一种国槐离体叶片体细胞胚诱导的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种国槐离体叶片体细胞胚诱导的快速繁殖方法，属于植物生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 国槐（Sophora japonica Linn)，别名家槐、中国槐，属蝶形花亚科、槐属。国槐为 落叶乔木，树势优美，花期较长，极耐修剪，耐寒、耐旱、耐空气污染，又是吉祥、幸福、美好的 象征，是理想的行道树种和庭院绿化树种，而且国槐材质优良，花、果实、根皮、树皮可入药， 种子可棒油制皂，具有较高的经济价值，应用前景十分广阔。目前，国槐是嫁接龙爪槐、金枝 槐、聊红槐、蝴蝶槐等观赏品种的唯一化木树种，苗木需求大。国槐主要W种子繁殖为主，但 其开花结果具有大小年现象，且种子易受病虫害危害，干痕、空桐现象严重。常规的育种方 法，依靠种子或杆插繁殖，难W满足生产的需求，基于此有必要对国槐进行组培快繁研究， 提供优质、大量国槐种苗，切实解决国槐苗木需求的瓶颈。
[0003] 国槐古树资源历经千百年的风霜岁月，具有最原始的长寿和抗逆基因，但由于各 种原因，衰老死亡的现象时常发生。就古槐衰败的现状来看，常表现为树干腐朽空桐、冠形 残缺、顶梢枯萎、枝叶调零、病虫害严重、根系生长不良等等。运些古槐是大自然和前人留给 我们的宝贵的基因资源。
[0004] 近年来，利用生物转基因技术培育具有抗性如抗逆、抗虫、抗病等新型品种是国槐 育种的新趋势。到目前为止，对槐树的形成层培养、茎培养、叶片培养、胚培养、未授粉子房 的培养均已获得了完整的植株，对原生质的培养也取得了一定的进展。袁秀云等利用国槐 的子叶和下胚轴产生了不定芽，王酷之等利用花药培养形成了单倍体植株，Han K.H等 (1993,1997)将直径为0.5~1.0cm的枝条消毒后，取出形成层接入愈伤诱导培养基中诱导 愈伤，再将愈伤组织转入分化培养基中，获得了丛生芽，将成苗转入生根培养基中，可诱导 生根。上述的方法存在的缺点：由于国槐为多年生木本植物，其再生率普遍较低，出芽少，直 接影响了国槐的遗传转化。利用植物体胚诱导技术不但能达到保存母株优良基因、快速繁 育的目的，还是提高基因遗传转化或诱变育种的重要途径。目前，有关国槐的体细胞胚诱导 技术研究的较少，可W参考的现有技术比较少。国槐为多年生乔木，基因组庞大，鉴于基因 型的限制，其他物种的体细胞胚诱导的繁殖技术对国槐没有参考价值。在运一方面，即使是 同一物种，不同的品种之间，体胚诱导培养基也不相同。例如，同样是国槐，同一种培养基， 对黄金槐适合，对金叶槐就不适合。
[0005] 专利CN 102499086 A公开了一种刺槐的繁殖方法，W不同胚龄的合子胚为外植 体，WMS+2，4-D+BA+薦糖+琼脂为胚性愈伤组织的诱导培养基；WMS基本培养基+MES+谷氨 酷胺+水解酪蛋白+糞乙酸+6-节氨基腺嚷岭+薦糖+琼脂为体细胞胚诱导培养基，通过对愈 伤组织的诱导，形成球形胚后将其转接到MS+水解酪蛋白培养基上，进行体细胞胚的成熟培 养，然后转接到MS基本培养基上萌发形成完整小植株。该专利使用刺槐的不同胚龄的合子 胚(芙果)作为原料进行体细胞培养，不论是刺槐还是国槐，其每年的花期W及果实期都是 固定的两个月左右，所W在进行体细胞培养时具有时间的局限性；国槐的离体叶片、不成熟 的合子胚均可诱导产生胚状体。但是，在山东地区，最近几年的国槐小峰危害非常严重，很 难采到无虫害的完整种子。其次，相对于国槐叶片诱导来说，不成熟合子胚的诱导时间更 长，且诱导出的丛生芽也不如叶片诱导的多。因此，本专利采用取材方便、诱导率高的叶片 进行国槐体胚诱导。国槐与刺槐分属不同的属，物种差别较大，不能参考芙果的体细胞培养 得到叶片的体细胞培养。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种国槐离体叶片体细胞胚诱导的快 速繁殖方法，W解决国槐再生率低下、出芽少的问题。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种国槐离体叶片体细胞胚诱导的快速繁殖方法，包括W下步骤：
[0009] (1)将国槐茎消毒后，取带有芽(优选:蔽芽或顶芽)的茎段，接入芽启动培养基上， 诱导顶芽和蔽芽萌发，所述芽启动培养基为:MS+5. Og/L琼脂+30g/L薦糖，pH值5.8~6.0;
[0010] (2)将诱导出的新梢去掉基部叶片，切成含芽(优选:蔽芽或顶芽）的茎段接种在试 管苗增殖培养基上培养，获得无菌试管苗，所述试管苗增殖培养基为:MS+1.0~2. Omg/L BA (6-苄基腺嚷岭)+1.0~2. Omg/LIBA(吗I噪下酸)+5. Og/L琼脂+30g/L薦糖，pH值5.8~6.0;
