专利名称：含s(主蛋白)和前s1(大蛋白)乙肝表面基因工程融合抗原的纯化工艺的制作方法
我国是乙型肝炎高发区，有50-70％的人群感染过HBV，10％的人群(1亿多人)为带毒者，目前还没有治疗的有效方法，接种疫苗是预防肝炎的有效措施。
1968年，美国科学家Prince等人在乙肝病人血清中发现了特异存在的乙型肝炎病毒抗原成分，1971年Kongman又利用HBsAg阳性血清首次分离得到了HBsAg亚单位颗粒，1981年，利用慢性HBV携带者血清分离纯化得到的乙型肝炎血源疫苗正式被批准生产并用于人体免疫。
八十年代以来，基因工程技术的发展为新型乙肝疫苗的研究开辟了新途径。1984年，DeWilde M[1]等人利用酵母细胞成功地表达了HBsAg并纯化得到了HBsAg亚单位颗粒，并将其制成疫苗用于临床实验，并获得了很好的免疫效果。1986年，美国正式批准默克(Merk)公司使用酵母菌生产的基因工程乙肝疫苗进入市场，随后，HBsAg在中华地鼠卵巢细胞(CHO)中也得到了成功的表达并纯化得到疫苗成品。
目前使用的乙型肝炎疫苗，无论是血源疫苗还是基因工程重组疫苗都只含有S蛋白的成分。有5-10％的人群对其反应低下或无反应[2]，这主要是由于抗原成分中缺少前S的抗原决定簇。Raul Raz[3，4]等人的研究表明，带前S的HBV基因重组疫苗可克服人群中对S低反应或无反应的现象，可以达到低剂量高反应的效果，是很有希望的新型乙肝疫苗。
目前现有的血源疫苗的超离心纯化法[5]并不适合于基因工程产品，而酵母细胞表达的乙肝表面抗原因为胞内表达因需破碎细胞等复杂工艺[6]也不适合于本抗原。我室已建立了CHO细胞表达的乙肝病毒主蛋白的纯化工艺[7，8]，然而CHO细胞表达的S和前S1融合蛋白的纯化工艺未见文献报道。
本室已在CHO细胞中成功地表达了含S和前S1乙肝表面融合抗原，这个新型抗原与以往文献报道的均不同，为了使用该抗原研制新型乙肝疫苗，首先要对该抗原的纯化进行研究，因此建立该抗原的分离纯化工艺，就成了本发明的主要目的。
本发明以表达含S和前S1(S+S1)乙肝表面抗原的基因工程细胞系GdSS1-18#细胞培养上清液为原料，利用柱层析技术对S+S1的纯化进行研究，以建立能够从含乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白的细胞培养液中，通过层析技术分离纯化乙肝表面抗原S和前S1的新工艺。
乙肝表面抗原S和前S1融合抗原(S+S1)，是在乙肝表面抗原226个氨基酸的羧基端加上了前S1第21到47位27个氨基酸形成的融合抗原，该抗原从我们已建立的GdSS1-18#基因工程细胞系(另申请专利)分泌表达，是一个新抗原，其理化性质及生物学活性均与以前报道的乙肝表面抗原不同，因此分离纯化工艺也可能会有明显的不同。
含乙肝表面抗原S的层析工艺流程是我们建立的[8]，其基本特征是细胞培养液加硫酸铵处理→上疏水柱层析→脱盐处理再行离子交换柱层析→浓缩后再过分子筛柱。我们对S+S1抗原的研究表明，该抗原与DEAE-Sepharose的结合能力较单纯S抗原更强，需用更强的盐浓度才能从该柱洗脱下来，例如，S抗原只能使用极低盐浓度上柱才能吸附，在0.12M NaCl时S抗原就会从该柱上洗脱下来，而S+S1抗原结合能力强，洗脱盐浓度高到0.41M NaCl，这就为建立新的分离纯化工艺奠定了基础。基于这一特点，经过实验摸索，建立了使用含S+S1的细胞培养液，经离心去细胞残渣后，不经任何调整，直接上样离子交换柱进行层析的工艺，并把它做为整个工艺的第一步。由于S+S1在离子交换柱上的洗脱盐浓度高，原液盐浓度约0.12M NaCl，在上样时就去除了很多杂蛋白，这在S抗原是做不到的(其洗脱盐浓度即为0.12MNaCl)，接着使用0.26-0.3M NaCl盐洗柱可进一步去除大量杂蛋白，因此在用0.39-0.41M NaCl洗脱S+S1时，可获得相对较纯的S+S1抗原，这样就实现了原液大量、快速粗纯化的目的。由于第一步获得样品相对较纯，即总蛋白量相对较少，就大大提高了其后疏水柱的柱效。实验表明疏水柱的柱效提高了2-3倍，并进而确定了S+S1分离纯化工艺流程细胞培养原液→除渣后直接上样离子交换柱层析→调电导后上样疏水柱层析→浓缩后上样分子筛柱层析。工艺流程各步具体条件如下1.样品处理含S+S1抗原的细胞培养液经5000转/分离心去除细胞残渣，4℃保存备用。
2.离子交换柱层析经除渣的细胞分泌上清液上离子交换柱，介质为DEAE-Sepharose，上样量为离子交换柱介质量的15倍。上样后，记录仪出现A峰，为未被吸附的杂蛋白峰，上样完毕后以0.26-0.30M NaCl-20mM磷酸盐缓冲液洗柱，洗脱的仍为杂蛋白。A峰完全洗脱完毕后以0.41M NaCl-20mM磷酸盐缓冲液洗脱收集S+S1抗原B峰(
图1)。以1MNaCl-20mM磷酸盐缓冲液洗脱再生柱床。
