专利名称：前列腺素e1原料药生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种原料药的生产工艺，特别是指前列腺素E1原料药的生产工艺。
目前，国内前列腺素E1(简称PGE1)原料药的生产为实验室性质的玻璃容器中手工生产，不仅产量低，而且杂质含量高，临床副作用大。有的虽然已形成工业化生产，但生产周期长，从投料到出精品原料药要7～15天。在国际上，如德、美、日等国均已对前列腺素E1原料药进行工业化生产。但产品的纯度、成本、价格、年产量、生产周期等并不理想。
本案申请人曾于95年提出过一种前列腺素E1原料药的生产工艺，并已申请专利，见CN951。该工艺的过程是(1)用精制哺乳动物精囊的微粒在离心机中实现复合酶纯化，送入生化反应器；(2)在生化反应器中进行酶催化反应，再将其送入稀释器中；(3)在稀释器中加入丙酮及柠檬酸，使反应终止，提取PGE1溶液，并将提出的溶液送入自动分离机；(4)分离出固体酶蛋白和水，浓缩得PGE1粗制晶体；(5)进行PGE1的精制；(6)在层析柱中进行柱层析，将收集的纯PGE1溶液进行结晶纯化，获得最终产品。该工艺在其产品纯度、生产成本、生产周期等方面均优于目前国内外现有生产方法，特别是在生产周期上与德、美、日等国相比缩短了6倍。但该生产工艺中PGE1溶液的结晶纯化利用了层析柱，使得生产成本仍较高，生产周期较长，另外浓缩丙酮提取液造成产品变质及含量递降重大缺陷。
本发明的目的是在上一研究成果的基础上，进一步挖掘潜力，提供一种新的前列腺素E1原料药生产工艺，以进一步提高产品质量，降低生产成本，革除柱层析，避免浓缩丙酮提取液造成产品变质及含量递降的缺陷，进一步缩短生产周期，并可连续大规模工业化生产。
本发明提供的前列腺素E1原料药的生产工艺，包括以下步骤(1)用W1-7骨架镍把羊精囊中复合酶进行固相化复合，送入生化反应器；(2)在生化反应器中加入磷酸盐缓冲液，固相化复合酶、半胱胺盐酸盐、氢醌通入纯氧维持反应器内压力0.005～1.000Mpa；一边连续通入磷酸盐缓冲液一二高—r—亚麻酸溶液，一边连续流出反应液，连续进行酶催化反应，流出反应液进入膜分离器中；(3)在膜分离器中加入提取剂二氯甲烷—RX复合溶剂，其中R包括CH3—～C6H13—；X包括—OH，—O—C2H5，—C—O—C2H5。
控制分子量小于500的有机物质分子通过，大于500以上分子量有机蛋白质拦截分离，分离出有机蛋白质作饲料添加剂，分离出反应液复合溶液，送入减压浓缩器中；(4)在减压浓缩器中减压薄膜蒸发复合溶剂，得前列腺素E1粗品，将粗品送入结晶器中结晶纯化；(5)在结晶器中用三元复合溶剂H2O—R1X—R2X或二元复合溶剂H2O—R1X将前列腺素E1溶解，结晶纯化；上述三元复合溶剂和二元复合溶剂中R1包括CH3—～C6H13—烷基；R2包括C2H5～C8H17—烷基；X包括—OH，—O—C2H5，—C—O—C2H5基团。
为了便于审查员清楚明了本发明所提供的技术方案，现对其作进一步说明。
本发明提供的前列腺素E1原料药的生产工艺如下1、固相复合酶制备(1)冬天在屠宰场取出刚发育成熟的公羊的贮精囊，离体后除去脂肪和其他结缔组织、肌肉，立即在冷藏柜中冷冻贮存和运输。
