专利名称：克隆高温元素硫氧化还原酶基因的引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及克隆基因的引物，特别是高温元素硫氧化还原酶基因的引物。
在地球的一些高温酸热地域，如火山口附近，酸热泉，以及一些矿区分布着能够仅依靠代谢硫获得其生存能量的微生物。由于这种特性，使得它们在生物冶金，煤炭脱硫以及环境保护等方面有着重要的应用前景。但是这些化能自养微生物，生长较慢，生物量低，一般情况下高温元素硫氧化还原酶的含量根本检测不出来。为了更好地利用它们，关键是使微生物能够在正常工业条件下产生大量此类高温元素硫氧化还原酶，因而首先需要准确地克隆到高温元素硫氧化还原酶基因。1992年德国人A.Kletzin首先从一个高温菌Desulfurolobusambivalens中克隆到元素硫氧化还原酶(sulfur oxygenase/reductase)基因(如图2所示)。但此后再无类似的基因报道。这主要可能是因为目前仅报道了通过纯化酶来克隆基因的方案，但该类菌属化能自养微生物，通常不容易获得大量菌体，因此纯化该酶较困难，进而导致克隆基因更困难。找到一种简单可行的克隆方法对于研究和应用高温元素硫氧化还原酶基因有非常重要的意义。为了更有效、省时、省力地克隆到高温元素硫氧化还原酶基因，设计出适当的引物，方便地获得克隆基因的探针是十分重要的。
本发明的目的是提供有效克隆高温元素硫氧化还原酶基因的引物，该引物用于PCR合成探针。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案克隆高温元素硫氧化还原酶基因的引物，它们是P13′端的前15个碱基为3-ACA ATG GTA CGT CTG的15-30个碱基的DNA片段P23′端的前15个碱基为3-TCG CGT ACT TAT CGT的15-30个碱基的DNA片段P33′端的前15个碱基为3-TCT CTT ATA AAT TTG的15-30个碱基的DNA片段使用的时候，包括它们的反向，可以两两组成引物对。
根据不同的情况，可以选择引物的具体长度和组成，它们可以是
P13′端的前18个碱基为3-ACA ATG GTA CGT CTG GAA的18-27个碱基的DNA片段P23′端的前18个碱基为3-TCG CGT ACT TAT CGT ATC的18-27个碱基的DNA片段P33′端的前18个碱基为3-TCT CTT ATA AAT TTG CTT的18-27个碱基的DNA片段使用的时候，包括它们的反向，可以两两组成引物对。
最佳的是P13-ACA ATG GTA CGT CTG GAA-5P23-TCG CGT ACT TAT CGT ATC GGA-5P33-TCT CTT ATA AAT TTG CTT GT-5使用的时候，包括它们的反向，可以两两组成引物对。
利用本发明的引物，可以将高温元素硫氧化还原酶基因从硫化叶菌属(Sulfolobus)、嗜酸两面菌属(Acidianus)和金属球菌属(Metallosphaera)微生物的总DNA中准确、高效地克隆出来，解决了化能自养微生物中很难克隆到高温元素硫氧化还原酶基因的问题，为高温元素硫氧化还原酶的工业化应用奠定了基础。
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明
图1为Acidianus tengchongensis S-5的高温元素硫氧化还原酶核苷酸序列图2为Desulfurolobus ambivalens的高温元素硫氧化还原酶核苷酸序列实施例11、选择引物P15-AAG GTC TGC ATG GTA ACA-3P25-AGG CTA TGC TAT TCA TGC GCT-32、克隆探针的制备(1)、以嗜酸两面菌属的Acidianus tengchongensis S-5(有关该菌的详细报道见钟慧芳等《微生物学报》22(1)1-7，1982)总DNA作模板，使用上面的引物对P1、P2进行PCR，反应条件如下退火温度48℃1分钟，延伸温度72℃2分钟，变性温度94℃1分钟，共30循环。
(2)、将上述PCR产物用柱式胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司生产)进行纯化。
(3)、经纯化后的产物进行地高锌(digoxigenin-dUTP)标记(BoehringerMannheim Inc.，Germany)，即可用作探针。
