专利名称：一种儿童先天性耳聋基因分析检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因检测产品，具体的说，涉及一种有关儿童先天性耳聋基因分析检测的试 剂盒。
背景技术：
先天性耳聋是指因父母的遗传因素或母亲在妊娠过程、分娩过程中的异常造成的耳聋。 分为传导性、感音神经性和混合性三类，并大多为感音神经性耳聋。有时还可以伴有其它部 位畸形，如眼、牙齿、毛发、颈部、四肢等畸形。由于先天性耳聋分为遗传性耳聋和非遗传 性耳聋；并且又分为传导性、感音神经性和混合性三类。因此只有早日将其确诊并区别开来， 才能获得更好更有效的治疗效果。
先天性耳聋现有的治疗方法是无论年龄大小， 一旦发现则需要马上治疗。以现在医疗水 平，越早发现先天性耳聋，越有好的治疗效果。
因此，人们希望有一种简便而客观的方法可以进行儿童先天性耳聋基因检测，做到早发 现、早诊断，提早采取预防和治疗措施。
发明内容
为了可以简便而客观地对儿童先天性耳聋进行测试，本发明提供一种儿童先天性耳聋基
因分析检测试剂盒，可以以儿童DNA样本为测试样本，对儿童先天性耳聋的基因进行检测，
从而简便快捷地测试其先天性耳聋。
该试剂盒由DNA抽提试剂，预混PCR反应液，标准阳性对照品，标准阴性对照品组成。
使用时以被测儿童的DNA样本为检测对象，经过样本DNA抽提后，使用试剂盒在荧光定量PCR
仪上进行反应，结合反应结果进行诊断。
上述的预混PCR反应液含有SYBR green I，以及扩增与儿童先天性耳聋GJB2基因相关
突变的引物；扩增GJB2基因上第235位缺失型的引物序列如下
上游引物FlDel: 5-C CAC ATC CGG CTA TGG GTC T-3 20bp， 上游引物F1CI: 5-CAC ATC CGG CTA TGG GTC C-3 19bp， 下游引物R1: 5-TCT CCC CCT TGA TGA ACT TCC T-3 22bp; 扩增GJB2基因上16个碱基缺失型的引物序列如下 上游引物F2I: 5-GCC AGG CTG CAA GAA CGT G-3 19bp， 下游引物R2I: 5-ACGTGCATGGCCACTAGGAG-3 20bp， 上游引物F2Del: 5陽CTGCAAAGGAGGTGTGGGG-3 19bp， 下游引物R2Deh 5-GGGGAAGTAGTGATCGTAGCTGG-3 23bp。
上述的儿童先天性耳聋基因分析检测试剂盒，其特征在于所述的阳性对照品有2个， 分别包含如下的序列SEQ1:
TCTCCCCCTT
TGCATGGCCA
CCATAGCCGG
TGCAGCCTGG
CACACCTCCT
SEQ2:
TCTCCCCCTT
TGCATGGCCA
CATAGCCGGA
GTGTTGCAGA
CCTTTGCAG。
GATGAACTTC CTAGGAGCGC ATGTGGGAGA CTGCAGGGTG TTGCAG;
CTCTTCTTCT TGGCGTGGAC TGGGGAAGTA TTGCAGACAA
CATGTCTCCG ACGAAGATCA GTGATCGTAG AGTCGGCCTG
GTAGGCCACG GCTGCAGGGC CACACGTTCT CTCATCTCCC
GTAGGCCACG GTTGCAGGCC TGGCTGCAGG CCCCACACCT
GATGAACTTC CTAGGAGCGC TGTGGGAGAT
CTCTTCTTCT
TGGCGTGGAC
GGGGAAGTAG
CATGTCTCCG
ACGAAGATCA
TGATCGTAGC
CAAAGTCGGC
CTGCTCATCT
上述的儿童先天性耳聋基因分析检测试剂盒，其特征在于所述的阴性对照品包含的序 列为
TTCGTTATTG AATCTTGTTT TGGTTCTCTT GTGTGGAATG CATTGTTCTT GCTTCTCTGG AACTTGGGAT ATGATGACAA AAATACGATA TCTCTAAGGC TAATTGCTGT GCGGATGAAA TATATTTGCA CGTCAGTCTG ATCCCATTAT GTATATAACA TTAGGAGTTG GTGCATGCTC。
本发明的使用可在儿童的任何年龄阶段进行，以做到早发现，早治疗；只需取其DNA样 本，比如口腔样本，操作简便。能为儿童先天性耳聋的临床诊断提供有价值的参考信息，提 早采取预防和治疗措施，有利于使儿童患者得到更好的治疗效果。
