冻存肿瘤组织的方法

冻存肿瘤组织的方法
【专利摘要】本发明涉及冻存肿瘤组织的方法，其包括将所述来源于肿瘤患者的肿瘤组织剪切成1mm±0.2×1±0.2mm×3±0.6mm大小，然后将剪切后的组织块冻存25±2周。任选地，将冻存25±2周的组织用于PDTT移植瘤模型建立或用于体内或体外传代培养。本发明的冻存方法具有成瘤率高、移植瘤能比较完整地保留患者来源组织的形态和分子特征等特点。
【专利说明】
冻存肿瘤组织的方法
技术领域：
[0001] 本发明属于与生物组织或细胞的保存相关的领域，涉及一种用于冻存肿瘤组织的 方法。
【背景技术】：
[0002] 在药物开发和特异性治疗途径或用药等的开发过程中，需要对生物组织(例如通 过手术切除或通过穿刺获得的生物组织，特别是肿瘤组织）进行保存，以用于后续的治疗、 检测或科学研究等工作。目前普遍采用的保存生物组织的方法是低温冻存，同时低温冻存 对生物组织也有一系列的影响。例如Zhang JN,Yu YY，Ji J，et al .Effect of time of freeze-preserving on biological macromolecules of tumor tissue[J]?Journal of Diagnostics Concepts&Practice,2009,8(1) :38_42探讨了低温冻存时间对肿瘤组织的生 物大分子DNA、RNA及蛋白质的影响。
[0003] 肿瘤动物模型一直以来是抗肿瘤药物临床前疗效预测和可能的毒性评价的有效 工具。促使一个实验室候选药物进入临床试验的前提是来自动物模型的研究数据能够预测 该药物在临床应用时的疗效。当药物研发人员开发一个新型药物时，摆在他们面前的其中 一个最大的障碍是从动物实验中获得的药敏和毒理数据有时并不能完全验证在患者身上。 目前用于药物筛选的肿瘤模型基本采用的是将成熟的肿瘤细胞系接种于免疫缺陷小鼠获 得的。这种模型已经用于抗肿瘤新药的筛选达数十年之久。虽然这种模型在揭示肿瘤转移 的细胞和分子机制中显示出其优点，但是在预测抗肿瘤药物的临床治疗敏感性时，这种模 型的价值却非常有限。经过体外几十代的培养，恶性肿瘤细胞已经呈现出高度未分化的状 态，细胞系在体外培养的选择压力下表现出均一的组织学特征，其生物学特性和分子特征 已经和原发肿瘤相差甚远。而且体外培养的细胞系缺乏肿瘤的间质成分，而这种间质成分 被认为在肿瘤转移的病理过程中起到很关键的作用。鉴于此，很多研究小组开始尝试建立 一种直接接种来源于肿瘤患者新鲜肿瘤组织(patient-derived tumor tissue，PDTT)的裸 鼠移植瘤模型，即PDTT移植瘤模型。这种H)TT移植瘤模型将患者的新鲜肿瘤组织（穿刺标本 或手术标本)接种于免疫缺陷小鼠皮下或肾包膜下形成肿瘤。PDTT模型比传统的细胞系模 型更能反映人类肿瘤的生物学特征，这种模型不仅保留了与原发肿瘤组织相似的增殖和组 织病理学特征，而且在生物学行为上，包括肿瘤的基因，蛋白质等分子特征与来源肿瘤组织 具有高度的一致性。由于PDTT模型比细胞系模型更能反映体内状况，因此被有效地应用于 潜在抗肿瘤药物的特异性快速筛选。
[0004] 建立和使用PDTT移植瘤模型用于临床前抗肿瘤药物筛选的前提是移植瘤能比较 完整地保留患者来源组织的形态和分子特征。另外，PDTT移植瘤模型的建立通常需要肿瘤 患者新鲜肿瘤组织的冻存，因为这样可以在由于污染等情况丢失组织时有备份可用。但是， 在现有技术中，鲜有报道如何冻存肿瘤患者的肿瘤组织，以使得移植瘤能比较完整地保留 患者来源组织的形态和分子特征，同时具有较高的成瘤率。

【发明内容】
