专利名称：一种卡介苗表达载体及其构建的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及表达载体，特征是涉及卡介苗表达载体。
背景技术：
卡介苗(Mycobacterium bovis bacilli Calmette Geurin，BCG)是世界卫生组织推荐的结核病预防用减毒活疫苗，其生产、制备和在临床应用的技术已相当成熟。从1921年发明到目前，全世界已有35亿人接种卡介苗，并证明是安全的。卡介苗免疫机体后，既刺激机体产生体液免疫应答，又可以诱导以CD4T淋巴细胞为主的细胞免疫应答。已有上100种的外源蛋白质或细胞因子在卡介苗中得以表达(Ohara N，et al.Vaccine，2001，194089-4098)，并将表达外源基因的重组卡介苗用于多种类型感染性疾病、肿瘤、变态反应性疾病等的预防和治疗，具有极为广阔的应用前景。
卡介苗表达系统包括胞内表达、胞膜表达和分泌表达三种方式。由于卡介苗是胞内寄生菌，其被巨噬细胞吞噬后，形成吞噬体，并在其中生长繁殖。卡介苗分泌产生的蛋白质抗原，被认为是经MHCI类分子途径，递呈给CD8T淋巴细胞，诱导产生CD8T淋巴细胞免疫反应；卡介苗胞膜或胞内的抗原，是经MHCII类分子途径，递呈给CD4T淋巴细胞，诱导产生CD4T淋巴细胞免疫反应。因此将外源基因在卡介苗中分泌表达建立的重组卡介苗菌株，既可刺激机体产生体液免疫应答，更重要的是，可同时产生CD4和CD8T淋巴细胞介导的细胞免疫反应，可特异性用于针对需要上述保护性免疫反应的传染病如结核病、AIDS(Aldovini A，etal.Nature(London)1991，351479-482)以及肿瘤(Yamada H，et al.J.Urol.2000，16452-531)等的防治，具有重要的实际应用价值。蛋白质的分泌需要有信号肽的参与。分枝杆菌种属特异性的限制，仅分枝杆菌自身蛋白的信号肽才能被卡介苗识别，已有M.kansasii或卡介苗α抗原(Lagranderie M，et al.J.Virol.1997，712303-2309；Gheorghiu M，et al.InfectImmun.1994，624287-4295.)、结核分枝杆菌抗原85A(Kremer L，et al.InfectImmun.1998，665669-5676.)、M.fortuitum β-lactamse(Langermann S，et al.Nature(London)1994，372552-555)、结核分枝杆菌抗原19kDa(Edelmana R，et al.Vaccine 1999，171272-1281)等成功用于引导外源基因的分泌表达。由于结核分枝杆菌在体外培养过程中产生的培养滤液蛋白，其主要的成分是抗原85B(Ag85B)(Belisle JT，et al.Science 1997，2761420-1422；)，并且Ag85B的信号肽序列已被克隆和证实(Harth G，etal.Infect Immun.1997，652321-2328)，相对于其他基因的信号肽具有明显优势，更能正确引导外源基因的分泌。分枝杆菌表达载体的种类很多，其中pSMT3是国内外广泛使用并被证实可靠的一种大肠杆菌-分枝杆菌穿梭细胞内表达载体(Harth G，etal.InfectImmun.1997，652321-2328；Golanska E，et al.Acta Microbiol Pol.1998；47335-343；He A，et al.Protein Expr.Purif.2004，35171-180)，其筛选标志为潮霉素(Hygromycin)抗性，可避免通常使用的氨苄青霉素或卡那霉素抗性在人体应用时可能出现的副作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够使外源基因在卡介苗中正确分泌表达的卡介苗表达载体，它是以大肠杆菌-分枝杆菌穿梭细胞内表达载体pSMT3为基础，利用结核分枝杆菌主要分泌抗原Ag85B的信号肽序列引导外源基因的分泌表达。
本发明所提供的卡介苗表达载体，本专利申请将其称为pDAF。
pDAF包括大肠杆菌复制起始点(Col E1 origin)、潮霉素(Hygromycin)抗性基因、分枝杆菌复制起始点(pAL5000 origin)、多克隆位点区(MCS)、结核分枝杆菌主要分泌抗原Ag85B的信号肽和卡介苗热休克蛋白Hsp60的启动子。