图1，图2，图3,图4，图5，图6为荧光定量PCR仪上的扩增曲线图。各图上方的Delta RnvsCycle，是指ARn随循环变化的对数扩增图谱；ARn(DeltaRn)是指在给定的一组PCR 条件下所生成荧光信号的对数值。该图的横坐标表示循环数(CycleNumber),纵坐标表示荧 光值(DdtaRn)。横线表示荧光域值，曲线与荧光域值线的交叉点所对应的循环数即为Ct值。
图l、图2、图3中横线3表示荧光域值；曲线1表示为扩增GJB2基因上第235位缺失 型的引物对FlDel +R1，扩增样本所生成的扩增曲线；曲线2为扩增GJB2基因上第235位 缺失型的引物对F1CI +R1，这对引物扩增样本所生成的扩增曲线。
图1表示GJB2基因上第235位没有缺失的野生纯合型样本产物扩增曲线图曲线1与 荧光域值线的交叉点表示达到域值的Ct循环数值为Cl，曲线2与荧光域值线的交叉点表示达到域值的Ct循环数值为C2。
图2表示GJB2基因上第235位缺失的突变纯合型样本产物扩增曲线图曲线2与荧光 域值线的交叉点表示达到域值的Ct循环数值为C3，曲线1与荧光域值线的交叉点表示达到 域值的Ct循环数值为C4。
图3表示GJB2基因上第235位缺失型的杂合型样本产物扩增曲线图曲线1与荧光域 值线的交叉点表示达到域值的Ct循环数值为C5，曲线2与荧光域值线的交叉点表示达到域 值的Ct循环数值为C6。
图4、图5、图6中横线4表示荧光域值；曲线5表示为扩增GJB2基因上16位缺失型 的引物对F2Del + R2Del，扩增样本所生成的扩增曲线；曲线6表示为扩增GJB2基因上没有 16位缺失的引物对F21 +R2I,这对引物扩增样本所生成的扩增曲线。
图4表示GJB2基因上16位缺失纯合型产物扩增曲线图曲线5与荧光域值线的交叉点 表示达到域值的Ct循环数值为C7，曲线6与荧光域值线的交叉点表示达到域值的Ct循环数 值为C8。
图5表示GJB2基因上16位缺失杂合型产物扩增曲线图曲线5与荧光域值线的交叉点 表示达到域值的Ct循环数值为C9，曲线6与荧光域值线的交叉点表示达到域值的Ct循环数 值为CIO。
图6表示GJB2基因上没有16位缺失纯合型产物扩增曲线图曲线6与荧光域值线的交 叉点表示达到域值的Ct循环数值为Cll，曲线5与荧光域值线的交叉点表示达到域值的Ct 循环数值为C12。
具体实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采 用方法如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建 议的步骤和条件。
实施例l:
试剂盒的制备。包括(1)探针的准备；(2) DNA抽提试剂；(3)预混反应液；(4)标准 阳性对照；(5)标准阴性对照。 (1)探针的准备；
由通常的核苷酸引物合成仪合成，与儿童先天性耳聋GJB2基因相关突变的引物。 扩增GJB2基因上第235位缺失型的引物序列如下-上游引物FlDel: 5-C CAC ATC CGG CTA TGG GTC T-3 20bp, 上游引物F1CI: 5-CAC ATC CGG CTA TGG GTC C-3 19bp， 下游引物R1: 5-TCT CCC CCT TGA TGA ACT TCC T-3 22bp;扩增GJB2基因上16个碱基缺失型的引物序列如下
上游引物F2I: 5-GCC AGG CTG CAA GAA CGT G-3 〗9bp，
下游引物R2I: 5-ACG TGC ATG GCC ACT AGG AG-3 20bp，
上游引物F2Deh 5-CTGCAAAGGAGGTGTGGGG-3 19bp，
下游弓I物R2Del: 5-GGG GAA GTA GTG ATC GTA GCT GG-3 23bp 。 下游引物RI: 5-ACG TGC ATG GCC ACT AGG AG-3 20bp
上游引物FDel: 5-CTGCAAAGGAGGTGTGGGG-3 19bp
下游引物RDel: 5-GGG GAA GTA GTG ATC GTA GCT GG-3 23bp
使用前按每OD引物稀释为100pmol/L (即lOOpmol/pl)浓度的加水量，开启瓶盖溶解 之前最好在3000-4000转/分钟的转速下离心l分钟，防止开盖时引物散失。使用前，将浓溶 液稀释成工作液10pmol/ml后进行实验。