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[0005] 本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种冻存肿瘤组织的方法。本 发明的发明人经过长期坚持不懈的努力，利用结肠癌患者新鲜肿瘤组织来源的多病灶roTT 移植瘤模型获得了新型的冻存肿瘤组织的方法，该方法具有成瘤率高、移植瘤能比较完整 地保留患者来源组织的形态和分子特征等特点。发明人发现，通过本发明的冻存方法冻存 的肿瘤组织的成瘤率可高达100%、且患者来源肿瘤组织的组织形态学和分子特征在移植 瘤模型肿瘤组织中得到有效保存。
[0006] 本发明一方面提供了一种冻存来源于肿瘤患者的肿瘤组织的方法，其包括将所述 来源于肿瘤患者的肿瘤组织剪切成lmm±〇. 2Xl±0.2mmX3±0.6mm大小，然后将剪切后的 组织块冻存25 ±1周。任选地，将冻存25 ±1周的组织用于PDTT移植瘤模型建立或用于体内 或体外传代培养。
[0007] 优选地，本发明的肿瘤组织在冻存之前用培养基或Hank's液进行冲洗。
[0008]本发明第二方面提供了建立PDTT移植瘤模型的方法，其包括（1)将来源于肿瘤患 者的肿瘤组织剪切成lmm±0.2Xl±0.2mmX3±0.6mm大小；（2)将剪切后的组织块冻存25 ±1或25±2周；以及(3)将冻存的组织块复苏后建立H)TT移植瘤模型。
[0009] 本发明第三方面提供了肿瘤组织的培养或传代方法，其包括（1)将来源于肿瘤患 者的肿瘤组织剪切成lmm±0.2Xl±0.2mmX3±0.6mm大小；（2)将剪切后的组织块冻存25 ±1或25±2周；以及(3)将冻存的组织块复苏后进行体内或体外的培养或传代。
[0010] 优选地，被冻存的肿瘤组织是结肠癌原发瘤、结肠癌淋巴转移瘤和结肠癌肝转移 瘤。更优选地，被冻存的肿瘤组织是结肠癌肝转移瘤。
[0011] 优选地，本发明所述的肿瘤组织是哺乳动物的肿瘤组织，例如猪、狗、猫等。更优选 地，本发明所述的肿瘤组织是来源于人的肿瘤组织。
[0012] 优选地，中本发明的冻存方法中，将剪切后的组织块冻存于冻存液中。更优选地， 所述冻存液包括（l)Leibovitz L-15培养基；（2)14-18%胎牛血清；和（3)14-18%01^0 (dimethyl sulfoxide，二甲基亚讽）。其中，Leibovitz L-15培养基可商购(Gibco)获得，或 者本领域技术人员根据已报道的配方自行配制，优选地，DMS0的含量为14-16%，更优选为 15%。另一方面，其中的胎牛血清的含量优选为14-18%，更优选为14-16%，最优选为15%。 最优选地，本发明所述的冻存液包括（DLeibovitz L-15培养基；（2)15%(v/v)胎牛血清； 和(3)15% (v/v)二甲基亚砜。
[0013]优选地，在本发明的方法中，将来源于肿瘤患者的肿瘤组织剪切成lmm±〇. 1X1土 0? 1mmX 3±0 ? 3mm大小；更优选地，将来源于肿瘤患者的肿瘤组织剪切成1mm±0.05 X 1 土 0.05mm X 3 ± 0.15mm大小；最优选地，来源于肿瘤患者的肿瘤组织剪切成1 mm X 1 mm X 3mm大 小。
[0014]优选地，在本发明的方法中，将剪切后的组织块冻存25±0.5周；更优选地，将剪切 后的组织块冻存25 ± 0.25周;最优选地，将剪切后的组织块冻存25周。
[0015]优选地，本发明的冻存步骤包括:首先将置于冻存液中的肿瘤或生物组织置于4°C 的装有异丙醇的冻存盒中约1小时；然后将装有标本的冻存盒置入_20°C的低温冰箱过夜 (约24小时）；再将装有标本的冻存盒置入-80°C (约24小时）；以及将标本从冻存盒中取出置 于液氮(_196°C)中长期保存。
