专利名称：能在盐化土壤中生长的抗胁迫、超大转基因植物的制作方法
相关申请本申请要求以下相关申请的权益由Roberto Gaxiola于1999年11月10日提出的名称为“质子转运蛋白及其在植物中的应用”的美国临时申请60/164,808；由Roberto Gaxiola于2000年8月22日提出的名称为“质子转运蛋白及其在植物中的应用”的美国专利申请09/644,039以及由Roberto Gaxiola于2000年8月18日提出的名称为“抗干旱、抗冷冻转基因植物”的美国临时申请60/226233，这些申请所包含的全部内容都以参考文献的形式被收录在此。政府支持在此所描叙的发明全部或部分由国立卫生研究院(NationalInstitute of Health)批准号GM52414、DK54214、DK43495、DK51509、DK34845、GM35010及由国家科学基金批准号MCB9317175提供支持。政府在本发明中拥有一定的权利。
2.相关领域背景进入新世纪后，养活整个人类的前景堪优。随着世界人口的不断增长，农业研究一个主要目标是提高作物产量。同样，园艺研究的一个主要目标是培育作物以外的强抗性植物，如观赏植物、牧草、灌木以及其它发现有利于人类或能娱悦人的植物。
直到最近，作物和园艺植物的改良都有赖于对携带目标性状的植株进行选择育种。然而，这种选择育种技术通常不太令人满意，因为许多植株含有异种遗传成分而使其目标性状和亲本不一样。
分子生物学的发展已经允许人类对动植物种质进行操作。植物遗传工程需要分离和操作遗传物质(其典型形式为DNA或RNA)，其后将此遗传物质导入植物中去。使用这种技术培育了抗虫性增强的植物、能产生药物与其它化学物质的植物及表达有利性状的植物。有利的是，这种植物不仅包含有用基因，而且是可育的。
植物科学一个特别重要的新领域是培育胁迫抗性提高的植物。一般来说，植物都拥有和维持着保证其在不利环境条件下生存的适应机制。植物普遍遭受到的两类的胁迫是冷冻和干旱，它们都和细胞脱水有关。已知某些植物携带在寒冷或长期脱水条件下开启的基因，这些基因编码的产物直接或间接地使此植物的抗旱性和/或抗冻性比其许多类似植物高。现在已经表征了许多热胁迫和水分胁迫相关基因(见例如，美国专利5,837,545、5,071,962、4,707,359)。很多人相信，这些基因编码某种可能有利于植物生存的蛋白质，如“水分胁迫蛋白”。例如，某些植物在胁迫条件下产生名为脱落酸(ABA)的激素，此激素使植株气孔关闭，从而降低了其受胁迫的严重程度。不幸的是，已知ABA抑制新叶的形成，促进花和果实的脱落并导致减产。
据信，许多热带植物都不具备耐受长期干旱和/或冷冻条件的进化能力。相反，已知许多温带植物都形成了至少一些耐受此条件的能力。在干燥条件下及冷冻后，各植物种类的生产力有很大不同。例如，烟草(烟草属(Nicotiana spp.))的新叶对干旱高度敏感，因而其不能在水资源匮乏和蒸发量高的地区进行商业种植。与水分胁迫相比，对抗冻相关蛋白质和基因知之甚少。然而，已经假设了抗冻主成分可能和耐脱水有关(见例如，Yelenosky，G.C.，Guy，L.(1989)Plant Physiol.89444-451)。
另一个特别重要的新领域是培育在盐化土壤中生长能力提高的植物。含溶解盐水分的供给使土壤发生盐化。水分蒸发后，盐类就在土壤中逐渐积累。在我们这个星球的大多数丰产地区，灌溉土地的不断盐化危及着农业的未来(Serrano，R.等，Crit.Rev.Plant Sci.，13121-138(1994))。例如，干旱地区为大多数作物的生长提供了最适宜的光周期和温度条件，但其降雨量不太适宜。人工灌溉只能在短期内解决问题，因为已发现处于这样环境下的土壤往往很快被盐化。为了能在防碍包括粮食作物在内的许多植物生长的盐化环境下种植，植物必须在其胞质中维持比其生长土壤中存在的低得多的Na+/K+比率。
生理学研究表明，根的盐外排和/或叶细胞液泡的盐汇集是耐盐的关键决定因素(Kirsch，M.，et al.，Plant Mol.Biol.，32543-547(1996))。氯化钠(NaCl)的毒性浓度首先在完全展开的叶片中形成，在此，NaCl被区室化于液泡中。只有在超过其负载容量时，胞质及质外体浓度才达到毒性水平，最终导致膨压的丧失和植物的死亡。据说，通过V-ATPase(腺苷三磷酸酶)可使液泡腔过度酸化以提供使胞质解毒的Na+/H+交换活性所需的额外质子(Tsiantis，M.S.，et al.，PlantJ.，9729-736(1996))。已知盐胁迫能增加例如向日葵幼苗根液泡膜囊泡中的ATP依赖型及焦磷酸(PPi)依赖型H+转运。盐处理也可诱导氨氯吡嗪脒敏感型Na+/H+交换活性(Ballesteros，E.，et al.，PhysiologiaPlantarun，99328-334(1997))。在盐生植物(Mesembryanthemumcrystallinum)中，高含量NaCl刺激叶细胞液泡H+-ATPase(V-ATPase)及液泡Na+/H+反向转运蛋白的活性。
农业上还有的另一个重要领域是提高作物产量及改善某些观赏植物的美学质量。作物的产量及某些观赏植物的美学质量可以通过种植其营养和/或繁殖结构比野生型大的植物来得到提高。在本领域已知某些生长因子可被用来增加植株和/或其花的大小。不幸的是，这类生长因子的应用是昂贵的和耗时的。
因此，在对这样的植物存在需要其具有提高的对干旱和/或冷冻胁迫的抗性，拥有比其野生型相应品种更大的大小特性，和具有增加的对其生长土壤中盐分的耐性。
发明概述本发明公开了液泡焦磷酸酶表达上调的转基因植物。已发现表现出这种上调活性的植物一般比其对应野生型大，并且证明了其对干旱和/或冷冻的胁迫抗性以及对其生长介质中盐分的耐性都得到了提高。
根据本发明，任何改变植物中液泡焦磷酸酶表达的合适外源核酸分子都可用来转化该转基因植物。外源核酸可包含编码液泡焦磷酸酶蛋白(外源液泡焦磷酸酶)如AVP1，其功能部分(肽，多肽)或其同系物的核酸，和/或改变导入该外源核酸的植物中内源液泡焦磷酸酶表达的核酸。在此所说的“外源核酸”是指来自其导入的植物细胞以外来源或产生转基因部分的植物或植物部分以外来源的核酸。用于转化的外源核酸可以是RNA或DNA，(例如，cDNA、基因组DNA)。此外，外源核酸可以是环状或线型、双链或单链分子。单链核酸可以是有义链或反义链。编码液泡焦磷酸酶蛋白的核酸的“功能部分”是指核酸中编码能保持液泡焦磷酸酶蛋白功能特性的蛋白质或多肽的部分。在一个特定的实施方案中，此核酸编码AVP1，其功能部分或同系物。
可改变其中导入了外源核酸的植物中内源液泡焦磷酸酶表达的核酸包括在植物中起作用的调节序列(如，诱导型的和组成型的)以及反义核酸。调节序列的实例包括液泡焦磷酸酶的启动子、增强子和/或抑制基因。此核酸也可以包括如多腺苷酸化位点，报告基因和/或内含子序列及其它类似序列，这些序列对核酸的功能或表达是非必需的，但可通过影响转录和/或稳定性(如mRNA的)等而提供该核酸的改良表达和/或功能。这些元件可被核酸分子包含而获得核酸的最佳性能。
本发明所用的核酸可利用现有的方法从多种来源得到。例如，本发明所用编码液泡焦磷酸酶(如，AVP1)的核酸可来自于天然来源，如烟草、细菌、番茄或玉米。在一个实施方案中，此核酸编码与转基因植物的野生型相应的液泡焦磷酸酶。在另一个实施方案中，此核酸编码与转基因植物的野生型不同的液泡焦磷酸酶。改变其中导入了外源核酸的植物中内源液泡焦磷酸酶表达的核酸也可通过化学合成、重组产生和/或通过商业来源得到。
将本发明的核酸导入植物的各种方法为本领域技术人员熟知。例如，可使用农杆菌介导植物转化法、颗粒轰击法、微粒轰击法(如，美国专利4,945,050；美国专利5,100,792)、原生质转化法、向花粉转移基因、繁殖器官注射法及未成熟胚注射法。外源核酸可被导入植物任何合适的细胞，如植物的根细胞、茎细胞和/或叶细胞。
任何合适的植物都可用于产生本发明的转基因植物。例如，番茄、玉米、烟草、水稻、高粱、黄瓜、莴苣、草坪草、观赏类(如，大花、大叶)及豆科植物都可按本文所述被转化以产生本发明的转基因植物。此外，本发明的转基因植物能在土壤或水(水培)等任何支持植物生长的介质中生长。
本发明的转基因植物优选耐受土壤中高盐浓度。术语“盐”包括任何盐类，即酸中的氢被金属或其它等同物取代后形成的化合物，包括但不限于含一价和二价毒性阳离子的盐类，如NaCl、KCl、CaCl2、MgCl、CdCl、ZnCl及硫化物盐类。
通过向植物细胞转化可改变植物液泡焦磷酸酶表达以致表达上调的外源核酸，可向本发明的植物引入耐盐性。任何合适的液泡焦磷酸酶(其中几种已被克隆)都可用于本发明的组合物和方法中(例如，Sarasian，Z.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，891775-1779(1992)；Jenslerchl，等，Moled.Biol.，29833-840(1995)；Kim，Y.等，Plant Physiol.，106375-382(1994))。在一个特定的实施方案中，本发明涉及耐盐转基因植物，其含有设计用于超量表达AVP1的外源核酸结构(Sarasian，Z.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，891775-1779(1992))。植物细胞的转化可在整体植株、种子、叶片、根或植物任何其它部分中进行。此转基因植物优选被改变，以致它们可在抑制其相应非转基因植物生长的盐浓度中生长。转基因植物的转基因后代，转基因植物产生的种子及由转基因种子发育而来的后代转基因植物都是本发明的主题，有利的是，它们都携带此耐盐性状。可从转化细胞再生植物以获得转基因植物，这些转基因植物可作一定水平耐盐性的筛选。在一个优选的实施方案中，外源核酸编码AVP1或其同系物。优选液泡焦磷酸酶在植物中的表达增强到一定程度，使得转基因植物可耐受浓度为约0.2M至约0.3M的氯化钠(NaCl)。通过向一个或多个植物细胞中导入使植物液泡焦磷酸酶表达上调的核酸以形成转化细胞，可获得能在盐水中生长的转基因植物。这里所说的“盐水”包括含有盐分的水，优选地，水中盐分的浓度为约0.2M至约0.4M。在一个实施方案中，盐水指的是海水。
本发明的转基因植物也可用于获得耐盐(约0.2M至约0.4M的盐浓度)双转基因植物。在一个实施方案中，本发明涉及耐盐双转基因植物，其含有一个或多个转化了可改变植物液泡焦磷酸酶及Na+/H+反向转运蛋白(antiporter)表达的外源核酸的植物细胞。有利结构的液泡焦磷酸酶是AVP1或其同系物，Na+/H+反向转运蛋白为AtNHX1或其同系物。本发明还包含双转基因植物的转基因后代以及此转基因植物产生的种子和由此种子发育而成的后代转基因植物。
通过向植物细胞转化可改变植物中液泡焦磷酸酶表达以致使表达上调的外源核酸，也可向植物中引入干旱和/或冷冻耐受性。在一个优选方案中，提供了实质上抗旱和/或抗冻的转基因植物，其基因组中携带或多个外源导入的液泡H+转运泵基因。特别优选的可育、耐旱和/或耐冻并能在盐化土壤中生长的转基因植物中含有分离的编码液泡H+转运泵的外源嵌合DNA结构，其优选可操作地连接上启动子，如35-S启动子或其它强启动子，包括但不限于组织特异性启动子。转基因植物可包含这样的多核苷酸序列，此序列含有可操作地连接启动子的外源液泡膜焦磷酸H+泵基因。在另一种特别优选的抗旱和/或抗冻并能在盐化土壤中生长的转基因植物中，此多核苷酸序列含有可操作地连接了35S启动子的双串联增强子的外源液泡膜焦磷酸H+泵基因。特别优选的液泡膜焦磷酸H+泵基因为AVP1基因。