(2)DNA抽提试齐U:
试剂名称 成分 体积浓度
缓冲液GASDS 100 ml0.5 mmol/L
缓冲液GBNAOH 100 ml50 mmol/L
缓冲液GD碳酸钠-丙酮 100 ml1 mmol/L
缓冲液GW无水乙醇 100 ml原液
洗脱液 Tris盐 50 ml10 mmol/L
(3)预混PCR反应液
预混反应液包括4种，每种内含一对上下游扩增引物，各对应一个基因型。按lml配比量计算，共同的成分配制为100 的dNTP ， 20 pi; 500 U4tlTaq DNA Polymerase20^1; 2 X Quant One Step SYBR 1300 ^1; 10 的上游引物50pl;10 的下游引物50^1;
RNase-free ddH20 860 pl。
管l的l对引物为
上游引物FlDel: 5-C CAC ATC CGG CTA TGG GTC T-320bp
下游引物Rl: 5-TCT CCC CCT TGA TGA ACT TCC T-322bp
管2的1对引物为
上游引物FICI: 5-CAC ATC CGG CTA TGG GTC C-319bp
下游引物Rl: 5-TCT CCC CCT TGA TGA ACT TCC T-322bp
管3的1对引物为
上游引物F2I: 5-GCC AGG CTG CAA GAA CGT G-319bp
下游引物R2I: 5-ACG TGC ATG GCC ACT AGG AG-320bp
管4的1对引物为
上游引物F2Del: 5-CTG CAA AGG AGG TGT GGG G-319bp
6下游引物R2Del: 5-GGG GAA GTA GTG ATC GTA GCT GG陽3 23bp
(4)标准阳性对照
标准阳性模板是含有GJB2基因中含突变核苷酸片段构成的Pucl8-T重组质粒，该重组 质料转化大肠杆菌DH5a增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测 A260定量并稀释到109Copy/pl， -20°〇保存。贮存存为109Copy4U，使用浓度为105Copy/pl。
标准阳性模板提供2种，每种浓度为105Copy4U。序列如下
SEQ1:
TCTCCCCCTT
TGCATGGCCA
CCATAGCCGG
TGCAGCCTGG
CACACCTCCT
SEQ2:
TCTCCCCCTT
TGCATGGCCA
CATAGCCGGA
GTGTTGCAGA
GTGCGGGAAA
GATGAACTTC
CTAGGAGCGC
ATGTGGGAGA
CTGCAGGGTG
TTGCAG，
GATGAACTTC
CTAGGAGCGC
TGTGGGAGAT
CAAAGTCGGC
GAGCAGTGGT
CTCTTCTTCT TGGCGTGGAC TGGGGAAGTA TTGCAGACAA
CTCTTCTTCT
TGGCGTGGAC
GGGGAAGTAG
CTGCTCATCT
GGCCACAAAA
CATGTCTCCG ACGAAGATCA GTGATCGTAG AGTCGGCCTG
GTAGGCCACG GCTGCAGGGC CACACGTTCT CTCATCTCCC
CATGTCTCCG ACGAAGATCA TGATCGTAGC CCCCACACCT CAAGAGAAGA
GTAGGCCACG GTTGCAGGCC TGGCTGCAGG CCTTTGCAGAT。
(5)标准阴性对照
标准阴性模板是含有拟南芥基因片断180个核苷酸构成的Pucl8-T重组质粒。该重组质 料转化大肠杆菌DH5ot增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测 A260定量并稀释到109Copy/Vl， -20。C保存。贮存存为109Copy l，使用浓度为105Copy/pl。 序列如下
SEQ3:
TTCGTTATTG AATCTTGTTT TGGTTCTCTT GTGTGGAATG CATTGTTCTT
GCTTCTCTGG AACTTGGGAT ATGATGACAA AAATACGATA TCTCTAAGGC
TAATTGCTGT GCGGATGAAA TATATTTGCA CGTCAGTCTG ATCCCATTAT
