专利名称：涅氏短状杆菌新菌株及其所产酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种涅氏短状杆菌(Brachybacterium nesterenkovii)新菌株及其培养条件、生理生化特性和所产酶的制备方法。该新菌株已于2005年7月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM 205113。
背景技术：
涅氏短状杆菌(Brachybacterium)属首次发现于1988年(Collins M.D，Brown J，Jones D，et al.Brachybacterium faecium gene.Nov.，sp.nov.，a coryneform bacterium from poultry deep litter.Int.J.Syst.Bacteriol.，1988，3845～48.)，目前国内尚无报道。Brachybacterium属目前发现并且已经定种的有11种，未定种的26种。定种的11种分别是B.alimentarium，B.conglomeratum，B.faecium，B.fresconis，B.nesterenkovii，B.paraconglomeratum，B.rhamnosum，B.sacelli，B.Tyrofermentans，Brachybacterium arcticum和B.muris，。其中最早发现的是B.faecium和于1992年首次报道B.nesterenkovii相比，B.nesterenkovii的细胞壁结构缺少肽聚糖，因此B.nesterenkovii具有更好的基因序列。另外，两者DNA-DNA杂交结果表明它们的同源性只有22％。国外B.nesterenkovii菌株是从奶酪中分离得到的(Gvozdyak O.R，Nogina T.M，Schumann P.，et al.Taxonmic study of the genus BrachybacteriumBrachybacterium nesterenkovii sp.nov.Int.J.Syst.Bacteriol.，1992，4274～78.)。目前对于这种菌种的研究大多集中在基因和氨基酸序列的测定分析方面(Manabu Muto，Yoshiaki Hitomi.Acetaldehyde production by non-pathogenic Neisseria in human oral microfloraImplications for carcinogenesis in upper aerodigestive tract[J].International Journal of Cancer.2000，88(3)342～350.)，而对于它的功能和应用尚未有过研究报道。
另一方面，乙醇在人体内的代谢主要靠体内的两种酶一种是乙醇脱氢酶(AlcoholDehydrogenase，ADH)；另一种是乙醛脱氢酶(Aldehyde Dehydrogenase，ALDH)。前者使乙醇转化为乙醛，而后者则使乙醛转化为乙酸，最终分解为二氧化碳和水。一般来说，人体中都存在前一种酶，而且数量基本是相等的，但缺少后一种酶的人就比较多。ALDH的缺少，使乙醇不能被完全分解为水和二氧化碳，而是以乙醛的形式继续留在体内。目前，大量国内外的研究表明，乙醛在体内过度积累是醉酒的最主要原因。因此利用上述乙醛脱氢酶、乙醇脱氢酶的特性和功效开发有效的解酒药物具有较高的应用价值和市场前景。乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶虽可从一些动物的肝脏、胰腺等内脏进行提取，但提取过程较为复杂，成本高，不易规模化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是要培养筛选出一种涅氏短状杆菌(Brachybacteriumnesterenkovii)新菌株，并且应用该菌株产生和制备乙醛脱氢酶的方法。
本发明是从土壤中筛选得到一种涅氏短状杆菌(Brachybacterium nesterenkovii 1#)新菌株，它具有保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOM205113的样品特征。
