专利名称：耐氯菌株3号的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种耐氯微生物的应用。
背景技术：
普通微生物对氯离子的耐受能力有限，一般情况下氯离子浓度小于4000mg/L时，微生物可以生长，不会受到明显的抑制作用。但是，如果氯离子浓度大于4000mg/L，则氯离子对微生物的抑制甚至毒害作用随氯离子浓度的提高而急剧显现，导致普通微生物不能生存。然而在自然界中，也存在着一些特种微生物，它们在含有高浓度氯离子，甚至是极端高浓度氯离子(5000-80000mg/L)的环境中可以正常生长，这类微生物可以称其为耐氯微生物。
但是，并非所有的耐氯微生物都可以应用于含高浓度氯离子废水的处理，必须经过严格的筛选和驯化才能得到既可耐受高浓度氯离子环境、又可降解废水中高浓度有机物的特种耐氯微生物。
发明内容
本发明的目的在于提供一株耐氯菌株3号的应用。
本发明所提供的耐氯菌株3号，为松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3，已于2005年10月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号CCTCCNO.M205121。
一株耐氯菌株3号的应用为一株松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3CCTCCNO.M205121应用于含高浓度氯离子废水的处理中。
所述的一株松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3应用于含高浓度氯离子废水的处理方法为挑取松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3单菌落，于SM培养基中培养过夜，按培养后的松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3∶含高浓度氯离子废水(如混合皂素废水)的体积比为0.5-2∶100取松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)B723-3接种于含高浓度氯离子废水(如混合皂素废水)中，20-40℃恒温培养，pH值为7-8，反应24-72小时。
所述的SM培养基为蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸馏水1000ml；固状琼脂20g；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
本发明从皂素废水池底污泥中筛选到一株在高浓度氯离子条件下具有一定生长能力的新菌株。一株耐氯菌株3号有良好的去除皂素废水中COD的能力，能在72小时之内去除废水中的COD 56.3％。
图1-1是菌株B723-3在液体SC培养基上生长情况2-1是菌株B723-3的PCR产物琼脂糖电泳图(1扩增产物，2核DNA，MMarker)图3-1是菌株B723-3菌落形态3-2是菌株B723-3菌株电镜图片图4-1是反应时间对COD去除率的影响4-2是接种量对COD去除率的影响4-3是反应pH值对COD去除率的影响4-4是摇床转速对COD去除率的影响图具体实施方式
一、一株耐氯菌株3号的筛选方法(一)、材料准备1、废水和池底污泥取自湖北省十堰方坤置业有限公司皂素废水调节池。
2、培养基SM培养基蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸馏水1000ml；琼脂20g(固)；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
SC培养基在SM培养基中，根据实验需要加入不同浓度(9万、8万、7万、6万、5万、4万、3万、2万、1万、0.5万mg/L)的氯离子。
3、实验仪器和设备国华SHA-B恒温振荡器，SHH150G光照生物培养箱，卧式压力蒸汽灭菌器------上海医用核子仪器厂，WMX-1型微波密封消解COD速测仪/-----汕头市环海工程总公司，722S分光光度计-----上海棱光技术有限公司，光学显微镜-----Olympus有限公司，pH计等-----Hana有限公司，超净工作台，鼓风干燥箱，KYKY-1000B扫描电子显微镜，PTC200型PCR仪，电泳仪及电泳槽，凝胶紫外观测仪，DDS-11型电导仪，(二)、菌株的筛选分离与纯化1)、初筛制备初筛菌悬液称取皂素废水调节池池底底泥样1g或皂素废水调节池内污水1mL接种于高压灭菌的SM培养基中，30℃-37连续培养30天进行富集，得初筛菌悬液；取初筛菌悬液20μl涂布于固体SM培养基；在初筛平板上挑取不同形态的单菌落在液体SM培养基中扩大培养，并进一步进行涂布分离，经多次(如10次)纯化、分离，最后得到不同菌落形态的纯平板；挑取纯平板的单菌落于SM培养基中，30℃恒温培养过夜，得分离菌悬液；2)、二次筛选制备复筛菌悬液在100ml浓度为9万、8万、7万、6万、5万、4万、3万、2万、1万或0.5万mg/L的氯离子的液体SM培养基内，加入初筛分离菌的分离菌悬液50μl，30℃恒温振摇5-7天，得复筛菌悬液；取复筛菌悬液20μl涂于固体SM培养基，30℃恒温培养1-2天，观察并记录细菌生长情况以及菌落形态；获得一株编号为菌株B723-3的菌株，即耐氯菌株3号。
所述的SM培养基为蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸馏水1000ml；固状琼脂20g；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
经过初步筛选和多次分离纯化，最后得到一株菌株B723-3，即耐氯菌株3号。菌株B723-3在液体SC培养基上生长情况如图1-1所示。
二、耐氯微生物菌株鉴定1、对耐氯性能较强的菌株B723-3的鉴定对耐氯性能较强的菌株B723-3进行了生理生化的鉴定以及16S rRNA分子的鉴定，从分子水平确定耐氯菌株的种属。
