专利名称：长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒株，属生物技术领域。
中国湖北省云梦县是全国最大的笼养鸟基地之一，九十年代初该地区年存笼种鸟数百万对，94-96年间高密集养殖的鹦鹉发生了前所未有的、高死亡率的急性传染病导致大规模鹦鹉幼雏死亡，死亡率超过80％；并迅速波及我国其他省鹦鹉养殖区，造成了巨大经济损失，使鹦鹉养殖陷入停滞状态。发明人从病死的雏鸟体内分离到一种病原(病毒)，对其形态结构、生化特性、核酸，蛋白分析和回归试验等方面进行了研究。1)按国际病毒分类标准，确定该株病毒为澳洲长尾小鹦鹉幼雏病病毒(Budgerigar fledging disease virus，BFDV)，归属于乳多空病毒科多瘤病毒属(Polyomavirus genus ofpapovaviridae)；2)发明人对该株病毒进行了生物学人工诱导培养使其BFDV强毒株成为BFDV弱毒株，可作为BFDV弱毒活疫苗的生产毒株。
长尾小鹦鹉幼雏病病毒(Budgerigar fledging disease virus，BFDV)的主要生物学特性病毒粒子无囊膜，直径45～50nm，呈二十面体对称球形颗粒；对热、冻融和氯仿、甲醛、乙醚等化学试剂具有稳定性；病毒外壳为结构蛋白，分子量在14，500～60，000道尔顿，病毒的碱性氨基酸和酸性氨基酸之比为1∶2．5，富含Asp、Glu和Leu，Arg和met含量较少；病毒核酸是双链DNA；核酸G+C的含量为45％，核酸分子量为3．3×106d；热变性温度Tm值得到核酸G+C的含量为45％；病毒回归试验证明该病毒是引发长尾小鹦鹉幼雏病的病原；与澳洲长尾小鹦鹉幼雏病病毒的M7株阳性血清出现交叉反应，证明与M7株有抗原相关性。
迄今，国内尚无对鹦鹉幼雏病进行疫苗防治的研究报道。德国墨尼黑大学Müller教授、美国的禽病学家曾提出BFDV-DNA对甲醛具有稳定性，对Ethylenimine(乙烯亚胺)敏感，而该试剂具有较强的致癌性；而且燃点为42℃，极不安全。90年代德国和美国的研究在重组BFDV-VP1结构蛋白，拟进行BFDV基因工程疫苗的研制。从目前查新检索报告中未发现有相关BFDV弱毒株的资料。
本发明是为长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗提供了一种生产毒株。在通过物理、化学和其他生物诱导方法的选择实验后，确定采用生物学人工培育诱导弱毒株，使BFDV强毒株转变为弱毒株。弱毒株的特点是丧失对鹦鹉的致病力，保留良好的免疫原性，安全性好。用此弱毒株生产的疫苗可有效地预防长尾小鹦鹉幼雏病毒病。
为达到上述目的，本发明采用生物学人工诱导培养BFDV强毒株成为弱毒株的技术方案是将BFDV强毒接种于鹦鹉胚成纤维细胞适应性传代5-6代，再转接到鸡胚成纤维细胞盲传30代～42代，培养温度为37-39．5℃；以细胞病变为病毒的效价指标，以病毒抗原性检测和病毒回接试验判定弱毒指标。
实施例其步骤如下1．鹦鹉胚成纤维细胞的制备采用9-10日龄鹦鹉胚，在无菌条件下取出胚体，匀浆；加入pH7．5 5％胰蛋白酶消化液，混匀，置37℃水浴消化40分钟，取出离心弃消化液；光镜下计数细胞数达1×107／ml；分装在100ml细胞培养瓶，加10％小牛血清M199组织培养液10ml，37℃培养16-18小时细胞形成单层。
2．取长尾小鹦鹉幼雏病毒强毒按5％接种鹦鹉胚成纤维细胞(单层)，置38℃(37～39℃均可)；不产生明显的细胞病变。盲传5～6代后，转接到鸡胚成纤维细胞。
3．鸡胚成纤维细胞的制备取9～10日龄鸡胚，其他方法同1。
4．取2．的病毒液，按5％接种到单层鸡胚成纤维细胞，置38℃(37～39℃均可)；培养24-72小时出现细胞病变，细胞变长，细胞核肿胀、细胞间出现明显拉网，从而判定病毒效价。收集48-72小时的病毒液(在此时间范围内选择细胞病变明显的收集)；在鸡胚成纤维细胞传代培养30代～42代得到的BFDV弱毒株。保藏编号为CCTCC NOV99006。
5．采用免疫琼脂扩散法检测病毒液效价，以出现明显免疫沉淀线为阳性。
6．回接试验试验组将BFDV弱毒0．2ml／只接种鹦鹉，14天用BFDV强毒0．2ml／只接种鹦鹉，观察20天，鹦鹉健康存活。
对照组将BFDV强毒0．2ml／只接种鹦鹉，10天内鹦鹉发病死亡。
BFDV弱毒株除具有与BFDV病毒强毒株形态学和理化特性相同外，还具有以下重要的生物学活性(1)第30～42代的BFDV已丧失对其原宿主动物(鹦鹉)致病力，保留了良好的免疫原性。
(2)弱毒活疫苗一次免疫即可成功，可采用自然感染途经接种，可引起整个免疫应答，产生广谱性免疫及局部和全身性抗体。
(3)免疫力持久，有利于清除局部野毒。
BFDV弱毒株作为BFDV弱毒疫苗生产毒株时，具有以下优点①保留有BFDV良好的免疫原性，接种后能引起整个机体和局部产生特异性免疫抗体，对BFDV感染具有较好的预防作用。
②免疫效果好、安全性好；免疫效力试验的免疫保护率99．7％。
③生产工艺简便、生产成本低，不需要高浓度的抗原物质，只需采用鸡胚细胞增殖培养BFDV弱毒株，获得具有一定效价的病毒液既可配制疫苗，比基因工程疫苗的成本低数百倍，比亚病毒疫苗的生产成本也低数十倍，且不需使用成本高而又有致癌性的灭活剂。
④实用性强和便于接种，不需采用注射接种；可采用自然感染途径如滴鼻、喷雾、饮水等。
权利要求
1．一种长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒株(Budgerigar fledgingdisease virus)CCTCC NOV99006，其特征是A．将BFDV强毒接种于鹦鹉胚成纤维细胞适应性传代5-6代；B．转接于鸡胚成纤维细胞适应性培养，培养温度为37～39．5℃；C．培养24～72小时出现细胞病变，细胞变长，细胞核肿胀，细胞问出现拉网，从而判定病毒的效价；D．在鸡胚成纤维细胞传代培养30-42代得到的BFDV弱毒株。
全文摘要
本发明公开了一种长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒株,其步骤是:首先将BFDV强毒接种于鹦鹉胚成纤维细胞适应性传代5－6代;其次是转接于鸡胚成纤维细胞适应性培养,37~39.5℃为培养温度;第三是培养24~72小时可出现明显细胞病变,细胞变长,细胞核肿胀,细胞间出现明显的拉网,可从而判定其病毒的活性效价;第四是在鸡胚成纤维细胞传代培养30代后得到BFDV弱毒株。本发明有良好的免疫原性,免疫力持久,免疫效果好、安全可靠,作为BFDV弱毒疫苗生产时,工艺简便,生产成本低。
文档编号C12N7/08GK1289843SQ00114488
公开日2001年4月4日 申请日期2000年4月17日 优先权日2000年4月17日
发明者李天宪, 陈绳亮, 冯峰, 夏韦, 赵林 申请人:中国科学院武汉病毒研究所