通过以上描述的方法上调液泡焦磷酸酶的表达也可以用来提供具有比其相应野生型植物更大的营养和/或繁殖器官的植物。即，本发明提供了增加植物产量的方法，包括向一个或多个植物细胞导入可改变植物中液泡焦磷酸酶表达的核酸以形成转化细胞，由此增加植物的产量。此方法可进一步包括从转基因细胞再生植株以获得转基因植物，以及选择比其相应野生型植物更大的转基因植物，从而产生比其相应野生型植物更大的转基因植物。本发明还包括获得花比其相应野生型植物大的转基因植物(如观赏植物)的方法，此方法包含向一个或多个植物细胞导入可改变植物中液泡焦磷酸酶表达的核酸以形成转化细胞。
本发明还公开了新型基因盒，包括含可操作地连接嵌合启动子的液泡膜焦磷酸驱动的H+泵基因的基因盒。还公开了包含可操作地连接启动子的外源液泡膜焦磷酸驱动H+泵基因的新基因盒，以及包含可操作地连接35S启动子双串联增强子的外源液泡膜焦磷酸驱动H+泵基因的新编码序列。优选地，此编码序列被设计来超量表达AVP1。
本发明还公开了新型表达载体，包括含这样的多核苷酸序列的表达载体，此多核苷酸序列含外源液泡膜焦磷酸驱动H+泵基因，该基因可操作地连接35S启动子的双串联增强子，进一步可操作地连接多克隆位点；还包括含以下多核苷酸序列的表达载体，该多核苷酸序列中含外源液泡膜焦磷酸驱动H+泵基因，该基因可操作地连接35S启动子的双串联增强子，并进一步可操作地连接异源编码序列。
本发明人了解，所公开的发明可应用于任何植物，包括但不限于作物植物、观赏植物、草、灌木、或其它发现有利于人类或能娱悦人的植物。
图1B(1)、1B(2)及1B(3)从
图1A中代表性WT及1’和2’品系得到的典型5天龄幼苗根及根毛的显微图片，其与垂直植物营养琼脂平板表面平行生长。
图1C从野生型(WT)及超量表达AVP-1的独立转基因品系(1’和2’)分离的膜组分的免疫印迹。
图2经过7天水分缺乏胁迫后典型野生型植物(WT)与超量表达AVP-1的代表转基因植物(1’和2’)的俯视图。
图3在盐化土壤生长的野生型植物(WT)与超量表达AVP-1的转基因植物(1’和2’)的透视图。
图4A在酵母前液泡区室(pre-vacuolar compartment)中参与钠汇集的转运蛋白的工作模式示意图；Nhxl(Na+/H+反向转运蛋白)，Vmal(液泡膜H+-ATPase)，Gefl(酵母CLC氯化物通道)，Enal(质膜Na+-ATPase)。
图4B图4A中在酵母前液泡区室中参与钠汇集的转运蛋白的工作模式示意图，还包括Avpl(A.thaliana液泡焦磷酸能化质子泵)。
图5A与图5B显示野生型酵母菌株及携带各种影响钠耐受性的突变的酵母菌株细胞内Na+与K+浓度的条形图，这里的值是两次测定的平均值，条代表标准差。
图6A，6B，6C以接缘线A-A和B-B相连时，表示拟南芥属(Arabidopsis)NhX1同系物AtNHX1(SEQ ID NO1)、人HsNHE-6(SEQ IDNO2)及酵母ScNHX1(SEQ ID NO3)推导的氨基酸序列的对比；相同的残基以黑框表示，短线表示序列间隔区，序列对比上的*表示人NHE1(163DVF-FLFLLPPI173)(SEQ ID NO4)假定的氨氯吡嗪脒结合位点。
图7于盐化土壤中生长的野生型植物(WT)与超量表达AVP-1的典型转基因植物(1’和2’)的Na+与K+浓度条形图。
图8图3中2’的35SAVP-1转基因液泡膜囊泡(正方形)与图3中野生型(WT)囊泡钙吸收图。
图9A与9B表示与野生型液泡相比，液泡中通过质子驱动作用干物质(solids)高度积累的理论机制图解。
发明详述由于植物液泡占一个成熟植物细胞总细胞内体积的40％至99％，液泡体积的变化显著影响细胞的大小(R.G.Zhen，E.j.Kim，P.A.Rea，in ThePlant Vacuole.(Academic Press Limited，1997)，vol.25，pp.298-337)。液泡体积通过由泵和转运蛋白介导的离子与水流控制。在植物中，引导离子、溶质及水跨膜运输的动力是质子梯度。液泡H+泵的活性导致其腔内酸化并建立跨液泡膜的H+电化学势梯度，为无机离子、蔗糖及有机酸的次级活性转运蛋白提供能量。这些转运蛋白的活性调节细胞pH值及离子的稳态，并导致产生促进液泡膨胀的渗透势所需溶质的积累(H.Sze，X.Li，M.G.Palmgren，The Plant Cell 11，677-689(1999))。
有3个不同的泵产生质子电化学梯度。一个位于质膜上，从细胞中排出H+(PM H+-ATPase)；两个位于液泡膜或其它内膜区室中，使它们的内腔酸化(液泡型H+-ATPase与H+-PPase)(R.A.Leigh，in The PlantVacuole L.a.Sanders，Ed.(Academic Press，San Diego，California，1997)，vol.25，pp.171-194.)。
以前的工作表明，利用反义结构减少胡萝卜液泡H+-ATPase A亚基的水平可导致植物细胞膨胀度降低及叶形态的改变(J.P.Gogarten，等，ThePlant Cell 4，851-864(1992))。本发明人假设液泡中H+供应的增加可导致细胞膨胀。最近，基于液泡离子积累功能中质子的有效性理论，本发明人作出这样的假说液泡中干物质的积累可能有利于抗旱并产生更抗冻的植物。
本发明人知晓，植物有许多液泡H+-转运泵，通过上调其活性、提高其表达、上调其转录和/或翻译、或增加其拷贝数，可以由液泡中质子的有效性增加导致液泡中干物质的积累增加。发明人通过增加液泡H+-转运泵、无机焦磷酸酶或由单个多肽组成的V-PPase的拷贝数检验了这个假说(R.G.Zhen，E.j.Kim，P.A.Rea，in The Plant Vacuole.(Academic PressLimited，1997)，vol.25，pp.298-337)。在拟南芥属中，由AVP-1基因编码的V-PPase能够产生大小与液泡H+-ATPase的类似的跨液泡膜H+梯度(V.Sarafian，Y.Kim，R.J.Poole，P.A.Rea，Proc.Natl.Acad.Sci.89，1775-1779(1992))。如本领域普通技术人员所理解的，其它植物中的相似基因将以相似的方式作用。
在一个实施方案中，包含可操作地连接用于超量表达液泡焦磷酸酶的启动子的液泡焦磷酸酶基因的结构(例如表达盒)被用来产生本发明的转基因植物。在此所说的“超量表达”是指比缺乏此结构的表达/活性更强。在一个特定的实施方案中，包含可操作地连接用于超量表达AVP1的嵌合启动子的AVP1基因的结构被用来产生本发明的转基因植物。更具体的是，本发明涉及其中AVP1基因可操作地连接35S启动子的双串联增强子的结构。
本发明的转基因植物除那些与粮食价值和观赏价值有关的用途外可找到其它用途。例如，本发明的转基因植物可吸收与其野生型对应植物不同或更多的离子。如下面的讨论，通过对酵母突变菌株(enal)的研究表明液泡中H+-转运泵对高等植物阳离子的解毒起着重要作用(植物中涉及细胞内阳离子解毒体系的组分已经通过互补出芽酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的盐敏感突变体而被鉴定出来)。根据此研究，包含改变植物液泡焦磷酸酶表达的外源核酸的转基因植物和/或其后代也可用于对土壤和生长介质进行生物除污。此类植物可被用来从支持植物生长的介质中(如，土壤，水)除去阳离子(如，单价和/或双价阳离子)。例如，本发明的转化植物可被用来从支持植物生长的介质中除去钠(Na)，铅(Pb)，锰(Mn)，和/或钙(Ca)离子。
为了证明增加液泡H+供应对抗旱和/或抗冻性、耐盐性及植株大小的影响，本发明人产生了包含液泡质子泵AVP1额外拷贝的转基因植物。
将含AVP-1基因的结构转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物中。然后分离包含此基因额外拷贝的转基因品系。AVP-1的开放阅读框被克隆到修饰pRT103的Xma1位点[R.Topfer，V.Matzert，B.Gronenborn，J.Schell和H-H.Steinbiss，Nucleic acid Research 15，5890(1987)]。此载体包含35-S启动子的串联重复。含35-S串联启动子、AVP-1的开放阅读框及多腺苷酸化信号的HindIII片段被亚克隆到pPZP212载体的HindIII位点上[P.Hajdukiewicz，Z.Svab和P.Maliga，Plant MolecularBiology 25，989-994(1994)]。对经过真空渗入处理的开花拟南芥(colunbia生态型)的进行农杆菌介导的转化。通过将转化植物种子铺板到补加25mg/L卡那霉素的植物营养琼脂平板上对转基因植物进行选择。随后对植株进行两代选择以鉴定转基因纯合的转基因植物。
图1A是于10小时光/暗周期下水培7周的典型野生型(WT)(每10株取一株)及两个独立转基因品系(1’和2’)的俯视图。从
图1A中可以看到最高水平表达AVP-1蛋白的转基因品系2’与转基因品系1’及野生型(WT)的形象比较，证明了AVP-1的量与植物大小相关。并发现转基因植物的质量比其野生型的大。在75℃(n＝4)烘烤24小时后测量整个转基因植物的干重，发现转基因品系1’和2’的干重分别比其野生型(WT)的高1.5和3倍。
图1B(1)、1B(2)及1B(3)是从
图1A中WT代表株及1’和2’转基因品系得到的典型5天龄幼苗根及根毛表面平行地种植于垂直植物营养琼脂平板上的显微图片(放大倍数40倍；图中条长为2mm)。转基因品系1’和2’幼苗的根毛平均长度分别比野生型(WT)根毛长40％和70％(
图1B)(从每组幼苗中选取5株测定主根周围根毛的长度，平均每株测量80条根毛)。根毛长度和液泡大小相关，因此，根毛长度的增加可能源于液泡体积的增大)。这与拟南芥属突变体rdh3形成比较，据报道，拟南芥属突变体rdh3具有缩小了的液泡容积，是具异常短根毛的矮化植物(M.E.Galway，J.W.J.Heckman，J.W.Schiefelbein，Planta201，209-218(1997))。已得到认可的是，扩大的根结构将对土壤侵蚀、豆科植物的固氮产生积极的影响并将利于植物水分的吸收。
图1C是从野生型(WT)及超量表达AVP-1的独立转基因品系(1’和2’)分离的膜组分的免疫印迹图。从水培过6周的8周龄野生型(WT)和AVP-1转基因植株(1’和2’)的幼枝中分离总体膜组分。依次分别在8kg和100kg下将植株幼枝匀浆离心15和30分钟。将在100kg离心的膜沉淀重新悬浮于10mM Tris(Ph7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、10％甘油和1mM PMSF蛋白(10mg)中，以10％SDS-PAGE分离，电印迹，并用抗相应于AVP-1蛋白推测亲水环IV的KLH结合合成肽的抗体进行免疫染色。(V.Sarafian，Y.Kim，R.J.Poole，P.A.Rea，Proc.Natl.Acad.Sci.89，1775-1779(1992))。以化学发光检测PPase。
图1C表明，转基因品系(1’和2’)的AVP-1表达水平比野生型(WT)高(即，1’比WT高15％，2’比WT高50％)。