16S rDNA序列分析主要按照以下步骤1)提取细菌核DNA，a)集菌用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于LB液管内培养18小时，取其菌悬液1ml于1.5ml的离心管中8000rpm离心5min，弃上清液。
b)加STE 1ml洗一次，振荡重悬细菌，8000rpm离心5min，弃上清液。
c)加600μlTE，剧烈振荡重悬细菌，加入10％的SDS 65μl，65℃水浴5-10min。
d)加等体积酚氯仿抽提三次。
e)小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇和1/10体积的3MNaAc，12000rpm离心10min。彻底弃上清。
f)DNA沉淀用70％乙醇洗一次，风干后溶于20μlTE备用。
TE缓冲液10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)；1mmol/L EDTA-Na2(pH8.0)，STE缓冲液0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0)，2)16S rDNA基因的PCR扩增，PCR扩增引物参照Weisburg等人的方法合成。
P1正向引物5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’P2反向引物5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’在50μL反应体积中，加入1μL模板DNA(0.1μg)，0.5μLP1和P2(终浓度为0.5μM)，1μLdNTP(每种NTP0.2mM)，0.5μLTaq聚合酶(2U)和5μL 10×PCR缓冲液。PCR扩增条件为94℃预变性5min；在94℃变性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃终延伸10min。
3)PCR产物的回收将PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1.5ml离心管中加2倍体积TE，65℃水浴10分钟后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用70％乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。
4)16S rDNA的全序列测定和分析PCR测序用正反向引物参照Hiraishi等人方法合成。
P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC；P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
加入1μL模板DNA(＜0.1μg)，PCR扩增30个循环(94℃1min，55℃30s，72℃2min)。采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应。然后，在Applied Biosystem 373A DNA测序仪上测序。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与GenBank数据库比较分析，最终从分子水平上确定该菌的种属。
2、16S rDNA序列测定本发明采用对16SrRNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rRNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1515bp的扩增带(用1％琼脂糖凝胶电泳检测)，如图2-1所示。PCR产物经纯化后，测定其全序列。
<110>中国地质大学(武汉)<120>耐氯菌株3号的应用<160>1515<170>
<210>1<211>1515bp<212>DNA<213>松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)
<220>
<221>misc_feature<222>
<400>1agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcga60acagatgaga agcttgcttc tctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa120cctacctata agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat aatattttga180accgcatggt tcaatagtga aagacggttt cggctgtcac ttatagatgg acccgcgccg240tattagctag ttggtaaggt aacggcttac caaggcgacg atacgtagcc gacctgagag300ggtgatcggc cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtagg360gaatcttccg caatgggcga aagcctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtctt420cggatcgtaa aactctgttg ttagggaaga acaaatttgt tagtaactga acaagtcttg480cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt540ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagcgcgcgt aggcggtttc