[0016] 本发明的冻存方法具有成瘤率高、移植瘤能比较完整地保留患者来源组织的形态 和分子特征等特点。
【附图说明】：
[0017] 图1:H&E染色显示组织病理学特征（XIOOhAj:结肠癌原发瘤;C、D:结肠癌淋巴 转移瘤;E、F:结肠癌肝转移瘤。G0,患者来源肿瘤组织;G3,第三代移植瘤组织。
[0018]图2: VEGF免疫组织化学染色显示患者来源肿瘤组织与移植瘤组织高度一致（X 100) :结肠癌原发瘤;C、D:结肠癌淋巴转移瘤;E、F:结肠癌肝转移瘤。GO，患者来源肿瘤 组织;G3，第三代移植瘤组织。
[0019]图3 :EGFR免疫组织化学染色显示患者来源肿瘤组织与移植瘤组织高度一致（X 100) :结肠癌原发瘤;C、D:结肠癌淋巴转移瘤;E、F:结肠癌肝转移瘤。G0，患者来源肿瘤 组织;G3，第三代移植瘤组织。
【具体实施方式】：
[0020]下面结合具体实例对本发明进一步说明。
[0021 ]实施例1:患者肿瘤组织标本的获得及冻存
[0022]新鲜肿瘤组织标本来源于一名40岁的女性结肠癌伴淋巴结和肝转移患者，标本的 获取得到患者的知情同意和本单位伦理委员会的许可。患者术前未曾接受过化疗和其它治 疗。将术中标本用灭菌手术剪剪切成不同尺寸后冻存于预先准备好的本发明的冻存液中 (首先置于4°C的装有异丙醇的冻存盒中约1小时;然后将装有标本的冻存盒置入-20°C的低 温冰箱过夜(24小时）；再将装有标本的冻存盒置入-80°C (24小时）；以及将标本从冻存盒中 取出置于液氮(_196°C)中长期保存），以待接种。其中冻存液的配方如下：
[0023] Leibovitz L-15培养基（商购(Gibco)获得）；
[0024] 15%(V/V)胎牛血清；
[0025] 15%(V/V)DMS0(二甲基亚砜）。
[0026]实施例2:结肠癌多病灶H)TT移植瘤模型的建立
[0027] 1)4~6周龄的BALB/c裸鼠饲养于SPF级屏障环境中，并使其适应环境三天以上；
[0028] 2)将冻存于本发明冻存液中的肿瘤组织标本(在冻存前用灭菌手术剪已经将标本 切成不同尺寸大小的碎片）复苏后转移入冰浴的RPMI 1640培养基（含20%胎牛血清和 0.05 %青霉素/链霉素）中；
[0029] 3)然后用上述RPMI 1640培养基洗涤三次；
[0030] 4)动物用异氟烷麻醉后，消毒裸鼠背腹部皮肤，无菌棉球擦拭干，用刀片在裸鼠的 一侧前腋下附近切一个小口，18号穿刺针头钝性分离皮肤与皮下，使成一皮袋，将准备好的 肿瘤碎片置放于其中，切口滴加一滴双抗(100 X青霉素/链霉素）；
[0031] 5)剩余组织液氮速冻_80°C保存或福尔马林固定石蜡包埋用于后续测定；
[0032] 6)每周2次用游标卡尺测定移植瘤的体积，体积计算方法为:肿瘤体积=(长径X 短径2)/2;
[0033] 7)大约11至15周，移植瘤长到1000~1500mm3大小；
[0034] 8)在移植瘤长到1000mm3时即开始传代:荷瘤裸鼠脱臼处死后，将裸鼠置于75%酒 精中浸泡2分钟，将瘤体按上述方法切碎后接种。
[0035] 实施例3:不同冻存时间对结肠癌H)TT移植瘤模型的成瘤率的影响
[0036]将根据实施例1剪切尺寸为1mmXImmX 3mm冻存2-52周的肿瘤组织根据实施例2的 方法进行rorr移植瘤模型的建立，成瘤率如表1所示。
[0037]表1:不同冻存时间对结肠癌roTT移植瘤模型的成瘤率的影响
[0039]
[0040] 注:G3,传代至第三代。
[0041 ]实施例4:不同冻存时间对H)TT移植瘤模型的肿瘤生长速度的影响