因为小麦剥夺水后其耐旱性因细胞K+含量的增加(从100mM到300mM)而得到加强(S.Gupta，G.Berkowitz，P.Pier，Plant Physiol 89，1358-1365(1989))，所以假设(但本发明在此并不局限于这种理论)AVP-1转基因植物抗旱性的提高可能是由于它们液泡中钾浓度升高而增加了其保水力的缘故。实验室的验证看来证明了这点。
图2是经过7天水分缺乏胁迫后典型野生型植物(WT)与超量表达AVP-1的转基因植物(1’和2’)的俯视图。对野生型和超量表达AVP-1的转基因植物(图3A)进行耐旱测试(24℃)。经过7天的缺水胁迫后，野生型(WT)植株枯萎，而来自35AVP-1转基因品系(1’和2’)的植株都挺立且保持活力。此外，随后对干旱胁迫植株进行浇灌时，转基因植物继续正常生长、抽苔并结籽，而野生型植株死亡。在缺水胁迫期间测定野生型和35SAVP-1转基因植株叶片的相对含水量，结果表明，与野生型(WT)植株相比转基因植物保水力增加。
尽管在附图中没有得到表述，有关大量植物种在24小时或更长时间内的抗冻测试(低于0℃)也得到类似结果。尽管不局限于此假说，据信，超量表达AVP-1的转基因植物(1’和2’)的抗冻性比野生型(WT)提高是由于液泡中阳离子量的增加。高浓度的阳离子提供了更强的渗透压而导致保水力得到加强，从而不仅赋予植株抵抗低土壤水势的能力，而且还使植株更好地免受冷冻的伤害，冷冻会导致植株明显脱水。
图3是在盐化土壤生长的野生株(WT)与超量表达AVP-1的转基因植物(1’和2’)的透视图。于10小时光/暗周期条件下，在土壤中分别种植5个野生型(WT)植物及2个超量表达AVP-1的转基因品系(1’和2’)。以稀释营养液(1/8 MS盐)浇灌植株6周，其后以补充NaCl的稀释营养液浇灌。NaCl的起始浓度为100mM，每4天增加100mM。图3中的照片对应于在300mM NaCl存在时第10天的植株。图3表明，在含盐土中，两个AVP-1(1’和2’)植物类型的生长明显比野生型植物强壮。超量表达AVP-1(焦磷酸能化液泡膜质子泵，本发明的工作)或AtNHX1(Na+/K+反向转运蛋白，(Apse，M.，等，Science，2851256-1258(1999))和本发明的工作)的拟南芥遗传工程植株能在高浓度NaCl存在时生长的事实有力地支持了本文所描述的策略。可以预料，双价转基因植物可被证明具有更强的耐盐表型。在重要的农艺作物中，这些拟南芥转运蛋白或其对应物可能起类似的作用。35S AVP1拟南芥属转基因植物尺度的增加也有益于遗传工程作物潜在产量的提高。植物细胞器中阳离子稳态的工作模式尽管本发明不局限于任何特定假说，本发明人还是提出了植物细胞器中阳离子稳态的工作模式，这可以解释有关本文所公开的转基因植物意想不到的结果。
在植物中，大多数运输过程由质子的初级转运提供能量。位于质膜和液泡膜上的H+转运泵将H+从胞质分别转运到细胞外及液泡区室中(Rea，P.A.，等，Tonoplast Adenosine Triphosphate and inorganicPyrophosphate. InMethods Plant Biochem.，第385-405页，AcademicPress Limited，London(1990))。植物液泡膜含有两类H+转运泵V-ATPase及无机焦磷酸酶或V-PPase。它们的作用导致腔酸化并建立跨液泡膜的H+电化学势梯度(Davies，J.M.，等The Bioenergetics of Vacuolar H+Pumps. InPlant Vacuole，pp.340-364，Leigh，R.A.，Sanders，D(eds.)，Academic Press，San Diego(1997))。液泡膜涉及到广泛的生理学过程，包括胞质pH稳定性、调控Ca2+的区室化、Na+等毒性离子的汇集、膨压调节、营养物质的储存与再生。液泡占一个成熟植物细胞总细胞内体积的40％至99％。液泡质子泵焦磷酸酶是植物液泡膜的一个普遍而丰富的组分，它能够产生稳定的与V-ATPase所产生的相似或更大的跨液泡膜H+电化学势。(Rea，P.A等，Tonoplast Adenosine Triphosphate and InorganicPyrophosphates.InMethods Plant Biochem.，pp.385-405，AcdemicPress Limited，London(1990))。焦磷酸(PPi)是在广泛的生物合成途径中活化或聚合步骤中的副产物，在植物中作为ATP的替代能量供体在以下途径中起作用通过蔗糖合成酶的蔗糖转移，通过PPi果糖-6-磷酸磷酸转移酶的糖酵解及通过液泡质子泵焦磷酸酶的液泡膜能化作用(Stitt，M.，Bot.Acta111167-175(1998))。
大多数细胞内细胞器，包括披有网格蛋白的小泡、内体、高尔基体膜及液泡，都具有酸性内腔(Xie，X.S.等，J.Biol.Chem.，26418870-18873(1989))。此酸化作用由质子转运生电ATPase调节，在植物液泡中也由焦磷酸驱动质子泵V-PPase调节(Davies，J.M等，TheBioenergetics of Vacuolar H+Punps.InLergh R.A.，Sanders，D.，(eds)The Plant Vacuole，pp340-363，Academic Press，San Diego(1997)；Zhen，R.G.，等，The Molecular and Biochemical Basis of Pyrophospate-Energized Proton Translocation at the Vacuolar Membrane，AcademicPress Limited(1997))。需要阴离子转运的存在以维持净电中性(al-Awqati，A.，Curr.Opin.Cell.Biol.，7504-508(1995))。
图4A是在酵母前液泡区室中参与钠富集的转运蛋白的工作模式示意图；Nhxl(Na+/H+反向转运蛋白)，Vmal(液泡膜H+-ATPase)，Gefl(酵母CLC氯化物通道)，Enal(质膜Na+-ATPase)。CLC电压门控氯化物通道超家族的酵母成员Gef1为酵母新高尔基体囊泡中铜的装载及前液泡区室中阳离子的富集所需(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954046-4050(1998)；Gaxiola，R.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480-1485(1999)；实施例1)。此外，已经显示，通过导入CLC超家族的原型成员Torpedo marmorata CLC-O或导入拟南芥CLC-c及CLC-d氯化物通道基因可抑制gef1突变体的缺陷(Hechenberger，M等，J.Biol.Chem.，27133632-33638(1996)；Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sxi.USA，954046-40509(1998))。图4B是图4A中在酵母前液泡区室中参与钠富集的转运蛋白的工作模式示意图，其还包括Avp1(拟南芥属液泡焦磷酸能化质子泵)。
尽管不希望为理论所束缚，还是通过2项观察提出了酵母中Na+富集模式的假设，如图4A与4B所示。第一，gef1突变体对高浓度NaCl敏感。第二，Na+/H+交换体Nhx1位于前液泡区室中(Nass，R.，等，Biol.Chem.，27321054-21060(1998))。图4A与4B提出的模式假定通过NhX1的Na+富集依赖于液泡H+-ATPase及Gef1氯化物通道。Gef1介导的阳离子内流允许通过液泡H+-ATPase建立足够的质子梯度以驱动Na+通过Na+/H+交换向上积累。
基于此模式，提出理论增加质子向假定的内体区室流入将通过Nhx1交换体增进Na+的富集。为了提高H+的有效性，对拟南芥编码液泡焦磷酸能化质子泵的功能获得性(gain-of-function)突变基因AVP1-D进行了表达(图3B)(Zhen，R.G.，等，J.Biol.Chem.，27222340-22348(1997))。这种植物泵在酵母中的表达恢复了测试菌株的Na+抗性，但条件是此菌株具有功能性NHX1及GEF1基因。此外，Gef1p与Nhx1p共存于共同细胞器，即前液泡区室中(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480-1485(1999))。这些结果有力地支持了图4A与4B中的模式，并表明了酵母前液泡区室能被用于鉴定令人困惑的参与细胞内钠盐解毒的植物转运蛋白。
图4A与4B中提出的模式完全与高等植物液泡在阳离子解毒中所起作用的生理资料一致。酵母和植物细胞的小泡从高尔基体网络到液泡的运输途径和信号是相同的(Neuhaus，J.M.，等，Plant Mol.Biol.，38127-144(1998)；(Paris，N.，等，Plant Physiol.，11529-39(1997)；Sato，M.H.等，J.Biol.Chem.，27224531-24535(1997)；Vitale，A.V.等，Trends Plant Sci.，4148-154(1999))。因此，在酵母中进行了有关研究以确定高等植物液泡在阳离子解毒中的作用。酵母中阳离子富集机制的研究实施例1酵母菌株中AtNhx1与Avp1的功能为了测试图4A与4B中提出的富集模式，构建了酵母突变体菌株(ena1)，它缺乏质膜钠外排泵，因而必需依靠内部解毒系统以使其能在高盐中生长。图4A与4B中的这种富集模式(Nass，R.和Rao，R.，J.Biol.Chem.27321045-21060(1998)，以及Gaxiola，R.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954046-4050(1998))预测，如果能够增强假定的内体区室中质子的有效性，即增加质子的流入，胞质Na+将由Nhx1交换体得到富集，从而会使ena1突变株获得耐盐性。
酵母液泡ATPase是一个多亚基蛋白质，因此通过超量表达其中任何亚基都很难增强酶的活性。相反，通过在酵母表达拟南芥AVP1基因而增加质子的流入则能达到这样的效果。这个基因编码单个多肽，当它在酵母中表达时，能够将质子泵入液泡腔中(Kim，E.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，916128-6132(1994))。为了保证这种质子泵的最大活性，对能增强H+泵动能力的AVP1基因(AVP1-D)的E229D功能获得性突变体进行了表达(Zhen，R.G.等，J.Biol.Chem.，27222340-22348(1997))。对在含高浓度NaCl的SD-尿嘧啶培养基中生长后的突变型及野生型细胞细胞内钠和钾浓度进行了测定。材料与方法酵母菌株及质粒使用了W303(ura3-1 can1-100 leu2-3，112trp1-1 his3-11，(Gaxiola，R.A.等，EMBO J.，113157-3164(1992))的等基因菌株。利用pRG52质粒(gef1∷HIS3)(Gaxiola，R.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954046-4050(1998))和pRG197质粒(nhx1∷HIS3)质粒构建GEF1与NHX1基因缺失，分别产生RGY85和RGY296菌株。enal∷HIS3突变体是从Fink实验室保藏中心(Fink Lab collection)(L5709)中获得的。
