一种可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液、细胞制剂及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及医药领域，尤其设及一种可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液、细 胞制剂及制备方法。
【背景技术】
[0002] 二十一世纪是细胞治疗的时代。目前的细胞治疗主要分为两大类：免疫细胞治疗 和干细胞治疗。目前细胞治疗领域采取的模式一般都是在医院就近建设实验室，进行细胞 制剂的就近制备，细胞制剂制备完毕后最好在4小时之内输注完毕。运样的细胞制剂主要 是由：90%(v/v)0.9%生理盐水+10%(v/v)人血白蛋白巧浓度没有严格限制)+-定数量的 细胞(干细胞或免疫细胞）组成，细胞均是W未冻存状态存在。鉴于将细胞从培养液中直接 过渡到主要W0. 9%生理盐水为主的溶剂中，营养成分相对之前的培养基来讲大大减少（因 为培养基是不能直接用于回输人体，只能将细胞收获后放在0. 9%生理盐水中，加上一定浓 度的营养液，进行回输治疗。），故细胞制剂制备完毕后需要尽快输注，运样才能保证细胞的 活性和治疗的有效性。虽然运种形式细胞制剂的细胞相对"新鲜"，但是也存在很大的局限 性。比如：细胞制剂制备完毕后最好在4小时之内使用，否则细胞活率会急剧下降，影响回 输治疗的效果；同时开展细胞治疗的科室必须投入巨资进行相应细胞培养GMP实验室的建 立(前提必须是有相应的建设实验室的场地)，再招聘相关技术人员，就近进行细胞制剂的 制备，运样不仅耗费大量人力物力成本，也极大地限制了细胞制剂的使用方式：只能是在制 剂制备完毕后4小时之内尽快使用，不能提供给有需求的、路途较远的外单位使用。所W， 如何扩大细胞制剂应用的地理范围，细胞制剂的长途运输问题就成为细胞治疗领域需要解 决的首要问题。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种可使细胞长时间存活的细胞冷冻保 护液，用该细胞冷冻保护液制备的细胞制剂经过长时间的存放或运输后，细胞的存活率仍 然很高，细胞复苏后可直接用于人体回输，不但适用于临床治疗，也可用于医学科研实验。
[0004] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种可使细胞长时间存活的细胞制剂，该 细胞制剂经过长时间的存放或运输后，细胞的存活率仍然很高，细胞复苏后可直接用于人 体回输，不但适用于临床治疗，也可用于医学科研实验。
[0005] 本发明要解决的第S个技术问题是提供一种可使细胞长时间存活的细胞制剂的 制备方法，使用该制备方法制备出的细胞制剂经过长时间的存放或运输后，细胞的存活率 仍然很高，细胞复苏后可直接用于人体回输，不但适用于临床治疗，也可用于医学科研实 验。
[0006] 就保护液而言，为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了一种可使细胞长时 间存活的细胞冷冻保护液，所述细胞冷冻保护液是包含有人血白蛋白和化y〇Sure-DEX40 冻存液的混合液体。
[0007] 所述人血白蛋白的浓度为> 0. 2g/ml。
[0008] 所述人血白蛋白的浓度为0. 2g/nd-0. 25g/ml。（目前本申请人所查文献中，0. 25g/ ml的浓度已经算是高浓度，人血白蛋白浓度太高对人体也不好，即人血白蛋白的浓度和人 体体液间的渗透压太大，也会对病人产生很大的副作用；但是理论上浓度越高对细胞保护 效果越好。我们选择人血白蛋白作为冷冻保护剂，需要从运两个方面权衡，不能一味强调高 浓度，而忽略了高浓度对人体体液渗透压的负影响。） 所述人血白蛋白的浓度为0. 2g/ml。
[0009] 所述人血白蛋白的含量和化y〇Sure-DEX40冻存液的含量按体积份数比为， 人血白蛋白4-9、 CryoSure-DEX40 冻存液 1。
[0010] 所述人血白蛋白的含量和化y〇Sure-DEX40冻存液的含量最佳体积份数比为， 人血白蛋白4、 CryoSure-DEX40 冻存液 1。
[0011] 所述细胞冷冻保护液中DMSO的浓度为5%-10%。
[0012] 所述细胞冷冻保护液中DMSO的最佳浓度为10%。
[0013] 本发明可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液与现有技术相比具有W下有益效 果。