[0011] (3)取无菌试管苗的叶片接种在体胚诱导培养基上培养形成愈伤组织，所述体胚 诱导培养基为:]?5+3.0~5.0111旨/12,4-0(2,4-二氯苯氧乙酸）+0.5~1.0111旨/184+0.5~ l.Omg/L NAA(糞乙酸)+0.1 ~0.5mg/L TDZ+0.5~l.Omg/L谷氨酷胺+0.5~l.Omg/L CH(水 解酪蛋白）+5. Og/L琼脂+30g/L薦糖，pH值5.8~6.0;
[0012] (4)将上述愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，培养形成丛生芽小苗，所述不定 芽诱导培养基为:MS+0.1~0.5mg/L BA+0.1~0.5mg/L NAA+0.5~1. Omg/L谷氨酷胺+0.5~ 1. Omg/L CH(水解酪蛋白）+5. Og/L琼脂+30g/L薦糖，pH值5.8~6.0;
[0013] (5)将丛生芽小苗切成愈伤块转接到试管苗增殖培养基或不定芽诱导培养基上进 行增殖快繁培养；
[0014] (6)将增殖培养的丛生芽从基部切开，转入壮苗培养基中，进行壮苗培养，所述壮 苗培养基为:MS+5. Og/L琼脂+30g/L薦糖，pH值5.8~6.0;
[0015] (7)将壮苗培养后的小苗切成单株转接到生根培养基上培养后，即可炼苗移栽，所 述生根培养基为：1/2MS+0.1 ~0.5mg/L IBA+0~0.05mg/L NAA+5. Og/L琼脂巧Og/L薦糖，pH 值5.8~6.0，所述I/2MS是MS全量减半。
[0016] 优选:所述步骤（1)之前还包括选取国槐嫩枝，所述国槐嫩枝为取无病虫害的当年 生嫩枝，除去多余的茎叶，用洗洁精仔细清洗后，流水冲洗1小时。优点：减少外植体消毒过 程中的污染。
[0017] 优选:步骤（1)中消毒为:于超净工作台上，用体积分数为70%酒精浸泡30~60s， 无菌水冲洗2~3次，再用质量分数为0.1%升隶(氯化隶)溶液消毒10~15min，然后用无菌 水冲洗4~6次。
[0018] 优选:步骤(3)中无菌试管苗的叶片接种时叶片的处理方法:取无菌试管苗，从茎 尖向下第3到第6片展开叶为材料，叶片带短叶柄，用手术刀片垂直于叶片背面主脉划3~4 个伤口。
[0019] 优选:上述各步骤中培养条件除特殊说明外，均为培养室溫度白天25±2°C，夜晚 18 ± 2 °C，光照强度1000~15001X，光照时间16h/d。
[0020] 优选:MS包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
[0021] 优选:所述的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下:硝酸钟1900mg/L，硝酸锭 1650mg/L，屯水硫酸儀370mg/L，无水憐酸二氨钟170mg/L，二水氯化巧440mg/L，乙二胺四乙 酸二钢37.3mg/L，屯水硫酸亚铁27.8mg/L。
[0022] 优选:所述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：四水硫酸儘22.3mg/L，硫 酸锋8.6mg/L，棚酸6.2mg/L，舰化钟0.83mg/L，钢酸钢0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钻 0.025mg/L〇
[0023] 优选：所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下：盐酸硫胺素 lOmg/L，烟酸 1 .Omg/L，盐酸化唉醇 1 .Omg/L，肌醇 lOOmg/L。
[0024] 优选:步骤(7)中炼苗移栽的具体步骤为:将试管苗封口膜绑绳松开，在培养室适 应1~2d，转入遮光度50%的溫室中，去掉封口膜，炼苗2~3d，待小苗叶片上的气孔可自主 开合后，用綴子轻轻将小苗夹出，清水洗去基部残留的培养基，移栽到装有混合育苗基质的 花盆中，保持相对湿度在80% W上。
[0025] 优选:所述花盆混合育苗基质的成分W体积比计为：珍珠岩:银末：腐殖± = 30: 30:40。
[0026] 优选:利用间歇喷雾装置或人工喷水保持相对湿度。具体要求为:喷水一定为非常 细小的雾状水，使叶面保持湿润，而花盆中基质状态为用手樓不滴水，松手不散开。如此驯 化炼苗5~IOd后，长出新根，新芽萌出，逐渐减少诱水次数并进行常规管理。
[0027] 有益效果：
[00%]体细胞胚发生的因素包括内因和外因，内因包括物种和基因型，外因主要设及培 养基中附加成分的种类和浓度。即使是同一属的植物，由于基因型不同，体细胞胚发生频率 相差极大，原因如下：一是不同基因型体细胞胚发生频率不同，二是不同基因型的最适诱导 条件不同。外植体的生理状态和发育程度都直接影响体细胞胚的发生，一般生理代谢旺盛 而分化程度较低的组织有利于体细胞胚的诱导。
[0029] 对于培养条件中必需的生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸，还原性氮盐和外源 氨基酸，抑值等其他因素