本发明所提供的卡介苗表达载体，含有大肠杆菌复制起始点(Col E1origin)、分枝杆菌复制起始点(pAL5000origin，来源于M.fortuitum)和潮霉素(Hygromycin)抗性基因(来源于Streptomyces hygroscopicus)。Col E1 origin可使载体在大肠杆菌中复制、增殖、表达载体构建和保存；pAL5000origin可使载体在卡介苗中复制、增殖，以及外源基因在卡介苗中表达；潮霉素抗性基因可使该载体转化的大肠杆菌或卡介苗对潮霉素产生抗性，用于重组转化菌的筛选。
本发明所提供的卡介苗表达载体，以卡介苗热休克蛋白Hsp60的启动子为诱导型启动子，受温度控制，温度在37℃或42到45℃诱导后才开始转录，翻译。37℃非常适合于外源基因在体内的表达；42-45℃适合于外源基因在体外的表达。
本发明所提供的卡介苗表达载体的多克隆位点区(MCS)包括BamHI、PstI、EcoRV、HindIII和ClaI酶切位点。
本发明所提供的卡介苗表达载体包含有序列表中序列1的核苷酸序列，该核苷酸序列为本发明卡介苗表达载体在构建中插入的片段，该插入片段包括Hsp60启动子(pHsp60)、抗原85B的信号肽序列(ag85B sp)和多克隆位点区，该该插入片段的核苷酸序列如下TCT AGA CGG TGA CCA CAA CGC GCC CGC TTT GAT CGG GGA CGT CTG CGG CCGACC ATT TAC GGG TCT TGT TGT CGT TGG CGG TCA TGG GCC GAA CAT ACT CACCCG GAT CGG AGG GCC GAG GAC AAG GTC GAA CGA GGG GCA TGA CCC GGT GCG
GGG CTT CTT GCA CTC GGC ATA GGC GAG TGC TAA GAA TAA CGT TGG CAC TCGCGA CCG GTG AGT GCT AGG TCG GGA CGG TGA GGC CAG GCC CGT CGT CGC AGCGAG TGG CAG CGA GGA CAA CTT GAG CCG TCC GTC GCG GGC ACT GCG CCC GGCCAG CGT AAG TAG CGG GGT TGC CGT CAC CCG GTG ACC CCC GTT TCA TCC CCGATC CGG AGG AAT CAC TTC GCA ATG GCC ACA GAC GTG AGC CGA AAG ATT CGA GCT TGGGGA CGC CGA TTG ATG ATC GGC ACG GCA GCG GCT GTA GTC CTT CCG GGC CTG GTG GGG CTTGCC GGC GGA GCG GCA ACT GCG GGC GCG GGA TCC CCC GGG CTG CAG GAT TCG ATA TCA AGCTTA以上序列中加粗的黑体区域表示Ag85sp所在区域，从379位A起始，到501位G，全长123bp，可引导外源基因的分泌表达。在表达的过程中，该信号肽段被从表达产物的N端切除。
本发明所提供的卡介苗表达载体的构建一、材料和方法载体pUC19和大肠杆菌DH5α，按标准常规方法保存。
大肠杆菌分枝杆菌穿梭表达质粒pSMT3由英国Imperial College School ofMedicine，Dr.Young DB提供，按标准方法转化大肠杆菌DH5α后，常规方法保存。
人工合成结核分枝杆菌H37Rv的抗原Ag85B的信号肽序列以及酶切位点读框并克隆于载体pMD18-T-85Bsp由上海生物工程公司合成。
结核分枝杆菌H37Rv菌株购自北京中国生物制品检定所，保存于改良罗氏培养基。
分泌表达外源基因人细胞因子IL-2和ESAT-6融合蛋白的卡介苗表达质粒pDIE由发明人构建(Fan X，et al.Chin.Med.J(Engl.).2005，118762-765)。
胶回收和质粒纯化试剂盒、限制性内切酶和DNAMarker等购自大连宝生物公司。
7H9、7H10和ADC营养基质购自Difico公司。
潮霉素购自Invitrogen公司。BCG购自成都生物制品所产品。
其余试剂为国产分析纯。
序列测定由上海基康公司完成。