[0014] 1、本技术方案由于采用了细胞冷冻保护液是包含有人血白蛋白和 CryoSure-DEX40冻存液的混合液体的技术手段，其中CryoSure-DEX40冻存液已经应用在 厮血造血干细胞的冻存和临床回输上。所W，用该细胞冷冻保护液制备的细胞制剂，可不必 经过细胞洗涂去除化y〇Sure-DEX40冻存液，拿到临床后直接复苏回输即可；同时经过长时 间的液氮冷冻保存和长途运输后，细胞的存活率仍然很高。
[0015] 2、本技术方案由于采用了所述人血白蛋白的浓度为>0.2g/ml的技术手段，所 W，可确保人血白蛋白对细胞冷冻保护的有效性。
[0016] 3、本技术方案由于采用了所述人血白蛋白的浓度为0. 2g/na-0. 25g/ml的技术手 段，所W，不仅可确保人血白蛋白对细胞冷冻保护的有效性，也能确保临床回输的有效性和 对病人的保护作用。
[0017] 4、本技术方案由于采用了所述人血白蛋白的浓度为0.2g/ml的技术手段，所W， 不但可确保人血白蛋白的有效性，而且，还可W最大限度地降低生产成本。
[0018] 5、本技术方案由于采用了所述人血白蛋白的含量和化yoSure-DEX40冻存液的含 量按体积份数比为，人血白蛋白4-9、化yoSure-DEX40冻存液1的技术手段，所W，可有效确 保细胞冻存复苏后的存活率。
[0019] 6、本技术方案由于采用了所述人血白蛋白的含量和化yoSure-DEX40冻存液的含 量按体积份数比为，人血白蛋白悬液4、化yoSure-DEX40冻存液1，所W，可确保细胞冷冻复 苏后的存活率最高。
[0020] 7、本技术方案由于采用了所述细胞冷冻保护液中DMSO的浓度为5%-10%的技术手 段，所W，可确保细胞冷冻复苏后的存活率。
[0021] 8、本技术方案由于采用了所述细胞冷冻保护液中DMSO的浓度为10%的技术手段， 所w，可确保细胞冷冻复苏后的存活率最高。
[0022] 就制剂而言，为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了一种可使细胞长时间 存活的细胞制剂，所述细胞制剂包括如前面所述的细胞冷冻保护液和细胞。
[0023] 所述细胞是干细胞或免疫细胞；含有干细胞的所述细胞制剂是干细胞制剂，含有 免疫细胞的所述细胞制剂是免疫细胞制剂。
[0024] 所述干细胞是间充质干细胞，所述免疫细胞是细胞因子诱导的杀伤性细胞或树突 状抗原提呈细胞；含有间充质干细胞的所述细胞制剂是间充质干细胞制剂，含有细胞因子 诱导的杀伤性细胞的所述细胞制剂是细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂，含有树突状抗原提 呈细胞的所述细胞制剂是树突状抗原提呈细胞制剂。 阳0巧]所述间充质干细胞制剂中间充质干细胞的密度为1. 25XIO6个/na-7. 50X10 6个/ml； 所述细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂中细胞因子诱导的杀伤性细胞的密度为 0. 5X1〇8个 /na-l. 0X10S个/ml; 所述树突状抗原提呈细胞制剂中树突状抗原提呈细胞的密度为1XIO7个/ml-2X10 7 个/ml。
[0026] 所述细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂中细胞因子诱导的杀伤性细胞的密度为 0. 5Xl〇s个/ml。
[0027] 所述间充质干细胞制剂每一剂的体积为8ml; 所述细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂每一剂的体积为20ml; 所述树突状抗原提呈细胞制剂每一剂的体积为Iml。
[0028] 每一剂所述间充质干细胞制剂注入容积为IOml的冻存管内； 每一剂所述细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂注入容积为25ml的冻存袋内； 每一剂所述树突状抗原提呈细胞制剂注入容积为2ml的冻存管内。
[0029] 细胞因子诱导的杀伤性细胞是人外周血和/或厮血源免疫细胞。
[0030] 所述干细胞制剂中间充质干细胞用于治疗的有效剂量为IX106-2XlOVkg，此间 充质干细胞是目前已知的所有来源的间充质干细胞（例如：围产期组织来源的间充质干细 胞、牙髓/骨髓来源的间充质干细胞等）。
[0031] 所述细胞制剂处于液氮冷冻状态。
[0032] 本发明可使细胞长时间存活的细胞制剂与现有技术相比具有W下有益效果。
[0033]