该培养物已于2005年7月20日由中国典型培养物保藏中心收到，并登记入册。该培养物的存活性于2005年10月18日检测完毕，结果为存活。
本发明的涅氏短状杆菌新菌株其形态为短杆状，菌体呈浅黄色，大小为0.5～0.75×1.0～2.5μm，革兰氏染色呈阳性(见图1)，其透射电镜图(TEM)见图2、3；不产内生孢子也无运动性；同时该菌株能产过氧化氢酶、酯化酶；能够利用L-乳酸、乙酸、丙酮酸、α-酮基-戊二酸、D-半乳糖、龙胆二糖、α-D-葡萄糖，D-木糖等多种糖类物质能作为碳源，而苦杏仁苷、D-阿拉伯醇、纤维二糖、果糖海藻糖、D-半乳糖醛酸、m-肌醇、尿苷、D-阿洛酮糖、肌腺、腺苷和甘油等不能作为它的碳源；另外，L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺和丁二胺能作为它的氮源，而L-丝氨酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺不能作为它的氮源。
本发明应用该菌株产生和制备乙醛脱氢酶的方法为配制土壤溶液，梯度稀释，取稀释的土壤溶液200μl涂布到30μl牛肉膏培养基中，同时加入100μl～800μl乙醇诱导剂，然后置于30℃～40℃的温度下培养16h～48h(小时)，多次分离纯化培养；经镜检为单一菌株；然后经液体发酵，再对该发酵液超声波破碎，离心分离提纯后测其活性即成。
在上述培养条件下得到菌株产乙醛脱氢酶的活性最高可达到12.5U/ml。
上述方案中，超声波破碎的破碎功率p＝200w～800w，破碎时间t＝5min～25min；离心分离的转速N＝4000rpm，时间t＝5min～15min。稀释的土壤溶液浓度为10-5g/ml～10-3g/ml。分离纯化培养为3～6次。
本发明得到的菌株和国外已经报道过的B.nesterenkovii菌株在培养条件和来源上都不同，国外B.nesterenkovii菌株是从奶酪中分离得到的。而我们得到的菌株来源于微生物多样性很高的土壤，培养的工艺条件也较为简单易行。通过对本发明菌株生理生化特性的研究，该菌株还能产过氧化氢酶、酯化酶、乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶，它们都是具有经济价值的酶且活性较高，因此该菌株具有较高的应用价值和市场前景，可以利用它开发解酒的药物或保健品。
本发明的有益效果在于1、该菌株是一种能够产乙醛脱氢酶以及乙醇脱氢酶等多种酶的菌株。2、采用土壤微生物为原料培养菌株，培养方法简单易行，成本低廉，更有利于工业化生产。3、该菌株在37℃时活性较高，和人的体温相吻合，更有利于促使乙醇在人体内的代谢。
图1为本发明革兰氏染色后菌株菌体形态放大图。
图2为本发明菌株放大17×1000倍的细胞结构透射电镜扫描图(TEM)。
图3为本发明菌株放大7.5×1000倍的内部结构透射电镜扫描图(TEM)。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1称取5g NaCl，10g蛋白胨，3g牛肉膏，1000ml蒸馏水，16g～20g琼脂配制牛肉膏培养基；
配制1％(按重量计为0.01g土壤/ml水)的土壤溶液，梯度稀释，制取浓度为10-5g/ml的土壤溶液，取200μl稀释的土壤溶液加入到30ml牛肉膏培养基中，同时加入200μl～400μl的乙醇诱导剂，然后将此培养基于35℃～37℃温度下培养16h～36h；4～5次分离纯化培养，经镜检为单一菌株后于4℃斜面保藏。该菌株的生理生化特征请详见表1。
将筛选得到的菌种由斜面接到30ml(250ml三角瓶)含有5gNaCl，10g蛋白胨，3g牛肉膏，1000ml蒸馏水的发酵液中，加入200μl～400μl乙醇诱导剂，于35℃～37℃、150r/min下培养4d～6d(天)，得到我们所需要的乙醛脱氢酶，再对该发酵液破碎(p＝600w，t＝10min)、离心分离(N＝4000rpm，t＝5min～8min)提纯，测其活性，达12.5U/ml。
实施例2称取5g NaCl，10g蛋白胨，3g牛肉膏，1000ml蒸馏水，16g～20g琼脂配制牛肉膏培养基发酵液。