转化方法使用乙酸锂方法(Gietz，D.，等，Nucleic Acids Res.，201425(1992))对酵母细胞进行了转化。通过单突变菌株的杂交获得双突变体RGY324(gef1∷HIS enal∷HIS3)、RGY326(nhx1∷HIS3enal∷HIS3)及RGY343(gef1∷HIS3 nhx1∷HIS3)。从减数分裂后代中通过与每个单突变体有关的表型评分对双突变体进行鉴定。孢子形成、四分体剖分及接合型的评分如文献所述(Guthrie C.and Fink，G.R.，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic，San Diego(1991))。细胞在YPD(1％酵母/2％蛋白胨/2％葡萄糖；Difco)、YPGAL(1％酵母/2％蛋白胨/2％半乳糖；Difco)、SD(Difco；含2％葡萄糖的合成培养基)或AGP(AGP是合成基本培养基，包含10mM精氨酸、8mM磷酸、2％葡萄糖、2mM MgSO4、1mM KCl、0.2mM CaCl2及微量矿物质和维生素)培养基中培养(Rodrguez-Navarro，A.and Ramos，J.，J.Bacteriol.，159940-945(1984))。按说明加入MnCl2(Sigma)、氯化四甲铵(Sigma)、NaCl(Sigma)或潮霉素B(Sigma)。
以pYES2载体(Invitrogen)及pYES2-AVP1-E229D质粒(如Zhen，R.G等所述，J.Biol.Chem.，27222340-22348(1997))转化野生型菌株L5709(enal∷HIS3)、RGY324(gef1∷HIS3 enal∷HIS3)及RGY326(nhx1∷HIS3enal∷HIS3)。以pRG151(GEF1-GFP)(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954046-4050(1998))及pRIN73[NHX1-(HA)3](Nass，R.，and Rao，R.，J.Biol.Chem.，27321054-21060(1998))对用于组织化学分析的菌株RGY324(gef1∷HIS3 enal∷HIS3)进行转化。
以pAD4载体(Ballester，R.，等，Cell，95681-686(1998))转化野生型及RGY296(nhx1∷HIS3)菌株。以pRG308(ADH1∷AtNHX1)(见AtNHX1的克隆)转化RGY296(nhx1∷HIS3)。
细胞内钠和钾浓度的测定细胞在SD-尿嘧啶(SD-ura)培养基(Difco；含2％葡萄糖而不含尿嘧啶的合成培养基)中过夜培养。将过夜培养后的原液接种到YPGAL培养基(1％酵母/2％蛋白胨/2％半乳糖；Difco)上并培养至A600达到0.6。在此OD值时，加入NaCl至终浓度为0.7M。再将细胞培养6小时后离心收集，以1.1M山梨糖醇及20mM MgCl2洗涤两次，于95℃用水提取(entracted)30分钟。
在Georgia大学化学分析实验室以Inductively CoupledPlasma-MS(见环球网rserv/uga.edu.rsnew/chemicalanalysis/)测定细胞中Na+及K+量。按文献(Gaxiola，R.A.等，EMBO J.，113157-3164(1992))通过计算在1M NaCl中培养的细胞胞内水分值来估测细胞内阳离子浓度。
免疫荧光在SD-尿嘧啶、-亮氨酸培养基(Difco；含2％葡萄糖而不含尿嘧啶及亮氨酸的合成培养基)将RGY343(gef1∷HIS3 nhx1∷HIS3)菌株培养至对数中期，加入0.1mg/ml潮霉素B，培养物于30℃温育1小时。在室温静止的条件下以3.7％的甲醛(Sigma)固定细胞45分钟。按文献(Pringle，J.，等，in Immunofluorescence Methods for Yeast，eds.Guthrie，C.And Fink，G.F.(Academic，Sand Diego)，Vol.194pp.565-602(1991))进行原生质球制备、透化、洗涤及抗体孵育。所用的第一抗体MBA HA11由Babco(Richmond，CA)提供。Cy3-结合羊抗鼠IgG由Jackon Immunoresearch提供。加入4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(Sigma)至封固培养基中以对线粒体及核DNA进行染色。
亚细胞分级分离及Western分析在APG培养基(pH7.0)上培养RGY343(gef1∷HIS3 nhx1∷HIS3)菌株，按文献(Nass，R.and Rao，R.，J.Biol.Chem.，27321054-21060(1998))对胞溶产物进行10级蔗糖密度梯度分级分离。按文献(Nass，R.and Rao，R.，J.Biol.Chem.，27321054-21060(1998))对每个组分的等分试样(100μg)进行SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS/PAGE)并向硝酸纤维素膜转移。以单克隆抗GEP(绿色荧光蛋白)抗体(1∶10,000稀释，CLONTECH)、抗血凝素抗体(1∶10,000稀释，Boehringer Mannheim)及过氧化物酶偶连羊抗鼠抗体(1∶5,000)为探针进行Western杂交，以ECL增强型化学发光系统(Amersham Pharmacia)显影。
AtNHX1的克隆以一个包含部分克隆的已表达序列标签(拟南芥属BiologicalResource Center，DNA保藏中心)作探针从拟南芥(Kieber，J.J.，等，Cell，72427-441(1993))的噬菌体cDNA文库(来源于拟南芥属Biological Resource Center)克隆AtNHX1。全长克隆(2.1kB)连接到载体pSK2(Stratagene)的NotI位点，形成质粒pRG293。以pRG293(作为模板)、GGCCCGGGATGGATTCTCTAGTGTCGAAACTGCCTTCG(SEQ ID NO5)(斜体碱基对应于OFR的1-30个核苷酸)及T7寡核苷酸对AtNHX1开放阅读框(ORF)进行PCR扩增。PCR扩增产物以XbaI及SalI消化后连接到pAD4载体中以形成质粒pRG308。对AtNHX1 ORF进行测序以检验PCR产物的忠实性。此全长序列比据Arabidopsis Genome Initiative(ATM021B04.4)报道的ORF长，并已被GenBank收录(登录号AF106324)AVP1-D的克隆载体pYES32(Invitrogen)被导入到野生型及ena1、enal nhxl、enal gefl突变体中。质粒pYes2-AVP1-D(Zhen，R.G.，等，J.Biol.Chem.，27222340-22348(1997))被导入到ena1、enal nhxl、enal gefl突变体中。将每个菌株作5倍系列稀释(始于105个细胞)后铺板于包含或不包含0.5M NaCl的YPGAL(1％酵母提取物/2％蛋白胨/2％半乳糖)上，并于30℃温育2天。以0.7M NaCl处理指数生长的细胞(pYES2载体转化的野生型、ena1及携带pYes2-AVP1-D的ena1、enal nhxl、enal gefl突变体)6小时。制备总细胞提取物并测定Na+及K+的浓度。
结果具上述结构的ena1突变体缺乏质膜钠外排泵，因而必须依靠内部解毒系统去克服钠的毒性。ena1菌株的生长对低浓度钠(200mM)敏感，此浓度不会抑制野生菌株的生长。AVP1-D的超量表达恢复了盐敏感ena1突变体的耐盐性。通过AVP1-D恢复ena1突变体的耐盐性需要功能性NHX1及GEF1基因enla nhx1 AVP1-D及enal gef1 AVP1-D菌株是盐敏感的。
图5A与图5B是野生型酵母菌株及携带各种影响钠耐受性的各种突变的酵母菌株细胞内Na+与K+浓度条形图，这里的值是两次测定的平均，条代表标准差。在添加0.7M NaCl的培养基中培养6小时后，测定野生型菌株及携带各种影响钠盐耐性突变的菌株细胞内Na+与K+的含量。发现ena1突变体细胞内Na+含量比野生型菌株高8倍。可以看到在enal AVP-D菌株中细胞总Na+一致的下降。这种下降的原因还尚未知晓。发现enalAVP-D菌株是抗盐的，即使其细胞内Na+含量比野生型高4倍。在缺乏gef1或nhx1(即，enal gefl或enal nhxl)的enal AVP-D菌株中，Na+浓度没有降低到GEF1 NHX1菌株中的程度。总而言之，遗传和生理资料与Nhx1、Gefl及Avpl协作富集内部钠盐的模式是相符的。从图中可以看出，拟南芥属液泡H+-焦磷酸酶(Avp1)证实赋予了酵母enal突变体以耐盐性。
发现细胞内K+的含量与耐盐性相关，而与菌株中Na+含量呈反相关(图4B)。在野生型中K+的浓度是100mM，但在enal突变体中则降低到20mM。有趣的是，在AVP1-D基因超量表达的enal菌株中，细胞内K+的浓度几乎恢复到了野生型的水平(图4B)。然而，AVP1-D超量表达不能使细胞内K+的浓度恢复到野生型的水平，除非NHx1及GEF1都具有功能(见，图4Benal nhxl或enal gefl双突变体)。
如此所述，酵母细胞内Na+解毒需要功能性Na+/H+交换体(Nhx1)及氯化物通道(Gef1)，并且它们共存于前液泡区室中(Gaxiola，R.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480-1485(1999))。在克隆酵母NHX1基因的拟南芥同系物(AtNHX1)并在nhx1酵母突变体检测其功能后，发现AtNHX1基因能够部分抑制nhx1突变体的阳离子敏感表型。图6是拟南芥属AtNHX1(SEQ ID NO1)的Nhx1同系物、人HsNHE-6(SEQ ID NO2)及酵母SxNHX1(SEQ ID NO3)的推导氨基酸序列的对比，相同的残基以黑框表示，短线表示序列间隔区，序列对比上的*表示人NHE1(163DVF-FLFLLPPI173)(SEQ ID NO4)假定的氨氯吡嗪脒结合位点。
实施例2酵母菌株Geflp与Nhxlp的功能和共定位被鉴定为在钠盐解毒中起重要作用的NHX1与GEF1基因对其它阳离子的解毒也是需要的。根据图4A与4B提出的模式，对有毒性阳离子存在的酵母菌株gefl与nhxl(enal)突变体的生活力进行了一项研究。
这种富集模式不仅假设了阳离子通道Gef1和钠交换体Nhx1之间的功能联系，还预言这两种蛋白共存于共同的区室中。因为以前的研究表明了Nhx1位于前液泡区室中(Nass，R.and Rao，R.，J.Biol.Chem.，27321054-21060(1998))，所以也进行了确定Gef1和Nhx1蛋白是否也共存于这个区室中的试验。
材料与方法以质粒pRG151；GEF1-GFP及pRIN73；NHX1-(HA)3转化菌株RGY419(gefl nhxl)。转化体在SD(Difco；含2％葡萄糖的合成培养基)中培养。为了确定转化体对毒性阳离子的敏感度，对此菌株进行5倍的系列稀释(始于105个细胞)，然后将其于30℃在按说明附加了3mM MnCl2、0.45M四甲铵(TMA)或0.05mg/ml潮霉素B(HYG)的YPD(1％酵母提取物/2％蛋白胨/2％葡萄糖)培养基上培养2天。