(2)称取12～15公斤的冷冻羊精囊，用体积比1∶1的0.154摩尔/升的氯化钾水溶液迅速浸洗，主即倒去洗液。
(3)再用15～19升的0.154摩尔/升浓度的温度为0℃—10℃的氯化钾水溶液浸泡的羊精囊立即在立体胶体磨中粗磨一次，再精磨一次成1um～2um颗粒，制成匀浆。
(4)匀浆在离心机中于3000～9500转/分转速进行第一次离心25分钟。
(5)取出离心杯中上层清液，除去油脂，用2摩尔/升柠檬酸液调PH值4.0～5.0，再次在离心机中于3000～9500转/分转速离心25分钟。倒出上层清液，取出下层湿酶称重，便制得纯化复合酶。
(6)计算湿酶的n值2、酶促反应操作(1)底物反应液配制按重量配方二高—r—亚麻酸0.10％—0.60％(反应底物)半胱胺盐酸盐0.50％—0.80％(辅酶因子)氢醌0.001％—0.005％(活化因子、抗氧剂)磷酸盐冲液98.595％—99.399％600ml×n(体积量)磷酸盐缓冲液98.595％—99.399％600ml×n(体积量)以上总重量为百分之百。其中磷酸盐缓冲液体积(毫升)，为复合湿酶重量(克)2倍。
配方说明a.磷酸盐缓冲液为0.1摩尔/升浓度且其中加入10％体积的乙二胺四乙酸二纳盐(EDTA)饱和水溶液。
b.磷酸盐缓冲液配制磷酸二氢钾(分析纯)2.90克和磷酸氢二钾(分析纯)88.00g溶解成2000ml水溶液，PH8.0±0.1；EDTA(分析纯)46.5克溶于1000ml水中；每900ml磷酸盐缓冲溶液中加入100ml EDTA溶液作为投料用磷酸盐缓冲液。
c.半光胺盐酸盐也可用还原型谷胱甘肽代替，配方中所占的百分比基本相同。
(2)复合酶固相比①.W1-7骨架镍制备a.配料原料名称规格或技术要求投料重量比镍—铝合金粉含镍45—50％ 140目—60目氢氧化钠化学纯 1.5水 经G4砂芯滤过自来水 3(投料用水，洗水没计算在内)b.制备W1-7骨架镍在滤过的投料量自来水中加入投料量氢氧化钠溶解完全，并使溶液冷却至30℃；逐渐加入镍—铝合金粉，反应时产生大量的氢气放出，同时反应液温度升高；控制反应液温度低于75℃下逐渐加完镍—铝合金粉，控制加入速度不冲料；加完料，使反应物湿度升至105—110℃，压力0.2MPa保温反应1小时自然降温至60℃，用夹套冷却水冷却料温至30℃，用滤过自来水洗至料液PH值为6.5—7.0制得还原活性在W1至W7间的W1-7骨架镍。
将W1-7镍在充氮气环境下，抽真空，充氮气，再抽真空，充氮气连续三次，将W1-7骨架镍吸附氢气抽出，取样在空气中不会燃烧(发生火花)止，用饱和EDTA水溶液浸泡待用。
②、复合酶固定取2倍湿酶重量的沥去浸液的W1-7镍备用(要扣除其吸收占重量40％水)。
用辅酶因子液将湿酶匀浆(辅酶因子液配制分析纯还原型谷胱甘肽以湿酶重量计算n×1.0～2.0g；氢醌(分析纯)n×0.05g，n值为前面述计算湿酶重n值，两者溶于湿酶等体积的0.1摩尔/升磷酸盐缓冲液中)。