配制浓度为10-4g/ml的土壤溶液，取200μl加入到30ml牛肉膏培养基中，同时加入200μl～400μl的乙醇诱导剂，然后将此培养基于30℃～37℃培养16h～36h。按实施例1的方法进行液体发酵，再对该发酵液超声波破碎，离心分离提纯后测其活性。经镜检为单一菌株后测其菌株的产乙醛脱氢酶活性达8.3333U/ml。
实施例3称取5g NaCl，10g蛋白胨，3g牛肉膏，1000ml蒸馏水，16g～20g琼脂配制牛肉膏培养基发酵液。
配制浓度为10-4g/ml的土壤溶液，取200μl加入到30ml牛肉膏培养基中，同时加入200μl～400μl的乙醇诱导剂，然后将此培养基于30℃～37℃培养16h～36h。按实施例1的方法进行液体发酵，再对该发酵液超声波破碎，离心分离提纯后测其活性。经镜检为单一菌株后测其菌株的产乙醛脱氢酶活性达6.5789U/ml。
表1涅氏短状杆菌生理生化特性
权利要求
1.一种涅氏短状杆菌(Brachybacterium nesterenkovi)新菌株，其特征在于它具有保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOM205113的样品特征。
2.按权利要求1所述的涅氏短状杆菌新菌株，其特征在于所述的涅氏短状杆菌新菌株其形态为短杆状，菌体呈浅黄色，大小为0.5～0.75×1.0～2.5μm，革兰氏染色呈阳性，不产内生孢子也无运动性；同时该菌株能产过氧化氢酶、酯化酶；能够利用L-乳酸、乙酸、丙酮酸、α-酮基-戊二酸、D-半乳糖、龙胆二糖、α-D-葡萄糖，D-木糖等多种糖类物质能作为碳源，而苦杏仁苷、D-阿拉伯醇、纤维二糖、果糖海藻糖、D-半乳糖醛酸、m-肌醇、尿苷、D-阿洛酮糖、肌腺、腺苷和甘油等不能作为它的碳源；另外，L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺和丁二胺能作为它的氮源，而L-丝氨酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺不能作为它的氮源。
3.一种应用权利要求1所述的菌株产生和制备乙醛脱氢酶的方法，其特征在于配制土壤溶液，梯度稀释，取稀释的土壤溶液200μl涂布到30μl牛肉膏培养基中，同时加入100μl～800μl乙醇诱导剂，然后置于30℃～40℃的温度下培养16h～48h，多次分离纯化培养；经镜检为单一菌株；然后经液体发酵，再对该发酵液超声波破碎，离心分离提纯后测其活性即成。
4.按权利要求3所述的产生和制备乙醛脱氢酶的方法，其特征在于稀释的土壤溶液浓度为10-5g/ml～10-3g/ml，分离纯化培养为3～6次。
5.按权利要求3或4所述的产生和制备乙醛脱氢酶的方法，其特征在于超声波破碎的破碎功率p＝200w～800w，破碎时间t＝5min～25min；离心分离的转速N＝4000rpm，时间t＝5min～15min。
6.按权利要求3或4所述的产生和制备乙醛脱氢酶的方法，其特征在于配制1％的土壤溶液，取浓度为10-5g/ml的土壤溶液，加入200μl～400μl的乙醇诱导剂，将此培养基于35℃～37℃下培养16h～36h。
7.按权利要求3或4所述的产生和制备乙醛脱氢酶的方法，其特征在于将筛选得到的菌种由斜面接到30ml含有5g NaCl，10g蛋白胨，3g牛肉膏，1000ml蒸馏水的发酵液中，加入200μl～400μl乙醇诱导剂，于35℃～37℃、150r/min下培养4d～6d，得到所需要的乙醛脱氢酶。
全文摘要
本发明涉及一种涅氏短状杆菌(Brachybacterium nesterenkovi)新菌株及其培养条件、生理生化特性和所产酶的制备方法。该方法为配制土壤溶液，梯度稀释，取特定梯度的溶液200μl涂布到30μl牛肉膏培养基中，同时加入100μl～800μl乙醇诱导剂
文档编号C12R1/13GK1793328SQ20051001978
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月11日 优先权日2005年11月11日
发明者吴元欣, 薛永萍, 赵玉凤, 王存文, 池汝安, 朱圣东 申请人:武汉化工学院