进行了两项研究以证明Gef1p和Nhx1p的共同定位。
对转化有两种结构体(GEF1-GFP融合物及NHX1-(HA)3-标签融合物)的gefl nhxl细胞中的亚细胞组分进行了荧光分布的测定和免疫检测。在细胞OD600达到0.5时，在其中加入潮霉素B(Sigma)至终浓度为0.1mg/ml，然后将细胞于30℃温育40分钟。以HA表位的抗体及4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞进行固定和染色。通过带电荷偶连装置的显微镜观察细胞并利用去卷积算法进行光学切片(Scanalytics，Billerica，MA)(Kennedy，B.K.，等，Cell，89381-391(1997))；(Bar＝1·m.)。
同时测定了Gef1p及Nhx1p在蔗糖梯度中的移动特性，以为Nhx1(HA)3及GEF1-GFP的共同定位提供证据。以质粒pRG151；GEF1-GFP及pRIN73；NHX1-(HA)3转化菌株RGY419(gefl nhxl)后在APG培养基中培养(Rodriguez-Navarro，A.and Rea，P.A.，J.Biol.Chem.，159940-945(1984))。将此菌体转化成原生质球，溶解，并按文献进行10级蔗糖梯度(18-45％)分级分离(Sorin，A.，等，J.Biol.Chem.，2729895-9901(1997)and Antebi，A.and Fink，G.R.，Mol.Biol.Cell，3633-654(1992))。Western杂交显示了Gef1-GFP及Nhx1-HA的分布。
结果发现Gef1突变体对3mM MnCl2、0.45M氯化四甲铵及0.05mg/ml潮霉素B敏感。也发现nhx1突变体对氯化四甲铵及潮霉素敏感。nhx1突变体对潮霉素高度敏感可为nhx1的功能分析提供一个重要的工具。
发现血凝素(HA)标记的Nhx1和Gef1-GFP融合物共同定位，正如其在表面荧光去卷积(deconvolution)显微镜中所示。在图象作90度旋转后信号重合的持续性进一步证明了这两种转运蛋白在这些细胞中的共定位。NHX1-(HA)3与GEF1-GFP的共定位也由这两种蛋白在表达此标记蛋白的细胞膜制品蔗糖密度梯度中的共移动得到了支持。包含这两种蛋白的膜组分的沉降行为和前液泡区室的一致(Nass，R.and Rao，R.，J.Biol.Chem.，27321054-21060(1998))。GEF1-GFP(而不是Nhx1)也存在于高尔基组分中，这与以前的研究结果一致(Gaxiola，R.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954046-4050(1998)，Schwappach，B.，等，J.Biol.Chem.，27315110-15118(1998))。实施例3NHX1的拟南芥同系物对潮霉素的抑制能力突变酵母的敏感性在此所述的酵母菌株为鉴定其它生物体中的耐盐介导基因提供了重要的工具。为了验证这种体系的效用，对来源于拟南芥属(见材料和方法)的与S.cerevisiae NHX1 ORF高度同源的序列进行了鉴别，并利用一个已表达序列标签(见材料和方法)获得了此拟南芥基因的全长克隆。源于拟南芥属(AtNHX1)、人(HsNHE-6)及酵母(ScNHX1)的Nhx1同系物氨基酸序列的对比揭示了所预测的跨膜结构域上同一和相似的氨基酸片段(图6A-C)。然而，需要强调的是，尽管具有这些关系，AtNHX1及ScNHX1的C-末端区域都没显示出高度的同源性(图6A-C)。
哺乳动物Na+/H+反向转运蛋白的一个特点是它们可被氨氯吡嗪脒抑制。通过人NHE1反向转运蛋白基因(Counillon，L.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，904508-4512(1993))的点突变体确定了一个假定的氨氯吡嗪脒结合位点(163DVFFLFLLPPI173)(SEQ ID NO4)。AtNHX1、HsNHE-6及ScNHX1的序列几乎相同(图6)。然而，以氨氯吡嗪脒抑制酵母培养物中Nhx1或AtNhx1的试验没有获得成功。
根据酵母nhx1突变体对潮霉素高度敏感，可以检验酵母中克隆的拟南芥属AtMHX1 ORF是否能够提供Na+/H+交换功能。将载体pAD4(Ballerter，R.，等，Cell，59681-686(1989))导入野生型及nhxl菌株中。将质粒pRG308；ADH；AtNHXI导入如上nhxl突变体。将此菌株的5倍系列稀释液(始于105个细胞)于30℃在YPD(-)或添加0.05mg/ml潮霉素(+)的YPD上培养2天。经系列稀释的同样菌株也培养在AGP(见材料或方法)(-)或添加有0.4M NaCl的APG培养基上(Rodriguez-Navarro，A.and Ramos，J.，J.Bacteriol.，159940-945(1984)。
AtNHX1基因能够抑制nhxl突变体对潮霉素的敏感性。AtNHX1基因也抑制nhxl突变体对NaCl的敏感性，但仅仅是在K+的可用性降低的条件下。然而，AtNHX1不能拯救超量表达AVP1-D基因的双突变体enal nhxl的Na+-敏感生长表型。实施例4功能获得型(Gain-of-Function)酵母AtNHX1突变体的制备材料和方法通过诱变处理克隆基因以构建突变文库的方法在enal酵母中制备了可增强耐盐性的AtNHX功能获得性突变体。此文库用于转化盐敏感酵母突变体enal及耐盐增强表型的克隆。
据Arabidopsis Genome Initiative(AGI)报道与AtNHX1基因类似的其它基因也在突变酵母中得到表达而形成了功能获得型突变体。据信，某些AtNHX1同系物是质膜转运蛋白，因此，其在酵母中的功能通常有赖于pH值，要求用于成功筛选的培养基具有精确的组分和pH值。质膜转运蛋白的鉴定有助于培育通过降低纳的吸收而使耐盐性得到提高的植物。此外，酵母中植物cDNA表达文库也可用于鉴定涉及NaCl解毒的转运蛋白的其它家族。
为了制备AtNHX的功能获得突变体，使用了由Stratgene(EpicurianColi XL1-Red competent Cells Cat#200129)提出的随机突变导入的方法。此方法涉及将克隆基因导入缺乏3种DNA修复基本途径的菌株中。此菌株的随机突变率比野生型的高5000倍。将突变的AtNHX基因文库导入enal酵母突变体并作耐盐筛选。酵母转化按Schiestl及其同事(Gietz，D等，Nucl.Acid Res.201425(1992)，在此作为一个整体参考而收录)所述的方法进行。XK1-Red随机突变诱导的替代策略是如Fink及其同事所述的PCR方法(Madhani，H.D.等，Cell，91673-684(1997))。
为了检测AtNHX1同系物，最初采取了用于AtNHX1(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480-1485(1999)的同样菌株和条件。然而，如果这些筛选菌株和/或条件不起作用，则进行重新设计。在对质膜AtNHX1同系物进行处理时，发现鉴定培养基的pH条件非常关键。
结果拟南芥功能获得型突变基因AVP1-D的超量表达增强了酵母细胞内的解毒能力(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480-1485(1999)。有人提出这样的假说(尽管本发明者并不局限于此种假说)后者是由于流入液泡区室的H+增加，从而通过Nhx1交换蛋白加强了H+富集的缘故。酵母阳离子富集研究结论以上有关酵母的研究为酵母细胞内Na+富集时前液泡pH值的重要性提供了证据。植物H+-焦磷酸酶(Avp1)的超量表达仅仅赋予那些包含功能性氯化物通道(Gef1)及Na+/K+交换体(Nhx1)的酵母菌株以耐盐性。
这些资料支持了这样的模式Na+/K+交换体(Nhx1)与液泡ATPase及GEF1阳离子通道一道起作用以使阳离子在前液泡区室中得到富集。几项研究表明，前液泡区室可能源于质膜和新高尔基体。这些囊泡可能参与液泡的组装或物质向此细胞器的传输。这样就很自然地认为，这些前液泡囊泡通过使阳离子富集以降低其在胞质及其它细胞器中的浓度而使离子毒性得到解除。
在此所述的酵母体系容许对各种耐盐相关异质蛋白进行功能评估，这些蛋白包括氯化物通道、H+泵、Na+/K+交换体及其它阳离子/H+交换体或阳离子/碳酸氢盐共运输体。此系统稳定而灵活。拟南芥属氯化物通道(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954046-4065(1998)，Hechenberger，M.，等，J.Biol.Chem.，27133632-33638(1996))、H+泵及Na+/K+交换体的功能可在其相应的酵母突变体中加以分析。尽管AtNHX1不能抑制酵母nhx1突变体的所有表型，它可抑制某些表型并结合AtNHX1与酵母NHX1之间DNA同系物的事实，揭示了该植物基因执行与酵母同系物类似功能。AtNHX1基因抑制nhx1突变体对潮霉素敏感性而只具有弱Na+解毒表型的现象可能是由两种生物体中转运蛋白的不同调节作用或阳离子转运选择性差异引起的。
盐调节AtNHX1及植物基因抑制酵母nhx1突变体的能力表明了酵母和植物中阳离子的解毒机制可能类似。的确，前面的研究表明了耐盐植物液泡中钠的积累可能由液泡膜Na+/H+反向转运蛋白介导，这种反向转运蛋白利用由液泡H+-ATPase(V-ATPase)和/或H+-转运焦磷酸酶(V-PPase，refs.Barkla，B.J.等，Symp.Soc.Exp.Biol.，48141-153(1994)，Zhen，R.G.等，The Molecular and Biochemical Basis of Pyrophosphate-Energized Peoton Translocation at the Vacuolar Membrane(Academic，San Diego)，Kirsh，M，等，Plant Mol.Biol.，32543-547(1996))产生的质子动力。