将用不锈钢加工制成大布氏漏斗底层以二层绸布一层滤纸作过滤介质。过滤布上面用W1-7骨架镍先铺一层约2mm厚度。再将全部投料用骨架镍倒入湿酶匀浆中搅拌均匀。将混和物倒入漏斗中抽滤。再用滤液重洗匀桨容器内壁，洗液倒入布氏漏斗中抽滤，复合酶已固定到W1-7骨架镍孔中。用两个大小与吊篮大小配套的丝绸滤布袋装好固定化复合酶，袋中留一定空间扎紧袋口，两袋固定化复合酶连袋平铺满两吊篮，不留空隙，两吊篮在吊篮支架上整体吊入生化反应器中，再把滤液渗透到两袋W1-7镍固定的复合酶中，渗出滤液存生化反应器底部待与反应液混合，W1-7骨架镍固定复合酶原理是表面吸附，靠分子间力维持。
③.本发明使用的生化反应器及吊篮图示结构说明
图1为生化反应器结构示意图。
1-筒体2-吊篮3-密封滤布4-吊篮支架5-固定板 6-循环泵 7-进气管 8-真空压力表9-放空管 10-配料罐 11-搅拌器
a.生化反应器为不锈钢板制椭园盖及封底和直径与高等长的筒体组合而成。
b.盖与筒体1由有密封槽及密封垫片的法兰用螺栓紧固密封，可拆开，罐底与筒体焊接。
c.用支架4固定上、下两个园形相等大小的吊篮2系用不锈钢丝网制成。吊篮直径略小于反应器内径，吊篮厚度为反应器半径二分之一，两吊篮上、下间隔为吊篮厚度尺寸。上吊篮之上吊篮厚度尺寸高处有一个大进液喷淋头，喷淋头筛板面直径为吊篮直径的四分之三。下层吊篮下面有进气管7偏离罐底中心且管口朝下离罐底板15mm左右，进入的氧气在罐底反弹向上分散。反应液与氧气在固相化酶层呈气液逆向对流。
d.吊篮固定支架4上端有两个吊环，拿住两个吊环，支架与及两个吊篮都可整体进、出反应器。反应器中放入复合酶后，用磷酸盐缓冲液浸湿丝绸滤布3，并用此丝绸滤布扎紧且密封吊篮与罐壁间隙。使气、液都非得经过固相化复合酶层进行充分分散及接触。
e.反应器罐底中心有反应液导出管及阀门，罐顶有放空管9、真空压力表8、温度计装置。
④.W1-7镍固定化复合酶的优点a.反应物气、液、酶粒充分分散在镍骨架空洞中，三者又充分地吸附在镍空洞中，氧气、底物与酶催化活性中心接触机率、比表面积、接触后催化效果远比由搅拌产生的要强得多，反应速率要提高2-4倍。
b.可避免因剧烈搅拌(分散氧、酶)产生剪接力对酶的损害及酶失活，自溶。可达到延长复合酶活性时间，可连续反应2-3批，使占原料成本90％的复合酶成本大幅度降低。
c.加压可使反应液中氧含量增大，加之W1-7镍吸附氧分子形成原子离子成分倾向大增。所需要的反应速度大增，杂质少，产品质量好，收率高，副作用小。
d.骨架镍吸附酶用后可制饲料蛋白，W1-7骨架镍经处理可反复使用。
(3)酶促反应操作在生化反应器中边通入纯氧，边导入反应液(配制好的磷酸盐缓冲液一二高—r—亚麻酸溶液)，边导出反应液(待反应器底有一定反应液存积时)，导出反应液与进入反应液体积基本相等，并维护反应器氧气压力0.005—1.000MPa，反应温度为0—58℃，将前10分钟导出的反应液重加入反应器中再反应一次，待此部份反应液反应毕，计反应液体积为12×600ml以上体积时，终止反应，(固相复合酶若有活力，仍可再进行1-2批反应)终止反应后反应液进入膜分离器中。
3、提取操作及粗品制备在膜分离器中加入反应液体积3—5倍体积的提取剂二氯甲烷-RX复合溶剂。其中R包括CH3—～C6H13—的烷基；X包括—OH，—O—C2H5，—C—O—C2H5基团。