[0042]将根据实施例1剪切尺寸为1mmXImmX 3mm冻存2-52周的肿瘤组织根据实施例2的 方法进行PDTT移植瘤模型的建立，当瘤体生长到时1000mm3测定其生长速度，结果如表2所 7Jn 〇
[0043]表2不同冻存时间对结肠癌TOTT移植瘤模型的肿瘤生长速度的影响


[0047] 3当瘤体生长到时1000mm3测定。G3,第三代移植瘤组织。
[0048] 实施例5:组织块的尺寸对结肠癌H)TT移植瘤模型的成瘤率的影响
[0049] 将根据实施例1冻存24周的不同尺寸的肿瘤组织根据实施例2的方法进行PDTT移 植瘤模型的建立，成瘤率如表3所示。
[0050] 表3组织块不同体积对结肠癌H)TT移植瘤模型的成瘤率的影响
[0052]实施例6:组织块体积对结肠癌H)TT移植瘤模型的肿瘤生长速度的影响
[0053]将根据实施例1冻存24周的不同尺寸的肿瘤组织根据实施例2的方法进行PDTT移 植瘤模型的建立，当瘤体生长到时1000mm3测定其生长速度，结果如表4所示。
[0054]表4组织块体积对结肠癌H)TT移植瘤模型的肿瘤生长速度的影响
[0056]
[0057] 3当瘤体生长到时1000mm3测定。G3,第三代移植瘤组织。
[0058]实施例7:患者来源肿瘤组织的组织形态学和分子特征在移植瘤模型肿瘤组织中 得到有效保存
[0059]建立和使用PDTT移植瘤模型用于临床前抗肿瘤药物筛选的前提是移植瘤能比较 完整地保留患者来源组织的形态和分子特征。基于这个目的，本发明的发明人将根据实施 例1剪切尺寸为1mm X 1mm X 3mm冻存24周的肿瘤组织根据实施例2的方法进行H)TT移植瘤模 型的建立。随后对移植瘤模型肿瘤组织进行我们采用染色、免疫组织化学染色、基因组 cDNA表达芯片检测、焦磷酸测序、实时荧光定量PCR检测和蛋白质免疫印迹等方法和技术来 检测移植瘤在传代过程中的生物学稳定性。
[0060] 组织病理学HE染色表明，移植瘤组织与来源组织均具备腺癌的特征。图1显示的是 患者来源肿瘤组织(G0)与第三代移植瘤组织(G3)的形态特征。从图中可见，患者来源肿瘤 组织与移植瘤肿瘤组织没有形态上的差异。并且，移植瘤组织与患者来源肿瘤组织还显示 出相似的EGFR和VEGF表达特征（图2、3)。
[0061] 当我们使用TOTT模型用于评价新型抗肿瘤药物时，特别是评价分子靶向药物时， 了解移植瘤详细的分子特征是必须的。基于这个目的，我们采用GeneChip HGU133Plus2.0 表达芯片(Affymetrix)来检测移植瘤在传代过程中的基因表达谱的一致性，采用焦磷酸测 序检测几个结肠癌相关基因在传代过程中突变情况的一致性，采用实时荧光定量PCR来检 测几个随机选择的功能基因的mRNA在传代过程中的一致性，采用蛋白质免疫印迹来检测一 些信号通路相关的蛋白在传代过程中的表达一致性。研究结果发现，结肠癌原发瘤、淋巴转 移瘤和肝转移瘤在传代过程中，其KRAS、BRAF、EGFR和PIK3CA的突变情况和随机选择的mRNA 表达情况(结果未列出)完全一致。
[0062]蛋白质免疫印迹检测结肠癌各病灶及其移植瘤中的六杜、口41^1:(361'3()8311(1361' 473)、 ERK、pERK(Thr2()2/Tyr2()4)、MAPK、pMAPK(Thr18()/Tyr 182)、mT0R、pmT0R(Ser2448)、EGFR、VEGF、 CaSepaSe-3、PCNA和GATOH(内参）蛋白表达情况。对于这些随机选择的信号通路蛋白，结肠 癌淋巴转移瘤和肝转移瘤的移植瘤模型组织与患者来源组织保持了高度的一致性，虽然在 结肠癌的原发瘤的移植瘤模型组织与患者来源组织有一定差异。