在此所述的gef1及nhxl突变体都对潮霉素高度敏感的发现说明了对潮霉素的抗性水平依赖于液泡和前液泡细胞器的功能。K+吸收降低(trkl)的酵母突变体对潮霉素高度敏感(Madrid，R.等，J.Biol.Chem.，27314838-14844(1998))；K+吸收的降低使质膜电势超极化并驱动潮霉素等碱性阳离子的吸收。质膜H+-ATPase的H+泵活性降低的突变(Pmal)使质膜电势去极化，并赋予了对潮霉素的抗性(McCuskerm，J.H.，等，Mil.Cell.Biol.，74082-4088(1987))。因此，诸如gefl或nhxl等影响液泡及前液泡区室的pH值或膜电势的突变体可能影响潮霉素的区室化。液泡H+-转运泵活性上调的转基因植物在盐胁迫植株中表达量降低的现象为拟南芥属AtNHX1基因在盐稳态上的作用提供了支持(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480-1485(1999))。具体地，使用拟南芥作为受体模式植物说明了这些基因的超量表达会使植物获得耐盐性。最近的一项报道显示，超量表达AtNHX1基因的转基因拟南芥于短昼周期条件下在浇灌含200mM NaCl及1/8 M.S.盐的水分的土壤中保持了持久的生长(Apse，M.等.Science，2851256-1258(1999))。值得注意的是，每次添加1/8M.S.盐就提供了2.5mM钾以减缓NaCl胁迫强度，并且，短昼周期也降低了氧化胁迫。实施例5盐胁迫植物中AtNHX1基因的增强表达材料与方法在无菌条件下，将拟南芥植株(Columbia生态型)无菌种植在无添加物且无蔗糖的植物营养琼脂上，在连续光照环境于19℃生长15天。加入NaCl或KCl至终浓度为250mM后使植株恒温生长6小时。从盐胁迫及非盐胁迫植株组织中提取总RNA(Niyogi，K.K.and Fink，G.R.PlantCell.4721-733(1992))，在Hybond-N(Amersham)膜上与来源于pRG308质粒的32P标记DNA探针杂交。杂交在65℃下过夜进行。与65℃下以0.2％标准柠檬酸盐水(SSC)/0.1％SDS洗膜(Ausebel，F.等，Curr.Protocols inMol.Biol.(Wiley，NY)(1988))。使用18S探针作为上样对照(Unfried，I.等，Nucleic Acids Res.，177513(1989))。采取MACBAS2.4程序确定RNA的相对量。
结果NaCl胁迫使AtNHX1 mRNA水平增加了4.2倍，而KCl却只提高了2.8倍。这种由钠导致的mRNA水平的增加与酵母NHX1基因(Nass，R.，等，Biol.Chem.，27321054-21060(1998))的相似。用AtNHX1进行RNA组织印迹杂交。从15天龄以250mM NaCl或KCl处理6小时后的植株及无盐处理的对照植株中提取10mg总RNA，然后进行甲醛变性凝胶电泳。以AtNHX1 ORF内部探针进行印迹杂交。以18S核糖体探针作上样对照。实施例6超量表达AtNHX1的转基因植物的耐盐性材料和方法使用农杆菌介导植物转化获取超量表达AtNHX1的转基因植物。利用CaMV 35S启动子的双串联增强子表达转基因AtNHX1(Topfer，R.等，Nucl.Acid Res.，155890(1987))。
将15株野生型及15株35S AtNH1转基因植株在12小时白昼周期下培植20天。在此期间，每5天以稀释营养液(1/8 M.S.盐)浇灌植株。在第21天以含200mM NaCl的营养液浇灌植株，在第33天以含300mM NaCl的营养液浇灌植株。植株在最后一次NaCl处理后10天拍照。
结果发现在以含300mM NaCl的营养液浇灌后，转基因植物所受影响明显比野生型植株轻。
利用35S启动子的双串联增强子构造超量表达AVP1野生型基因的转基因拟南芥植株(Topfer，R.，等，Nucl.Acid Res.，155890(1987))。AVP1编码来自拟南芥属中的焦磷酸能化液泡膜质子泵(Zhen，R.G.等，J.Biol.Chem.27222340-22348(1997))。以前的研究表明了AVP1基因在拟南芥属基因组中以单拷贝的形式存在(Kim，Y.等，Plant Physiol.，106375-382(1994))，然而，Arabidopsis Genome Initiative(AGI)将BAC F9K20中第一染色体的与AVP1同源但不同的序列命名为ORFF9K20.2。
使用农杆菌介导的植物转化法产生超量表达AVP1的转基因植物。利用CaMV 35S启动子的双串联增强子表达转基因AVP1(Topfer，R.等，Nucl.Acid Res.，155890(1987))。将15株野生型及15株转35SAVP1基因植株在24小时白昼周期下培植16天。在此期间，每4天以稀释营养液(1/8M.S.盐)浇灌植株。在第17天以含200mM NaCl的营养液浇灌植株，在第27天以含250mM NaCl的营养液浇灌植株。植株在最后一次NaCl处理后10天拍照。采取例6中所述的条件和处理方法。
结果与野生植株相比，35SAVP1植株的5个不同的品系在T2期都表现出增强的耐盐性。然而，最显著的表型在纯合的T3代植株中出现。这些转基因植物比野生型植株大。此外，纯合35SAVP1植株在24小时光照环境下的含250mM NaCl及1/8M.S.盐的介质中显示出了持久的生长。观察到在短昼周期条件下(12小时白天光照周期)的含300mM NaCl及1/8M.S.盐的介质中种植的35SAVP1植株得到了持久的生长。实施例8野生型植株及35SAVP1转基因型植株在水培溶液中的生长传统农业可利用淡水的减少可能促使人们采取其它可利用的农艺技术。可以想象的是，随着耐盐植物的出现，用海水进行水培将会为作物生产创造一个新领域。据报道，水培可促进植株生长并提供无胁迫的根茎材料(Gibeaut，D.M.等，Plant Physiol.，317-319(1997))。水培另一个重要优势是它容许对离子组成进行比在土壤中更精确的改变。这些优势对盐胁迫的生理研究可能是重要的。
已建立了拟南芥植株的水培条件并对其在所含NaCl浓度不断增加的培养基上的表现进行了测试。
材料和方法在一个试验中，于12小时光周期条件下，对野生型及35SAVP1转基因植株进行了水培种植。野生型及35SAVP1转基因型植株在溶液培养基中培养65天。
另一项试验中，在12小时光周期条件下，将野生型及35SAVP1转基因型植株在溶液培养基中培养20天。从第21天开始，按每4天50mM增量的逐级方式增加NaCl的浓度。在以200mM NaCl处理4天后对植株拍照。
在另一项试验中，以包含海水中全部离子组分的商业海水处理转基因植物。在短昼光周期环境中，将35SAVP1及35SAtNHX1单与双转基因植物与野生型拟南芥一起水培4周(Gibeaut，D.M.等，PlantPhysiol.，317-319(1997))。然后，每4天添加相当于50mM NaCl的TropicMarin海盐(见www.thatpetplace.com/)。这种人工海水混合物包含真实海水中存在的其它全部大量和微量元素。对其生长进行监测，并对钠盐的浓度和分布等生理指标进行测定。
结果在将野生型及35SAVP1转基因型植株进行水培时，发现野生型及35SAVP1转基因型植株的根、叶、茎的大小显著不同，35SAVP1转基因型植株的要大得多。
在按每4天50mM的方式逐步提高NaCl浓度时(Apse，M.等，Sience，2851256-1258(1999))，35SAVP1转基因型植株在200mMNaCl存在时表现健康，而野生型对照在其叶与茎中表现出严重的毒害性。
在短昼光周期环境中，将35SAVP1及35SAtNHX1单与双转基因植物与野生型拟南芥一起水培4周(Gibeaut，D.M.等，PlantPhysiol.，317-319(1997))，然后每4天用相当于50mM NaCl的TropicMarin海盐处理，结果发现35SAVP1及35SAtNHX1单与双转基因植物能在海水盐溶液中生长。野生型拟南芥则不能。实施例9拟南芥质子转运蛋白在番茄植株中超量表达的效果对这些拟南芥质子转运蛋白(AVP1及AtNHX1)在更重要的农艺植物，即番茄植株中的超量表达效果进行了检测。据信，提高番茄植物的耐盐性将可能产生重要的经济效益。
对AVP1及AtNHX1的番茄同系物进行了分离，并构建了用于超量表达它们的相应嵌合体(Bidone，S.，等，Eur.J.Biochem.，25320-26(1998)；Burbidge，A.等，J.Exper.Botany，482111-2112(1997))。以农杆菌介导感染愈伤组织的方法导入此基因。通过组织培养再生转化植株。对植株进行耐盐性分析及钠盐的浓度和分布等生理指标的测定。
按McCormick所述的方法(McCormick，S.，Transformation oftomato with Agrobacterium tumefaciens.InPlant Tissue CultureManual，pp.1-9，Lindsey，K.(ed.).Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，The Netherlands(1991))将35SAVP1及35SAtNHX1结构对番茄进行转化。以PCR及DNA凝胶印迹分析T0与T1转基因植物中AVP1与AtNHX1转基因的存在及其拷贝数。通过分析T1种子后代的分离，对杂合及纯合植株进行鉴定。对纯合植株进行耐盐性分析及钠盐的浓度和分布等生理指标的测定。基于AVP1及AtNHX1同系物中的保守序列设计简并寡核苷酸。这些简并引物用于由番茄poly(A)+RNA制备cDNA的RT-PCR反应。将所得PCR片段作为探针从商业文库(即StratageneCat#936004)中分离全长cDNA克隆。Caboche及其同事描述了类似策略(Quesada，A.等，Plant Mol.Biol.，34265-274(1997))。
结果阳性测验结果表明在此所述的富集模式也可应用于其它重要作物。
图7是在盐化土壤中生长的野生型植物(WT)与超量表达AVP-1的典型转基因植物(1’和2’)的Na+与K+浓度图。在10小时的光/暗周期下栽培5个野生型(WT)植物及2个超量表达AVP-1的转基因品系(1’和2’)植株。以稀释营养液(1/8MS盐)浇灌植株6周后再以添加NaCl的稀释营养液浇灌植株。NaCl的起始浓度为100nM，其后每4天增加100mM。在以300mM NaCl处理10天后对相应的植物拍照。在以200mM NaCl处理24小时后收获植株地上部分并测定其鲜重。在75℃烘烤48小时后测定其干重。以原子吸收法测定Na+与K+的含量。图4中的数值为平均值+/-SE(n＝4)。从图中可以看出，转基因品系(1’和2’)植株Na+与K+的含量比野生型对照株显著高。
图8是图4中2’的35SAVP-1转基因液泡膜囊泡钙吸收(方框)与图4中野生型(WT)囊泡钙吸收图。在10小时光周期下将野生型植株(开环)及来自图4中品系2’的转基因植物水培9周。将液泡膜囊泡加入含250mM山梨糖醇、25mM BTP-Hepes pH8.0、50mM KCl、1.5nM MgSO4及10μM Ca++的缓冲液中。在加入200μM PPi以引发反应之前，将此混合物于20℃温育10分钟。加入Ca++离子载体A23187至其终浓度为5μg/ml以消除Ca++梯度。将等分试样(200μl)在指定时间过滤，然后以冷的上述(11)缓冲液洗涤。正如图中所证实的，来源于品系2’的转基因植物对钙的吸收比野生型植株高。
上述数据与以下假说是一致的即超量表达AVP-1的转基因植物的液泡膜中H+泵运能力得到加强，H+供应量的提高由通过H+驱动的离子转运蛋白的作用最终导致液泡中离子积累的增加。为了进一步支持此理论，对野生型和转基因植物液泡膜囊泡中Ca++吸收能力进行了测定。
Ca++是通过Ca++/H++反向转运蛋白进入植物液泡的已得到了很好的证明(K.S.Schumaker，H.Sze，Plant Physiol.79，1111-1117(1985))。此外，编码拟南芥Ca++/H+反向转运蛋白CAX1与CAX2的基因已经得到了分离和鉴定(K.D.Hirschi，R.G.Zhen，K.W.Cunningham，P.A.Rea，G.R.Fink，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，8782-8786(1996))。图8显示在35SAVP-1转基因植物的液泡膜囊泡中Ca++的吸收比野生型植株液泡中的高36％。应用Ca++离子载体A23将45 Ca++计数降低到表明液泡紧张度的背景水平(图8)(K.S.Schumaker，H.Sze，Plant Physiol.79，1111-1117(1985))。