ttaagtctga600tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtgggagg gtcattggaa actggggaaa cttgagtgca660gaaaaaggag agtggaattc catgtgtagc ggtgaaatgc gcagaagata tggaggaacc720cccagtggcg aaagcggctc tctggtctgt aactgacgct gatgtgcgaa agcgtgggga780tcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct agtgttaggg840ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc900gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggag catgtggttt960aattcgaagc aacgcgaaga accttaccaa atcttgacat cctttgaccg ctctagagat1020agagtcttcc ccttcggggg acaaagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt1080cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct taagcttagt tgccatcatt1140aagttgggca ctctaggttg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca1200aatcatcatg ccccttatga tttgggctac acacgtgcta caatggataa tacaaagggc1260agcgaatccg cgaggccaag caaatcccat aaaattattc tcagttcgga ttgtagtctg1320caactcgact acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgtag atcagcatgc tacggtgaat1380acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagc1440cggtggagta accttttagg agctagccgt cgaaggtggg acaaatgatt ggggtgaagt1500cgtaacaagg taacc 1515三、菌落形态特征以及生理生化特性对菌株B723-3耐氯微生物菌株的菌落形态进行了仔细的观察，结果见图3-1。同时对菌表观也做了扫描电镜观察，结果见图3-2。
一株菌株B723-3的菌落形态菌落菌斑较大(5mm)、呈米黄色、规则圆形、缘齐、不透明、表面光滑、微凸，粘稠；生理特征球形，直径0.5～1.5μm，单个、成对或不规则堆状，革兰氏阳性；主要生化特征兼性厌氧，化能异养菌，接触酶阳性，氧化酶阴性，产生精氨酸双水解酶和脲酶等，从D-纤维二糖、D-岩糖、D-甘露醇、D-核糖、果糖、蔗糖产酸，不运动，不生孢，最适生长温度30～37℃。
四、菌株B723-3为新的菌株采用BLAST分析法对菌株B723-3的16S rRNA基因序列与GenBank数据库比较分析发现，菌株B723-3与松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)的同源性最高，为99.0％。
综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，菌株B723-3命名为松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3。查阅有关资料，尚无葡萄球属有关高浓度氯离子条件下难降解有机废水以及对其耐氯能力研究的报道。松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3为新的菌株，已于2005年10月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号CCTCC NO.M205121。
本发明从湖北省十堰皂素废水池底污泥中筛选分离出这一株细菌，并发现其有较好降解高浓度氯离子难降解皂素废水的功能。这拓宽了人们对松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)在其功能方面的应用研究思路，并为降解含高浓度氯离子皂素废水提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。
五、耐氯菌株3号的应用(一)、挑取松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3单菌落，于SM培养基中培养过夜，按培养后的松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3∶含高浓度氯离子废水(如混合皂素废水)的体积比为0.5-2∶100取松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3接种于含高浓度氯离子废水(如混合皂素废水)中，20-40℃恒温培养(最佳温度30～37℃)，振摇速度为100-180rpm，pH值为7-8，反应24-72小时；所述的SM培养基为蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸馏水1000ml；琼脂20g(固)；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