控制分子量小于500的有机物质分子通过(前列腺素E1的分子量为354)，大于500以上分子量有机蛋白质拦载分离。分离出有机蛋白作饲料添加剂，分离出反应复合物溶液调PH值3.0—4.5后静止分层，将下层二氯甲烷—RX复合溶液送入减压薄膜蒸发器中减压蒸发。维持蒸发温度0～60℃，浓缩得到固体物PGE1粗晶。
4、精品制备将PGE1粗品用三元复合溶剂H2O-R1X-R2X或二元复合溶剂H2O-R1X进行结晶纯化，得纯品PGE1，纯度可达99.95％。
R1包括CH3～C6H13—的烷基；R2包括C2H5—～C8H17—的烷基；X包括—OH，—O—C2H5，—C—O—C2H5基团。
被拦载的分子量大于500的蛋白质用于作饲料添加剂。
将本工艺方法的生产规模，生产周期，生产成本以及得到的产品纯度与现有技术比较列表如下 本发明提供的工艺与国内外现有生产前列腺素E1的工艺比较，其优点在于1、本发明工艺生产的产品纯度高，疗效好，无毒，副作用轻微。生产中无三废排放，不使用易燃易爆溶剂，保证生产安全。
2、本发明工艺以连续化工业生产代替间断性手工生产，采用固相化复合酶，加压酶促反应、膜分离、二元、三元复合溶剂结晶纯化等现代技术，产率高，劳动强度小，生产成本降低30％以上。
3、简化生产工序，缩短生产周期，国外全合成要49天，国内为7～15天，本发明工艺仅为4天。
4、浓缩收集复合溶剂可套用，分离出有机蛋白可作饲料蛋白，W1-7骨架镍可反复使用。
5、从羊精囊中制取复合酶固相化后，可反复使用，催化效率高，缓和资源紧缺矛盾，可工业化生产。
下面提供本发明的实例。
实施例一按前所述制备复合酶操作以12公斤精制羊精囊(不带脂肪及结缔组织等)制成复合湿酶重3000克，并把3000克复合酶制成固相化复合酶。
固相化复合酶制备配料谷胱甘肽(还原型)11.0克(10.0×1.1克)氢醌0.50克(10.0×0.05克)磷酸盐缓冲液3000ml(与复合酶等重量，视此液比重为1)磷酸盐缓冲液浓度为0.1摩尔/升，且其中混有10％体积的EDTA绝和液，PH7.9.
以上四者混合成匀浆与扣除水分的6000克W1-7骨架镍按前面所述操作制成固相化复合酶放入生化反应器吊篮中备用。
配制磷酸盐缓冲液一二高—r—亚麻酸溶液二高—r—亚麻酸纯度98％12.5克 占0.20％半胱胺盐酸盐 分析纯 15.0克 占0.25％氢醌 分析纯 0.30克 占0.01％磷酸盐缓冲液0.1摩尔/升，PH7.9 6000ml占99.54％总100％磷酸盐缓冲液中含10％体积的EDTA饱和液，视此混合液比重为1，其量的复合酶重量2倍。
按说明书述及磷酸盐配制方法配制磷酸盐缓冲液并把上述物质溶解于投料量的磷酸盐缓冲液中。在配料罐中配料并预热到36℃备用。
向生化反应器中充纯氧，维持反应器内压力0.05MPa，达反应压力后向反应器内喷淋反应底物的磷酸盐缓冲液。25分钟内泵完配好的反应底物溶液，泵入反应液10分钟后开始边泵入边泵出反应液，且泵入泵出反应液速度基本相等。前10分种泵出的反应液又复泵入反应器中，反应器中反应温度维持在30℃—35℃。反应液体积为6000ml，加上固相化复合酶用的辅酶因子液3000ml，当泵出的反应液在12×6000ml以上，即7200ml以上后停止通氧气，终止反应。把反应液全部泵出，反应液泵至膜分离器前存液器内，用2摩尔/升柠檬酸液调PH植3.0—4.0，加入反应液体积2倍量的RX溶剂，搅拌，再加入以应液体积3倍量的二氯甲烷，搅拌，静止分层，先把底层提取液进入膜分离器中拦载分子量大于500的蛋白质，分离大分子后的混合提取液再在分离器后存液器内静止分层，再泵入液一液分离器内，再把水分除尽。除尽水及蛋白质的提取液送入减压薄膜蒸发器中于60℃次下温度蒸发浓缩，得PGE1粗品。冷却收集混合溶剂可套用。