3.疏水柱层析离子交换柱获得的S+S1抗原B峰，进一步经疏水柱纯化，介质为Butty-S-Sepharose 6，上样量为相当于从疏水柱介质体积50倍细胞培养原液中获得的B峰量。先以7.5-8.5％硫酸铵-10mM磷酸盐缓冲液(电导率45-48ms/cm室温26℃-22℃)平衡柱床。样品加硫酸铵调电导至45-48ms/cm(室温26℃-22℃)后上样，上样时记录仪上出现A峰为杂蛋白峰，上样完毕后用柱床平衡液将A峰完全洗下，再以10mM磷酸盐缓冲液洗脱收集S+S1抗原B峰(图2)，以70％乙醇-10mM磷酸盐缓冲液洗脱再生柱床。分子筛柱层析疏水柱获得的S+S1抗原B峰，进一步经分子筛柱纯化，介质为Sepharose4FF。上样总量为相当于从分子筛柱介质总量8-10倍的细胞培养原液中获得的疏水柱B峰量。以0.15M NaCl-20mM磷酸盐缓冲液平衡柱床，上样体积为分子筛柱床体积的1/50-1/100。上样后以0.15M NaCl-20mM磷酸盐缓冲液洗脱，大分子蛋白质A峰被先洗脱下来，此峰不收集。收集含S+S1抗原的B峰(图3)。
经上述工艺流程纯化的乙肝表面抗原S+S1外观清澈透明，无沉淀。经Lowery法定氮抗原回收率大于40％，纯度大于95％(HPLC)。SDS-PAGE凝胶电泳结果条带与预期结果相同为p27 gp30，在分子量60KD左右的条带是二聚体或多聚体。PAGE凝胶蛋白染色结果表明蛋白成球状况良好，无小分子杂蛋白。牛血清残留量检测低于1ug/dose。细胞DNA含量小于100pg/dose。以上各项检测指标均符合检定部门对乙型肝炎疫苗半成品的检定要求。
权利要求
1.一种从表达乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白的哺乳动物基因工程细胞系培养液中分离纯化乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白的工艺细胞培养原液→离子交换柱层析→疏水柱层析→分子筛柱层析。
2.根据权力要求1，细胞培养原液是指经离心去除了细胞残渣的含有乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白的细胞培养液。
3.根据权力要求1和2，离子交换柱层析的条件为细胞培养原液直接上样离子交换层析柱，上样液总体积与介质体积比为15∶1，离子交换柱层析介质为DEAE-Sepharose，上样完毕后使用含0.26-0.30M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白A峰，洗至基线后使用含0.39-0.41M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液洗脱收集乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白B峰。
4.根据权力要求1，2和3，疏水柱层析的条件为从相当于疏水柱介质总量50倍的细胞培养原液所获得的离子交换柱层析B峰量，获得的B峰样品在26℃-22℃加硫酸铵调电导至45-48ms/cm后，上样疏水层析柱，疏水层析柱介质为Butty-S-Sepharose 6，上样前先用经硫酸铵在26℃-22℃将电导调至45-48ms/cm的10mM磷酸盐缓冲液平衡柱床，上样完毕后使用同样磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白A峰，洗至基线后使用10mM磷酸盐缓冲液洗脱并收集乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白B峰。
5.根据权力要求1，2，3和4，分子筛柱层析条件为疏水层析获得的B峰样品超滤浓缩后上样分子筛柱，上样总量为从相当于分子筛柱介质总量8-10倍的细胞培养原液所获得的疏水层析B峰量，上样体积为分子筛柱介质总量的1/50-1/100，分子筛层析介质为Sepharose 4FF，上样完毕后用含0.15M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液洗柱，收集乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白B峰。
6.根据权力要求1，2，3，4和5，分子筛柱层析获得的B峰含乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白，纯度大于95％，回收率大于40％。
全文摘要
工艺所属技术领域为生物技术和蛋白质纯化本发明建立了哺乳动物细胞CHO－dhfr－表达的含S和前S1乙肝表面融合抗原的纯化工艺流程:细胞培养原液→离子交换柱层析→疏水柱层析→分子筛柱层析,该工艺乙肝表面抗原S1和前S蛋白回收率高,纯度好,保持良好生物学活性,符合乙肝疫苗半成品检定要求。
文档编号C12N15/51GK1277206SQ00105730
公开日2000年12月20日 申请日期2000年4月4日 优先权日2000年4月4日
发明者李军, 阮力, 陈红, 王文, 田淑芳, 杨芙蓉, 宗芳, 张陵林 申请人:中国预防医学科学院病毒学研究所