(二)、降解因素试验菌株B723-3的降解能力与接种量、振荡时间、转速、pH值等环境因素有关，改变反应时间、振荡转速、pH、接种量，来确定降解高浓度氯离子皂素废水的降解最佳条件，为微生物法处理高浓度氯离子废水的实际应用提供有用的工艺参数。以下的单因素多水平的实验中，除改变所研究的因素外，其余都按以下条件进行挑取菌株B723-3单菌落，于LB培养基中前培养过夜，取1mL接种于100ml混合皂素废水中([Cl-]2万mg/L左右，初始COD5400mg/L)，30℃恒温培养，振摇速度为150rpm，pH值为7.5，反应72小时测定废水中的COD值。
1)反应时间的影响取废水50ml加入250ml的锥形瓶中，加入经前培养的菌株B723-3的菌悬液。每隔24小时检测废水的COD值，试验结果图4-1。
从图4-1可以看出菌株B723-3对高浓度氯离子皂素废水COD的去除率随降解时间的增加而增加，当反应时间达到72h时，其COD去除率不再上升。此时的COD去除率为56.3％。
2)接种量的影响改变培养基的接种量分别为每100mL中废水中接入0.5、1.0、1.5、2.0mL的前培养物，其余条件不变，检测其COD去除率。结果如图4-2。
从图4-2可以看出，当接种量在0.5-2ml之间变化时，B723-3对COD的去除率无明显变化(47.78-56.3％)，当接种量为1ml时，其去除率最好。当接种量大于1ml时，随着接菌量的增加，降解率在72小时后并没有提高。这是因为菌株的生长需要一定的营养物质，接种量过大会导致细菌生长因相互竞争而受到抑制，从而影响降解效率的提高。
3)pH影响改变培养基的pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，其余条件不变，检测其COD去除率。结果如图4-3。
从图4-3可以看出，B723-3对COD的去除率随pH的增加先增加后下降，其最高去除率在pH为7-8时，达到56％左右。离心处理后的废水，发现pH为7-8时，湿菌体量明显高于pH为5、6和9时，可见在pH在中性偏碱时，有利于菌株的生长。
4)摇床转速的影响改变振摇速度分别为90、120、150、180rpm，检测其COD值。结果如图4-4。
从图4-4可以看出，转速对COD的去除有一定的影响，B723-3对COD的去除率随转速的增加先增加后下降，其最佳转速为150rpm。这是因为当转速增加时，提高了微生物与废水的接触率，致使COD的去除率会增加，但转速增加到一定速度时，细胞受到剪切力的作用而使其活性降低。
(三)、菌株B723-3对皂素废水降解能力取皂素生产混合废水，稀释一定倍数，使其COD为5400mg/L，[Cl-]为2万mg/L。取皂素混合废水50ml分别加入250ml的锥形瓶中，分别加入菌株的菌悬液1ml，30℃、150rpm、pH值＝7.1-7.5，摇床振荡3d，计算菌株对废水的COD和Cl-的去除情况，菌株B723-3去除COD的效率好，为56.3％。
菌株B723-3在高浓度氯离子(5000-80000mg/L)高COD(UASB-1反应器进水COD＝17000mg/L左右)条件下均有良好的去除皂素废水中COD的能力，其COD的去除率为56.3％。
权利要求
1.一株耐氯菌株3号的应用，其特征在于所述菌株的应用为松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3CCTCC No.M205121应用于含高浓度氯离子废水的处理中。
2.根据权利要求1所述的耐氯菌株3号的应用，其特征在于所述的一株松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3应用于含高浓度氯离子废水的处理方法为挑取松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3单菌落，于SM培养基中培养过夜，按培养后的松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3含高浓度氯离子废水的体积比为0.5-2∶100取松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3接种于含高浓度氯离子废水中，20-40℃恒温培养，pH值为7-8，反应24-72小时。
3.根据权利要求2所述的一株耐氯菌株3号的应用，其特征在于所述的SM培养基为蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸馏水1000ml；固状琼脂20g；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
全文摘要
本发明涉及一种耐氯微生物的应用。一株耐氯菌株3号的应用，其特征在于所述菌株的应用为松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723－3 CCTCC No.M205121应用于含高浓度氯离子废水的处理中。处理方法为挑取松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723－3单菌落，于SM培养基中培养过夜，按培养后的松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723－3含高浓度氯离子废水的体积比为0.5－2∶100取松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723－3接种于含高浓度氯离子废水中，20－40℃恒温培养，pH值为7－8，反应24－72小时。一株耐氯菌株3号有良好的去除皂素废水中COD的能力，能在72小时之内去除废水中的COD 56.3％。
文档编号C12N1/20GK1792889SQ20051001975
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月4日 优先权日2005年11月4日
发明者鲍建国, 王焰新, 刘慧 , 张彩香, 信欣, 李耀辰, 刘双, 李平, 张莉君 申请人:中国地质大学(武汉)