PGE1粗品在二元复合溶剂H2O—R1X中于60℃水溶中加热溶解成饱和液后，再缓缓滴入溶剂R2X使液体少部分出现混浊为止。再自然冷却至室温，再放入冰柜中冷冻结晶。制得PGE1精品，纯度99.95％。
R1包括CH3～C6H13—的烷基；R2包括C2H5—～C8H17—的烷基；X包括—OH，—O—C2H5，—C—O—C2H5基团。
实施例二配制二高—r—亚麻酸溶液二高—r—亚麻酸0.20％，半胱胺盐酸盐0.40％，氢醌0.0015％，加上磷酸盐缓冲液量总共100％(重量)。其它条件均不变，按上述工艺进行生产，最终得到PGE1精品，纯度达99.95％。
权利要求
1.一种前列腺素E1原料药生产工艺，其特征在于按以下步骤进行(1)用W1-7骨架镍把羊精囊中复合酶进行固相化，送入特制生化反应器；(2)在特制生化反应器中加入磷酸盐缓冲液一二高—r—亚麻酸溶液、固相复合酶、半胱胺盐酸盐、氢醌、通入纯氧维持反应器内压力0.005～1.000MPa；一边连续通入磷酸盐缓冲液一二高—r—亚麻酸溶液，一边连续流出反应液，连续进行酶催化反应，流出反应液进入膜分离器中；(3)在膜分离器中加提取剂二氯甲烷—RX复合溶剂，其中R包括CH3—至C6H13—的烷基；X包括—OH，—O—C2H5，—C—O—C2H5等基团；控制分子量小于500的有机物质分子通过，大于500以上的分子量有机蛋白质拦截分离，分离出反应液复合溶液，送入减压浓缩器中；(4)在减压浓缩器中减压薄膜蒸发复合溶剂，得前列腺素E1粗品，将粗品送入结晶器中结晶纯化；(5)在结晶器中用三元复合溶剂H2O-R1X-R2X或二元复合溶剂H2O-R1X将前列腺素E1溶解、结晶纯化；上述三元复合溶剂及二元复溶剂中R1包括CH3—～C6H13—的烷基；R2包括C2HS—～C8H17—的烷基；X包括—OH，—O—C2H5，—C—O—C2H5等基团。
2.根据权利要求1所述前列腺素E1原料药生产工艺中进行酶催化反应时使用的生化反应器，其特征在于该反应器外壳由上盖及封底和直径与高等长的筒体组合而成，筒体内装设有吊篮，吊篮下部设有承受吊篮的固定板和吊篮支架，吊篮外缘与筒体间隙处设有密封滤布，筒体底部的反应液导出管与一循环泵相接，循环泵另由外界通至筒体内吊篮下方有一根开口向下的进气管；反应器的上盖连接有放空管、真空压力表和进液管，进液管和反应液导出管通至配料罐。
3.根据权利要求2所述的前列腺素E1原料药生产工艺中进行酶催化反应时使用的生化反应器，其特征在于吊篮由不锈钢丝网制成，吊篮厚度为反应器半径的二分之一，两吊篮上、下间隔为吊篮厚度尺寸。
全文摘要
一种前列腺素E
文档编号C12P31/00GK1330150SQ0010923
公开日2002年1月9日 申请日期2000年6月19日 优先权日2000年6月19日
发明者蔡海德 申请人:蔡海德