裂等损伤；此 外，DNA胞嘧啶甲基化水平随着植物材料继代代数和时间的增加而增加，所以遗传和表观遗 传变异也是引起长时间培养材料丧失分化能力的重要原因。抗氧化剂维生素 C、半胱氨酸、 类胡萝卜素、谷胱甘肽、硫脲等能提高抗氧化酶（S0D、P0D、CAT等)活性，清除活性氧，降低活 性氧对细胞毒害，抑制或延缓植物衰老。减少活性氧积累的的因素都能减轻或消除DNA损 伤，槲皮素、维生素 C、亚硒酸钠等对细胞DNA氧化损伤修复研究具有悠久的历史和丰硕的 成果。一些植物材料在组织培养过程中的表观遗传变化有可能通过甲基化抑制剂5-azaC (5-氮杂胞嘧啶核苷）修复而得以维持正常化(聂丽娟王子成.2007. DNA甲基化抑制剂作 用机理及其在植物发育生物学研究中的应用.核农学报，21(4) :362-365)，有报道萌芦巴 喊、甜菜喊和胆喊（Berglund T. Nicotinamide，a missing link in the early stress response in eukaryotic cells ：a hypothesis with special reference to oxidative stress in plants. FEBS Lett, 1994, 351 ： 145一149)、茶多酸类（李培坤，耿小平，朱立 新.DNA甲基化抑制剂研究进展.国际药学研究杂志，2010,37 (3) :198-202)、一定浓度 甘露酉享（Harding K . The methylation status of DNA derived from potato plants recovered from slow growth. Plant Cell Tissue Organ Cult ,1994,37, 31 - 38. 杜亚琼，王子成.甘露醇对拟南芥基因组DNA甲基化的影响.植物学报，2011，46(3): 285-292)也具有去甲基化效应。
[0005] 外源多胺不仅能调节清除活性氧和抗氧化酶的活性，抑制或消除胁迫损伤，而且 多胺能中和DNA的负电荷，对改善DNA的稳定性及损伤修复起到重要作用(崔凯荣，戴若兰， 主编，2000.植物体细胞胚发生的分子生物学.北京：科学出版社，pp. 75-76)，有学者提 出精胺稳定DNA双链结构的"多胺-DNA复合"模型（Ben A R，Lurie S，Mattoo, A K. 1982. Temperature-denpendent inhibitory effects of calcium and sperine on ethylene biosynthesis in apple discs correlate with changes in microsomal membrane microviscosity.Plant Sci.lett.24:239-247)。
[0006] 蝴蝶兰组培类原球茎随继代次数增加(培养时间延续)，出现扩繁增殖能力下降， 分化（出芽长根）能力降低的衰老或退化现象。本发明在培养基添加抗氧化剂、DNA甲基化 水平抑制剂和DNA结构稳定剂，从生理调节和遗传物质稳定性上共同作用，减轻长期继代 类原球茎的衰老现象。
[0007] 本发明提供的技术方案如下： 一种减缓长期继代蝴蝶兰类原球茎衰老的方法，综合应用如下方法减缓长期继代蝴蝶 兰类原球茎退化或衰老，即在继代培养基添加三类调节剂，抗氧化剂、DNA甲基化抑制剂和 DNA结构稳定剂。本发明所述三类调节剂可同时混用，也可两两组合应用。
[0008] 本发明所述的调节剂在培养基的终浓度(工作浓度）及配制方法，抗氧化剂抗坏血 酸10_300mg/L、半胱氨酸盐10_300mg/L、谷胱甘肽10_300mg/L、亚硫酸氢钠10_300mg/L、亚 硒酸钠 l〇-300mg/L、硫脲10-300mg/L，一种或几种组合，配制时可直接溶解于水，过滤除菌 加入已经高压灭菌未冷凝培养基。DNA甲基化抑制剂在培养基的终浓度及配制方法，5-氮 杂胞啼啶核苷5-50mg/L、甜菜碱10-100mg/L、胆碱10-100mg/L、茶多酸10-200mg/L、甘露醇 5-10g/L，一种或几种组合，其中甜菜碱、胆碱、茶多酚配置时可直接溶解于水，过滤除菌加 入已经高压灭菌未冷凝培养基，甘露醇可加入培养基直接高压灭菌。DNA结构稳定剂在培养 基的终浓度及配制方法，精胺l〇-l〇〇mg/L，亚精胺10-100mg/L，腐胺10-100mg/L，一种或几 种组合，配置时可直接溶解于水，过滤除菌加入已经高压灭菌未冷凝培养基。综上所述，除 了甘露醇可与培养基一起高压灭菌外，三类调节剂可混合溶解于水，一起过滤除菌加入已 经高压灭菌未冷凝培养基。
[0009] 本发明能减缓长期继代蝴蝶兰类原球茎增殖、分化能力降低，对类原球茎的某些 生理