载体的构建和表达证实等具体操作方法采用标准方法，参见《分子克隆实验指南第三版》(2002，科学出版社出版)，具体方法如下。
二、本发明载体构建包括以下步骤(1)人工合成结核分枝杆菌H37Rv的主要分泌抗原Ag85B的信号肽序列以及酶切位点读框并克隆于载体pMD18-T(即pMD18-T-85Bsp)。由上海生物工程公司合成。
(2)HindIII和BalI酶切消化pMD18-T-85Bsp后，用胶回收试剂盒按照说明书回收约150bp的小片段(见图1第2电泳道)，与同样酶切消化后的载体pSMT3的胶回收，按3∶1分子比，16度连接12-16h，低温CaCl2法转化大肠杆菌DH5α，涂布普通LB琼脂平板(含潮霉素50μg/ml)，筛选阳性克隆，提取质粒，大小在5.8kb，阳性命名为pDAF(见图4)。
验证以XbaI和HindIII酶切pDAF，酶切产生约5.1kb和540bp的小片段，酶切鉴定正确(见图4)。回收约540bp的小片段(见图4)，与同样酶切的载体pUC19连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并命名为pUCXH。pUCXH用XbaI和HindIII酶切，酶切鉴定正确(见图1第1电泳道)后，由上海基康公司测序，序列测定也表明序列是正确的。序列测定图见图2和图3，图2为正向测序图，图3为反向测序图。
所构建的表达载体pDAF的结构示意图见图5。
本发明载体分泌表达外源基因人细胞因子IL-2和ESAT-6融合蛋白采用标准的基因工程技术，利用本发明的载体，将IL-2和ESAT-6融合蛋白编码克隆入pDAF对应的读框，建立表达载体pDIE。将卡介苗在7H9中大量培养2w后，按1∶100的比例转接，培养至21d时，加入2M的甘氨酸(V/V＝10％)，继续培养2d，冰浴1h，10,000转离心5min，收集细菌，用10％的甘油洗涤三次后，分装置-70℃保存作为卡介苗感受态。将pDIE电穿孔法导入用冰冷的10％(v/v)甘油制备的5×106个卡介苗感受态细胞，卡介苗中进行分泌表达，电穿参数为0.4cm的电穿孔杯，电压2.5KV，电容25μF，电阻1000Ω。37℃培养24h后涂布于含ADC和潮霉素的7H10平板中，设空白质粒作为对照，37℃培养28～30d。结果在培养上清中利用SDS-PAGE和Western blotting证实有融合蛋白的表达，见图6。
图1为本发明涉及的载体pMD18-T-85Bsp和pUCXH的酶切鉴定，图中数字1对应的部分为质粒pUCXH用XbaI+HindIII酶切产生预期大约3000bp和540bp的两个片段；图中数字2对应的部分为质粒pMD18-T-85Bsp用BalI+HindIII酶切产生预期大约2500bp和150bp的两个片段。
图2为本发明的表达载体特征区的正向测序图。
图3为本发明的表达载体特征区的反向测序图。
图4为本发明的表达载体pDAF的酶切鉴定图，图中M表示的是DNA分子量标准，泳道1表示的本发明表达载体pDAF，泳道2表示的是本发明表达载体pDAF用XbaI和HindIII酶切后，产生预期大小为5.1kbp和540bp两个片段。
图5为本发明的表达载体pDAF的结构示意图。
图6为建立在本发明表达载体pDAF的外源基因IL-2和ESAT-6的表达质粒pDIE在卡介苗中分泌表达融合蛋白的鉴定，证实了表达的融合蛋白并分泌，主要存在于卡介苗的培养上清中。图中A所示部分表示融合蛋白在BCG中表达，42度诱导2小时，收集培养滤液蛋白的上清，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，结果为泳道1表示的pDIE转化的BCG的表达上清，泳道2表示的是原始BCG的上清，M表示蛋白质分子量标准，箭头表示泳道1出现了预期的21kDa融合蛋白的表达。图中B部分表示融合蛋白在BCG中表达，收集培养滤液蛋白的上清，进行SDS-PAGE后，用ESAT-6或抗人IL-2抗体进行免疫印迹实验(Western blotting)。泳道3表示pDIE转化的BCG的表达上清，在相应21kDa部位出现了条带，见箭头所示；泳道4表示原始BCG的上清，在相应部位未见该条带。
具体实施例方式