尽管不为此理论所限，图9A和9B中还是描述了与超量表达AVP-1基因的转基因植物耐旱及耐冻性提高一致的模式。此模式说明了转基因植物液泡中AVP-1泵数目的增加如何提供使次级转运体吸收更多阳离子到液泡腔中去所需的更多H+。阳离子量的增加使渗透压得到提高，由此提高了保水力，从而赋予植物抵抗低土壤水势的能力。
为了得到超量表达AVP1及AtNHX1基因的拟南芥属植株，利用T335SAVP1植株作为母本，T3 35S AtNHX1植株作为父本。母本植株人工去雄，收集开花供体植株的新鲜花药。通过和柱头接触，用这些花药为去雄植株授粉。标记已授粉的花并从同一雌性植株上除去余下的已开放或未开放的花以避免任何收获混杂。收获后的种子以50％的次氯酸钠消毒，剧烈混合5分钟后用水充分洗涤。消毒后的种子于在软琼脂中于4℃下过夜保藏。然后将其撒播到固体卡那霉素-潮霉素选择培养基上。35SAVP1结构含有新霉素磷酸转移酶II基因，赋予植物以卡那霉素耐性；而35SAtNHX1结构包含修饰的潮霉素B磷酸转移酶基因，赋予植物以潮霉素耐性。将抗性幼苗移植到土壤及液体培养基中以检测其耐盐表型。
利用前面所提过同样的35S启动子的双串联增强子(Topfer，R.等，Nucl.Acid Res.，155890(1987))构建了超量表达拟南芥功能获得性突变基因AVP1-D(Zhen，R.G.，等，J.Biol.Chem.，27222340-22348(1997))的转基因拟南芥植株。超量表达功能获得性突变基因的植株将可能显示出增强的表型。对这些植株与35SAVP1及35SAtNHX1单和双转基因植物一起进行表征。将拟南芥功能获得性突变基因AVP1-D亚克隆到携带35S启动子及CaMV聚腺苷酸化信号的质粒pRT103中(Topfer，R.等，Nucl.Acid Res.，155890(1987))。将含35SAVP-D嵌合基因的HindIII片段亚克隆到pBIBhyg中(Backer，D.，Nucl.Acid Res.，18203(1990))。以电穿孔法将所获T-DNA载体转化到根瘤农杆菌GV3101菌株中，以用于其后Columbia生态型拟南芥的真空渗透(Bechtold，N.等，C.R.Jeances Acad.Sci.Ser.III Sci.Vie，3161194-1199(1993))。整合通过T3植株的Southern杂交证实，阳性T3植株基于Northern杂交监测表达。实施例11野生型及35S AVP1转基因植物根液泡转运比较研究进行了一项研究以确定35SAVP1转基因植物的液泡是否显示出更高的依赖焦磷酸的质子转运活性。分别对水培植株的根和茎进行了测定。转基因可能表现出组织特异性调控而不受35S启动子的影响。
为了比较野生型和35SAVP1转基因型植株的PPI-依赖性H+转运活性，从上述植株的根和叶中制备了封闭的液泡膜富集的囊泡。按Rea和Tuner(Rea，P.A.，等，Tonoplast Adenosine Triphosphate and inorganicPyrophosphate.InMethods Plant Biochem.，pp.385-405，AcademicPress Limited，London(1990))所述的方法进行匀浆及差速离心。按Rea及其同事所述的方法(Zhen，R.G.，等，J.Biol.Chem.，27222340-22348(1997))以吖啶橙(2.5μM)作为含液泡膜富集囊泡的鉴定培养基中跨膜pH差异指示剂进行荧光检测。检测培养基含有300mM Tris-PPi、50mMKCl、2.5μM吖啶橙、5mM Tris-Mes(Ph8.0)。添加1.3mM MgSO4以触发囊体内的酸化后以2.5μM protonphore FCCP终止。荧光检测分别在495及540nM激发波长下进行，狭缝宽度为5nm(Zhen，R.G.，等，J.Biol.Chem.，26923342-23350(1994))。以加入特异抑制剂氨基亚甲基二膦酸(Zhen，R.G.，等，Plant Physiol.，104153-159(1994))的方式进一步验证了H+的转运是由AVP1驱动的。实施例12转基因植物叶和茎中Na+/K+比率的测定NaCl的毒害浓度首先在完全展开的叶片中形成，其中的NaCl已被区室化到液泡中。NaCl的胁迫能干扰或降低K+的吸收，导致K+缺乏并使植株生长受到抑制(Wu，S.J.等，Plant Cell，8617-627(1996))。K+浓度降低及Na+浓度升高的结果是对胞质中重要酶的抑制。此类酶例如酵母3’(2’)，5’-二磷酸核苷酸酶，其活性在K+浓度低时对Na+更敏感(Murguia，J.R.等，Science，267232-234(1995))。
也可进行测定以证明在此所述的转基因植物叶细胞或其它部位液泡中Na+的富集能力得到了提高。为了测定叶和茎中Na+/K+比率，对野生型及35SAVP1/35SAtNHX1双与单转基因植物进行水培(Gibeaut，D.M.等，Plant Physiol.，317-319(1997))。按50mM至250mM的逐级方式向生长培养基中添加NaCl(Apse，M.，等，Science，2851256-1258(1999))。在每个阶段，采集所处理植株的莲座状叶和茎并测定其重量。将样品于80℃烘烤并称取干重。将干燥样品于测定体积的水中煮沸并通过原子吸收分光光度法测定Na+和K+浓度(Apse，M.，等，Science，2851256-1258(1999))；Gaxiola，R.等，Embo J.，113157-2164(1992))。实施例13确定35S AVP1转基因植物的大尺寸是因为其细胞体积更大还是它们包含更多的细胞或是两者兼而有之将茎分生组织标记指数与野生型植株的作了比较。通过形态学和解剖学观察对叶片、根和茎细胞进行测量和计数。为了确定35S AVP1转基因植物的大尺寸是否因为其包含更多的细胞，将其茎分生组织标记指数与野生型植株的作了比较。
使用5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)检测DNA的合成及细胞增殖，此物质能替代胸腺嘧啶核苷酸整合到DNA中。利用抗BrdU单克隆抗体及抗鼠免疫球蛋白-碱性磷酸酶次级抗体对其DNA中整合有BrdU的细胞进行检测。在光学显微镜下观察结合的抗BrdU单克隆抗体，确定DAPI染色与BrdU阳性的比率。此方案从Chiatante及其同事(Levi，M.等，Physiol.Plant.7168-72(1987))所发表的修改而来，BrdU标记及检测试剂盒II由Boehringer Mannheim提供。将植株以BrdU标记培养基处理不同时间后按Meyerowitz及其同事所述的方法(Drews，G.等，PlantMol.Biol.Rep.5242-250(1988))进行固定、石蜡包埋及切片。
为对叶组织进行观察，将新鲜组织包埋于5％的琼脂糖中，然后以微切割器进行切片。为了观察主根，在室温下以50％乙醇、5％乙酸及3.7％甲醛固定幼苗4小时，然后以系列梯度的乙醇使其脱水，并以二甲苯渗透后再用石蜡浸润。以0.05％甲苯胺蓝染色8μm的切片，再显微镜下计数细胞。细胞大小观察和测定的替代方法如Greenberg及其同事所述(Rate，等，The Plant Cell，111615-1708(1999))。
使用Wisconsin Madison大学的拟南芥基因敲除工具(www.biotech.wisc.edu/NewServicesAndResearch/Arabidopsis)从60，480个已转化有T-DNA载体pD991的拟南芥属(WS生态型)品系中搜寻AtCLC-c、AtCLC-d、AVP1、AtNHX1及其同系物中T-DNA的插入。以上基因敲除体的表型将有助于理解这些转运蛋白在正常和胁迫条件下的生理功能。基因敲除植物的初步表征包括其耐盐性评价及Na+/K+比率的测定。通过它们之间及与35SAVP1及35SAtNHX1转基因植物之间杂交产生双敲除体将有助于进一步理解转运体之间的相互作用。
按照Wisconsin大学网站上所说明的原则设计PCR引物去搜寻拟南芥敲除体。测试引物提交到Wisconsin Madison大学进行62个PCR反应，反应产物返回给我们进行Southern杂交分析。对阳性PCR产物测序。如果测序结果表明基因中有T-DNA的插入，则提交此基因的特异引物进行另一组PCR反应以确定从225个库中筛选出的9个可能的库中哪一个库包含基因敲除。在鉴定出感兴趣的库后，从25管种子中筛选含T-DNA敲除的单个植物。实施例15植物细胞阳离子解毒在此所述的研究与其它证据一起有力地证明了酵母和植物在囊泡从高尔基网络到液泡的运输上享有共同的途径和信号(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480-1485(1999)；Marty，F.，”TheBiogenisis of VacuilesInsights from Microscopy.InThe PlantVacuole，1-42，Leigh R.A.and Sanders，D.，Academic Press，San Diego，California，1(997)；Bassham，D.C.等，Plant Physiol，117407-415(1998))。
尽管不愿为理论所束缚，本发明人还是相信，在两个体系中，胞质中阳离子毒性的解除及其向液泡或直接向细胞外转移的动力实体是前液泡区室。Gefl氯化物通道及Nhxl Na+/H+交换体已都被定位到酵母前液泡区室中(Gaxiola，R.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480-1485(1999))。对酵母细胞体内gefl-GFP嵌合体的监测表明它们位置的变化依赖于环境条件。此外，拟南芥4个CLC氯化物通道基因中的2个即CLC-c及CLC-c基因都显示可以抑制gefl突变体表型，暗示其位置的相似(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954046-4050(1998))。
为了理解植物细胞阳离子解毒是怎样及在哪儿进行的，对AVP1、AtNHX1及AtCLC-c与d(Hong，B，等，Plant Physiol.，1191165-1175(1999))的GFP嵌合体在细胞内的位置进行了活体监测。也利用了共聚焦显微镜确定不同转运蛋白共同定位。为达到这个目的，需要HA-标记形成的转运蛋白或转运蛋白的抗体进行研究(Guiltinan，M.J.等，Meth.Cell Biol.，49143-151(1995)；Jauh，G.Y.等，Plant Cell，111867-1882(1999)；Mullen，R.T.等，Plant.J.，12313-322(1997))。