[0063] 基于基因芯片的检测结果，计算了移植瘤组织与患者来源组织的相似程度。几个 病灶组织与其移植瘤组织的芯片结果的相关系数在0.988~0.991之间。结肠癌原发瘤移植 瘤组织与患者来源组织的相关系数为0.991，结肠癌淋巴转移瘤移植瘤组织与患者来源组 织的相关系数为0.989,结肠癌淋巴转移瘤移植瘤组织与患者来源组织的相关系数为 0.988。研究结果表明，移植瘤与患者来源组织的功能基因具有高度的一致性。配对比较t检 验统计结果表明移植瘤组织与患者来源组织表达基因的差异是有限的。
[0064] 最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的 技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在 本发明的权利要求范围内。
【主权项】
1. 一种冻存来源于肿瘤患者的肿瘤组织的方法，其包括（1)将所述来源于肿瘤患者的 肿瘤组织剪切成lmm±0.2Xl±0.2mmX3±0.6mm大小；（2)将剪切后的组织块冻存25±2 周。2. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将冻存25±2周的组织用于roTT移植瘤模 型建立或用于体内或体外传代培养。3. 根据权利要求1所述的方法，其中肿瘤组织在冻存之前用培养基或Hanks液进行冲 洗。4. 根据权利要求1所述的方法，其中将来源于肿瘤患者的肿瘤组织剪切成lmm±0.1 X 1 ±0.1mmX3±0.3mm大小；更优选地，将来源于肿瘤患者的肿瘤组织剪切成1mm±0·05 X 1 土 0.05mm X 3 ± 0.15mm大小；最优选地，来源于肿瘤患者的肿瘤组织剪切成1 mm X 1 mm X 3mm大 小。5. 根据权利要1-4中任一项所述的方法，其中将剪切后的组织块冻存25±1周；优选地， 将剪切后的组织块冻存25 ±0.5周；更优选地，将剪切后的组织块冻存25 ±0.25周；最优选 地，将剪切后的组织块冻存25周。6. 根据权利要求5所述的方法，其中将剪切后的组织块冻存于冻存液中，且所述冻存液 包括(1)!^;113〇￥；^2 1^-15培养基；（2)15%(>八)胎牛血清;和(3)15%(>八)二甲基亚砜。7. 建立roTT移植瘤模型的方法，其包括⑴将来源于肿瘤患者的肿瘤组织剪切成1mm ± 0.2Xl±0.2mmX3±0.6mm大小；（2)将剪切后的组织块冻存25 ± 2周；以及（3)将冻存的组 织块复苏后建立roir移植瘤模型。8. 根据权利要求7所述的方法，其中将来源于肿瘤患者的肿瘤组织剪切成lmm±0.1 X 1 ±0.1mmX3±0.3mm大小；更优选地，将来源于肿瘤患者的肿瘤组织剪切成1mm±0·05 X 1 土 0.05mm X 3 ± 0.15mm大小；最优选地，来源于肿瘤患者的肿瘤组织剪切成1 mm X 1 mm X 3mm大 小。9. 根据权利要求7所述的方法，其中将剪切后的组织块冻存25 ± 1周;优选地，将剪切后 的组织块冻存25 ± 0.5周;更优选地，将剪切后的组织块冻存25 ± 0.25周；最优选地，将剪切 后的组织块冻存25周。10. 根据权利要7-9中任一项所述的方法，其中将剪切后的组织块冻存于冻存液中，且 所述冻存液包括（1)Leibovi tz L-15培养基；（2) 15 % (v/v)胎牛血清;和(3) 15 % (v/v)二甲 基亚砜。
【文档编号】A01N1/02GK105850981SQ201610282079
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】陶锋, 金科涛, 蓝欢荣, 黄黎明, 吕杰青, 景元明, 王伟, 胡耕远
【申请人】绍兴市人民医院