实施例1构建本发明表达载体材料和方法载体pUC19和大肠杆菌DH5α，按标准常规方法保存。大肠杆菌分枝杆菌穿梭表达质粒pSMT3由英国Imperial College School of Medicine，Dr.YoungDB提供，按标准方法转化大肠杆菌DH5α后，常规方法保存。人工合成结核分枝杆菌H37Rv的抗原Ag85B的信号肽序列以及酶切位点读框并克隆于载体pMD18-T-85Bsp由上海生物工程公司合成。结核分枝杆菌H37Rv菌株购自北京中国生物制品检定所，保存于改良罗氏培养基。分泌表达外源基因人细胞因子IL-2和ESAT-6融合蛋白的卡介苗表达质粒pDIE由发明人构建(Fan X，et al.Chin.Med.J(Engl.).2005，118762-765)。胶回收和质粒纯化试剂盒、限制性内切酶和DNA Marker等购自大连宝生物公司。7H9、7H10和ADC营养基质购自Difico公司。潮霉素购自Invitrogen公司。BCG购自成都生物制品所产品。其余试剂为国产分析纯。序列测定由上海基康公司完成。载体的构建和表达证实等具体操作方法采用标准方法，参见《分子克隆实验指南第三版》(2002，科学出版社出版)。具体方法和实施例如下构建步骤(1)人工合成结核分枝杆菌H37Rv的主要分泌抗原Ag85B的信号肽序列以及酶切位点读框并克隆于载体pMD18-T，即pMD18-T-85Bsp。由由上海生物工程公司合成。
(2)HindIII和BalI酶切消化pMD18-T-85Bsp后，用胶回收试剂盒按照说明书回收约150bp的小片段，见图1第2电泳道，与同样酶切消化后的载体pSMT3的胶回收，按3∶1分子比，16度连接12-16h，低温CaCl2法转化大肠杆菌DH5α，涂布普通LB琼脂平板，含潮霉素50μg/ml，筛选阳性克隆，提取质粒，大小在5.8kb，阳性命名为pDAF，见图4。
(3)以XbaI和HindIII酶切pDAF，酶切产生约5.1kb和540bp的小片段，酶切鉴定正确(见图3)。回收约540bp的小片段，见图4，与同样酶切的载体pUC19连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并命名为pUCXH。
(4)pUCXH用XbaI和HindIII酶切，酶切鉴定正确(见图1第1电泳道)后，由上海基康公司测序，序列测定也表明序列是正确的。序列测定图见图2和图3，图2为正向测序图，图3为反向测序图。
所构建的表达载体pDAF的结构示意图如图5所示。
实施例2本发明载体分泌表达外源基因人细胞因子IL-2和ESAT-6融合蛋白采用标准的基因工程技术，利用本发明的载体，将IL-2和ESAT-6融合蛋白编码克隆入pDAF对应的读框，建立表达载体pDIE。将卡介苗在7H9中大量培养2w后，按1∶100的比例转接，培养至21d时，加入2M的甘氨酸(V/V＝10％)，继续培养2d，冰浴1h，10,000转离心5min，收集细菌，用10％的甘油洗涤三次后，分装置-70℃保存作为卡介苗感受态。将pDIE电穿孔法导入用冰冷的10％(v/v)甘油制备的5×106个卡介苗感受态细胞，卡介苗中进行分泌表达，电穿参数为0.4cm的电穿孔杯，电压2.5KV，电容25μF，电阻1000Ω。37℃培养24h后涂布于含ADC和潮霉素的7H10平板中，设空白质粒作为对照，37℃培养28～30d。结果在培养上清中利用SDS-PAGE和Western blotting证实有融合蛋白的表达，见图6。
以下为序列表。
序列表<110>华中科技大学<120>一种卡介苗表达载体及其构建<130>1<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>537<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(379)..(501)<223>
<400>1tctagacggt gaccacaacg cgcccgcttt gatcggggac gtctgcggcc gaccatttac60gggtcttgtt gtcgttggcg gtcatgggcc gaacatactc acccggatcg gagggccgag120gacaaggtcg aacgaggggc atgacccggt gcggggcttc ttgcactcgg cataggcgag180tgctaagaat aacgttggca ctcgcgaccg gtgagtgcta ggtcgggacg gtgaggccag240gcccgtcgtc gcagcgagtg gcagcgagga caacttgagc