利用了Davis和Viestra所报道的拟南芥荧光增强可溶型GFP(Davies，S.J.，Viestra.R.D.，Soluble derivatives of greenfluorescent protein(GFP)for use in Arabidopsis thaliana，http//brindabella.mrc-lmb.cam.ac.uk/IndexGFP.html(1998))构建了GFP嵌合体。制备了两类GFP嵌合体，即一类受天然启动子调控，另一类受35S启动子渗入。以电穿孔法将包含GFP嵌合体的所得T-DNA载体转化到根癌农杆菌菌株GV3101中，以用于其后拟南芥(Columbia生态型)的真空渗入(Bechtold，N.等，C.R.Jeances Acad.Sci.Ser.IIISci.Vie，3161194-1199(1993))。对血凝素(HA)的表位标记，使用了PCR策略，它是为酵母设计的但作了改进以标记在酵母载体中表达的植物基因。Futcher及其同事设计了一个包含其两侧为附加表位(HA)正向重复的URA3基因的载体(Schneider，B.L.等，Yeast，111265-1274(1995))。Tag-URA-tag序列组件以PCR扩增而使所获PCR片段在目标基因的两端具有同源性。利用酵母体内重组将此PCR嵌合物整合至携带植物目标ORF的质粒中，以URA+表型筛选转化体。当阳性转化体在存在5-氟-乳清酸的环境中生长时，URA-3基因就“显现出来”。携带该植物基因的载体具有与URA-3基因不同的选择标记。
总之，通过对有重要经济意义的农作物体内液泡V-PPase的控制，为作物改良提供了一条重要的途径。耐旱及耐冻栽培品种为由于干旱或少雨而减产的地区提供了新的农艺方法，并使农民免受突然霜冻(冰雹等)的影响。这样的作物也能够在含盐量太多以至于野生作物不能生长的土壤中种植。
尽管本发明是以有关优选实施方案为例进行描述的，本领域技术人员将会很容易理解，可在不背离本发明附加权利要求书所规定的本发明原则或范围的前提下，对本发明作出各种变更和/或修改。本说明书所引用的所有参考文献都在此引入作为参考，相当于每篇独立的参考文献都被明确而单独地指出引入作为参考。
权利要求
1.基因盒，其包含可操作地连接嵌合启动子的液泡膜焦磷酸驱动H+泵基因。
2.权利要求1的基因盒，其中液泡膜焦磷酸驱动H+泵基因是外源的。
3.编码序列，其包含可操作地连接35S启动子的双串联增强子的外源液泡膜焦磷酸驱动H+泵基因。
4.包含多核苷酸序列的表达载体，此多核苷酸序列含有外源液泡膜焦磷酸驱动H+泵基因，该基因可操作地连接35S启动子的双串联增强子，并进一步可操作地连接多克隆位点。
5.抗旱及抗冻的转基因植物，其包含这样的多核苷酸序列，此多核苷酸序列中含有可操作地连接启动子的外源液泡膜焦磷酸驱动H+泵基因。
6.权利要求5的抗旱及抗冻的转基因植物所产生的种子。
7.权利要求6的种子所产生的后代植物。
8.抗旱及抗冻转基因植物，该植物包含如下多核苷酸序列，此多核苷酸序列含有可操作地连接35S启动子的双串联增强子的外源液泡膜焦磷酸驱动H+泵基因。
9.含多核苷酸序列的转基因植物，此多核苷酸序列包含有多个可操作地连接35S启动子的双串联增强子的外源液泡膜焦磷酸驱动H+泵基因，其中，焦磷酸驱动H+泵基因的数目足以在液泡膜上表达足量的液泡膜焦磷酸驱动的H+泵，从而产生与野生型植物相比的抗旱及抗冻性。
10.耐盐转基因植物，其包含一个或多个转化有改变植物中液泡焦磷酸酶表达的外源核酸的植物细胞。
11.权利要求10的转基因植物，其中外源核酸编码AVP1。
12.权利要求11的转基因植物，其中外源核酸编码AVP1的同系物。
13.权利要求12的转基因植物，其中AVP1的同系物来自烟草、细菌、番茄或玉米。
14.权利要求12的转基因植物，其中AVP1存在于设计用来超量表达AVP1或设计用来下调内源焦磷酸酶的结构中。
15.权利要求14的转基因植物，其中该结构包含可操作地与35S启动子的双串联增强子连接的AVP1。
16.权利要求12的转基因植物，其中AVP1来源于与该转基因植物野生型对应的野生型植物。
17.权利要求12的转基因植物，其中AVP1来源于不与该转基因植物野生型对应的野生型植物。
18.能在抑制其对应非转基因植物生长的盐浓度中生长的转基因植物。
19.权利要求18的转基因植物，其中盐浓度为约0.2M至约0.3M。
20.权利要求11的转基因植物，其中该植物比对应的非转基因植物大。
21.权利要求11的转基因植物的转基因后代。
22.权利要求11的转基因植物产生的种子。
23.从权利要求22的种子所产生的后代转基因植物。
24.耐盐转基因植物，其包含外源核酸结构，此结构被设计用于超量表达AVP1或被设计用于下调内源焦磷酸酶。
25.权利要求24的转基因植物的转基因后代。
26.权利要求24的转基因植物产生的种子。
27.从权利要求26的种子所产生的后代转基因植物。
28.权利要求14的转基因植物，其中该结构包含AVP1基因，该基因可操作地连接35S启动子的双串联增强子。
29.包含可操作地连接嵌合启动子的AVP1基因的结构，此结构被设计用于超量表达AVP1或被设计用于下调内源焦磷酸酶。
30.权利要求29的结构，其中AVP1基因可操作地与35S启动子的双串联增强子连接。
31.转基因植物，其通过向植物中导入改变植物中液泡焦磷酸酶表达的外源核酸而获得。
32.植物细胞，包含改变植物细胞中液泡焦磷酸酶表达的外源核酸。
33.权利要求32的植物细胞，其中植物细胞为根细胞或茎细胞。
34.权利要求32的植物细胞，其中外源核酸编码AVP1。
35.权利要求34的植物细胞，其中AVP1存在于被设计用于超量表达AVP1或被设计用于下调内源焦磷酸酶的结构中。
36.权利要求35的植物细胞，其中该结构包含AVP1基因，该基因可操作地连接设计用于超量表达AVP1的嵌合启动子。
37.权利要求36的植物细胞，其中AVP1基因可操作地连接35S启动子的双串联增强子。
38.权利要求34的植物细胞，其中AVP1来源于与转基因植物野生型对应的野生型植物。
39.权利要求34的植物细胞，其中AVP1来源于不与转基因植物野生型对应的野生型植物。
40.制备耐盐转基因植物的方法，包括向植物的一个或多个细胞导入可改变植物中液泡焦磷酸酶表达的外源核酸以产生该植物的转化细胞，由此产生耐盐转基因植物。
41.权利要求40的方法，还包括从转化细胞再生植株以产生转基因植物，并筛选耐盐转基因植物，由此产生耐盐转基因植物。
42.权利要求40的方法，其中外源核酸编码AVP1。
43.权利要求42的方法，其中AVP1存在于被设计用于超量表达AVP1或被设计用于下调内源焦磷酸酶的结构中。
44.权利要求43的方法，其中该结构包含AVP1基因，该基因可操作地连接设计用于超量表达AVP1的嵌合启动子。
45.权利要求44的方法，其中AVP1基因可操作地与35S启动子的双串联增强子连接。
46.权利要求42的方法，其中AVP1来源于与该转基因植物野生型对应的野生型植物。
47.权利要求42的方法，其中AVP1来源于不与该转基因植物野生型对应的野生型植物。
48.权利要求40的方法，其中该植物能耐受抑制相应非转基因植物生长的盐浓度。
49.权利要求48的转基因植物，其中盐浓度为约0.2M至约0.3M。
50.通过权利要求40的方法产生的转基因植物。
51.制备耐盐转基因植物的方法，包括向植物的一个或多个细胞导入设计用于超量表达AVP1的核酸结构以产生转化细胞，由此产生耐盐转基因植物。
52.权利要求51的方法，还包括从转化细胞再生植株以产生转基因植物，并筛选耐盐转基因植物，从而获得耐盐转基因植物。
53.由权利要求51的方法产生的转基因植物。
54.制备比其对应野生型植物大的转基因植物的方法，包括向植物的一个或多个细胞导入可改变植物液泡焦磷酸酶表达的核酸结构以产生转化细胞，由此产生比其对应野生型植物大的转基因植物。
55.权利要求54的方法，还包括从转化细胞再生植株以获得转基因植物并筛选比其对应野生型植物大的转基因植物，由此产生比其对应野生型植物大的转基因植物。
56.权利要求54的方法，其中外源核酸编码AVP1。
57.权利要求56的方法，其中AVP1存在于被设计用于超量表达AVP1或被设计用于下调内源焦磷酸酶的结构中。
58.权利要求57的方法，其中该结构包含AVP1基因，该基因可操作地连接设计用于超量表达AVP1的嵌合启动子。
59.权利要求48的方法，其中AVP1基因可操作地连接35S启动子的双串联增强子。
60.权利要求56的方法，其中AVP1来源于与该转基因植物野生型对应的野生型植物。
61.权利要求56的方法，其中AVP1来源于不与该转基因植物野生型对应的野生型植物。
62.权利要求54的方法，其中转基因植物在土壤中栽培。
63.权利要求54的方法，其中转基因植物用水培法栽培。
64.由权利要求54的方法产生的转基因植物。
65.对土壤进行生物除污的方法，包括在土壤中种植一种或更多种转基因植物和/或其后代，其中转基因植物和/或其后代包含改变植物液泡焦磷酸酶表达的外源核酸。
66.增加植物产量的方法，包括向植物的一个或多个细胞导入可改变植物液泡焦磷酸酶表达的核酸以产生转化细胞，由此增加植物产量。
67.权利要求66的方法，还包括从转化细胞再生植株以获得转基因植物并筛选比其对应野生型植物大的转基因植物，从而增加植物产量。
68.从可支持植物生长的介质中除去阳离子的方法，包括在此介质中种植一种或更多种转基因植物和/或其后代，其中转基因植物和/或其后代包含改变植物液泡焦磷酸酶表达的外源核酸。
69.权利要求68的方法，其中该介质选自土壤和水。
70.权利要求68的方法，其中阳离子选自钠、钙、锰和铅。
71.产生能在盐水中生长的转基因植物的方法，包括向植物的一个或多个细胞导入可改变植物液泡焦磷酸酶表达的外源核酸以产生转化细胞，由此产生能在盐水中生长的转基因植物。
72.权利要求71的方法，还包括从转化细胞再生植株以产生转基因植物并筛选能在盐水中生长的转基因植物，由此产生能在盐水中生长的转基因植物。
73.权利要求71的方法，其中盐水的浓度为约0.2M至约0.3M。
74.权利要求73的方法，其中盐水为海水。
75.耐盐转基因植物，其包含一个或多个转化有外源核酸的植物细胞，该外源核酸可改变植物中液泡焦磷酸酶及Na+/H+反向转运蛋白的表达。
76.权利要求75的转基因植物，其中液泡焦磷酸酶为AVP1或其同系物。
77.权利要求76的转基因植物，其中AVP1的同系物来源于烟草、细菌、番茄或玉米。
78.权利要求76的转基因植物，其中AVP1存在于被设计用于超量表达AVP1或被设计用于下调内源焦磷酸酶的结构中。
79.权利要求78的转基因植物，其中该结构包含可操作地与35S启动子的双串联增强子连接的AVP1。
80.权利要求75的转基因植物，其中Na+/H+反向转运蛋白为AtNHX1或其同系物。
81.权利要求75的转基因植物的转基因后代。
82.权利要求75的转基因植物产生的种子。
83.从权利要求82的种子所产生的后代转基因植物。
84.制备花尺寸比其对应野生型植物增大的转基因植物的方法，包括向植物的一个或多个细胞导入可改变植物液泡焦磷酸酶表达的核酸以产生转化细胞，由此产生花尺寸比其对应野生型植物大的转基因植物。
85.权利要求84的方法，其中外源核酸编码AVP1。
86.通过权利要求84的方法产生的转基因植物。
全文摘要
能在盐化介质中生长的抗胁迫、超大转基因植物，其含有导致液泡焦磷酸酶表达上调的多核苷酸序列。进一步公开了该转基因植物所产生的含有此多核苷酸序列的种子以及由其种子产生的后代植物。
文档编号C12N5/10GK1399512SQ00816302
公开日2003年2月26日 申请日期2000年11月10日 优先权日1999年11月10日
发明者R·A·盖欧拉 申请人:康涅狄格州大学, 怀特黑德研究所