3、高温元素硫氧化还原酶部分基因文库的构建(1)、对供试菌总DNA用EcoR I内切酶进行完全消化，然后用上面制备的探针进行Southern blot分析，确定EcoR I切阳性片段大小。
(2)、回收该片段插入到pUC18质粒(华美生物工程公司生产)的EcoR I位点中构建成部分基因文库。
4、文库的筛选用上面标记的探针，按《分子克隆》(科学出版社，1996年第二版)中介绍的方法进行原位杂交和点杂交筛选文库，得到的阳性菌落质粒再进行EcoRI酶切和Southern杂交验证。
5、对克隆片段进行序列分析和开放阅读框分析，通过同源性比较得知供试菌的高温元素硫氧化还原酶基因读码框序列(如
图1所示)与已知基因碱基序列有81％的同源性，证明是该基因无疑。
实施例2步骤与实施例1相同，只是供试菌种为Acidianus brierleyi，DSM 1651；选择的引物为P13-ACA ATG GTA CGT CTG-5P23-TCT CTT ATA AAT TTG-5对克隆片段进行序列分析和开放阅读框分析，通过同源性比较得知供试菌的高温元素硫氧化还原酶基因读码框序列与已知基因碱基序列有80％左右的同源性。
实施例3步骤与实施例1相同，只是供试菌种为Sulfolobus metallicus，DSM 6482；选择的引物为P13-ACA ATG GTA CGT CTG GAA ACA-5P23-TCG CGT ACT TAT CGT ATC GGA ATG AGA-5对克隆片段进行序列分析和开放阅读框分析，通过同源性比较得知供试菌的高温元素硫氧化还原酶基因读码框序列与已知基因碱基序列有80％左右的同源性。
实施例4步骤与实施例1相同，只是选择的供试微生物为Metallosphaera sedula，DSM5348；引物为P13-ACA ATG GTA CGT CTG GAA TCT CTT ATA AAT-5P23-TCG CGT ACT TAT CGT ATC GGA TTG CTT CGA-5对克隆片段进行序列分析和开放阅读框分析，通过同源性比较得知供试菌的高温元素硫氧化还原酶基因读码框序列与已知基因碱基序列有80％左右的同源性。
权利要求
1.克隆高温元素硫氧化还原酶基因的引物，其特征在于它们是P13′端的前15个碱基为3-ACA ATG GTA CGT CTG的15-30个碱基的DNA片段P23′端的前15个碱基为3-TCG CGT ACT TAT CGT的15-30个碱基的DNA片段P33′端的前15个碱基为3-TCT CTT ATA AAT TTG的15-30个碱基的DNA片段使用的时候，包括它们的反向，可以两两组成引物对。
2.根据权利要求1所述的克隆高温元素硫氧化还原酶基因的引物，其特征在于所述的引物P13′端的前18个碱基为3-ACA ATG GTA CGT CTG GAA的18-27个碱基的DNA片段P23′端的前18个碱基为3-TCG CGT ACT TAT CGT ATC的18-27个碱基的DNA片段P33′端的前18个碱基为3-TCT CTT ATA AAT TTG CTT的18-27个碱基的DNA片段使用的时候，包括它们的反向，可以两两组成引物对。
3.根据权利要求1所述的克隆高温元素硫氧化还原酶基因的引物，其特征在于所述的引物P13-ACA ATG GTA CGT CTG GAA-5P23-TCG CGT ACT TAT CGT ATC GGA-5P33-TCT CTT ATA AAT TTG CTT GT-5使用的时候，包括它们的反向，可以两两组成引物对。
全文摘要
本发明公开了有效克隆高温元素硫氧化还原酶基因的引物,该引物用于PCR合成探针,可以高效地从化能自养微生物中克隆到高温元素硫氧化还原酶基因,这些引物是P1:3端的前15个碱基为3－ACA ATG GTA CGT CTG的15－30个碱基的DNA片段;P2:3端的前15个碱基为3－TCG CGT ACT TAT CGT的15－30个碱基的DNA片段;P3:3′端的前15个碱基为3－TCT CTT ATA AAT TTG的15－30个碱基的DNA片段;使用的时候,可以两两组成引物对。
文档编号C12Q1/26GK1331302SQ0010950
公开日2002年1月16日 申请日期2000年6月29日 优先权日2000年6月29日
发明者何正国, 李雅芹, 周培瑾 申请人:中国科学院微生物研究所