cgtccgtcgc gggcactgcg300cccggccagc gtaagtagcg gggttgccgt cacccggtga cccccgtttc atccccgatc360cggaggaatc acttcgca atg gcc aca gac gtg agc cga aag att cga gct 411Met Ala Thr Asp Val Ser Arg Lys Ile Arg Ala1 5 10tgg gga cgc cga ttg atg atc ggc acg gca gcg gct gta gtc ctt ccg 459Trp Gly Arg Arg Leu Met Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro15 20 25ggc ctg gtg ggg ctt gcc ggc gga gcg gca act gcg ggc gcg 501Gly Leu Val Gly Leu Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala30 35 40ggatcccccg ggctgcagga ttcgatatca agctta 537<210>2<211>41<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Ala Thr Asp Val Ser Arg Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Arg Leu1 5 10 15
Met Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu Val Gly Leu20 25 30Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala35 40
权利要求
1.一种卡介苗表达载体，包括宿主复制起始点、抗性基因和分枝杆菌复制起始点pAL5000 origin，其特征在于包含有由卡介苗热休克蛋白Hsp60启动子、结核分枝杆菌抗原Ag85B的信号肽和多克隆位点区MCS组成的卡介苗内表达区，该卡介苗内表达区具有序列表中序列1的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的卡介苗表达载体，其特征在于所述的宿主复制起点为大肠杆菌复制起始点Col E1 origin。
3.根据权利要求1所述的卡介苗表达载体，其特征在于所述的抗性基因为潮霉素Hygromycin抗性基因。
4.根据权利要求1所述的卡介苗表达载体，其特征在于多克隆位点区MCS包括BamHI、PstI、EcoRV、HindIII和/或ClaI酶切位点。
5.一种卡介苗表达载体的构建方法，包括以下步骤a.人工合成结核分枝杆菌H37Rv的主要分泌抗原Ag85B的信号肽序列以及酶切位点读框并克隆于载体pMD18-T，得pMD18-T-85Bsp；b.HindIII和BalI酶切消化pMD18-T-85Bsp后，用胶回收试剂盒按照说明书回收约150bp的小片段，与同样酶切消化后的载体pSMT3的胶回收，按3∶1分子比，16度连接12-16h，低温CaCl2法转化大肠杆菌DH5α，涂布普通LB琼脂平板，含潮霉素50μg/ml，筛选阳性克隆，提取质粒，大小在5.8kb，得本发明卡介苗表达载体pDAF。
6.权利要求1所述的卡介苗表达载体在生产重组蛋白质中的应用。
7.权利要求1所述的卡介苗表达载体在制药中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种卡介苗表达载体，由大肠杆菌复制起始点Col E1 origin、潮霉素Hygromycin抗性基因和分枝杆菌复制起始点pAL5000 origin、卡介苗热休克蛋白Hsp60启动子、结核分枝杆菌抗原Ag85B的信号肽和多克隆位点区MCS构成，它能够使外源基因在卡介苗中正确分泌表达，利用本发明载体，能够将外源基因导入卡介苗中分泌表达，用于生产制备重组卡介苗或表达外源蛋白质。
文档编号C12N15/09GK1966689SQ20051001980
公开日2007年5月23日 申请日期2005年11月15日 优先权日2005年11月15日
发明者范雄林, 高倩 申请人:华中科技大学