GTATATAACA TTAGGAGTTG GTGCATGCTC。
实施例2:试剂盒的使用 (1)样本的制备
取样方式使用棉签在面颊内擦拭IO次。
注意为了保证样本不被食物或者饮料污染，取样前30分钟内请勿进食和饮水。
a)处理材料将在面颊内擦拭过的棉签转置于2ml离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆
7上剪下，加入400pl缓冲液GA。
b) 加入20pl蛋白酶K溶液，涡旋IO秒混匀，56'C放置60分钟，其间每15分钟涡旋 混匀数次。
c) 加入400 ^1缓冲液GB,充分颠倒混匀，70'C放置10分钟，此时溶液应变清亮，简短 离心以去除管盖内壁的液滴。
d) 加200 pl无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
e) 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR中(吸附柱CR放入收集管中)， 12,000 rpm( 13,400xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。
f) 向吸附柱CR中加入500 ^1缓冲液GD, 12,000 rpm( 13,400xg)离心30秒，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。
g) 向吸附柱CR中加入700(al漂洗液PW， 12,000 rpm( 13,400xg)离心30秒，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱CR放回收集管。
h) 向吸附柱CR中加入500 pl漂洗液PW， 12,000 rpm( 13,400xg)离心30秒，倒掉收集 管中的废液。
i) 将吸附柱CR放回收集管中，12,000 ipm ( 13,400xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸附 柱CR室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗。
j)将吸附柱CR转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50 ^tl洗脱缓冲 液TB，室温放置2-5分钟，12,000 rpm( 13,400xg)离心2分钟。重复一次。
(2) 实验过程
a) 按样品数n (样品数=待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个)取预混PCR反应液 每管23 pl分装于反应管中。
b) 将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照(务必振荡混匀数秒)各取2ul分别加入 反应管中，混匀，低速离心数秒，立即进行PCR扩增反应。
c) PCR条件 95 。C 10 sec
(95°C 15 sec, 60°C 60 sec)X40个循环
(3) 结果分析与判断
a)定量检测SNP的判断标准
两曲线的Ct值之差的绝对值记为IACtl，当IACtl《1，判断为杂合型；当IACtl》5 ，判断
为纯合型。
如图，图l中IACtl》5，表示该样本为GJB2-5-DD纯合型样本。图2中，|ACt|》5，表 示该样本为GJB2-5-II纯合型样本。图3中，|ACtl《l，表示该样本为GJB2-5-ID杂合型样本。 图4中IACtl^5，表示该样本为GJB2-16-DD纯合型样本。图5中，|ACt|《l，表示该样本为 GJB2-16-ID杂合型样本。图6中，|ACt|>5，表示该样本为GJB2-16-II纯合型样本。b)结果分析
基因型 诊断结果
GJB2 (235缺失)+ GJB2 (16
^卩^ + 、 基因检测结果显示发生儿童先天性耳聋的机率比较大。 碱基缺失)
GJB2 (235未缺失)+GJB2 (16
rf#+=+、 基因检测结果显示发生儿童先天性耳聋的机率比较小。 碱基未缺失)
GJB2 (235缺失型+ 16碱基缺基因检测结果显示可能发生儿童先天性耳聋，需要结
失型)的其他组合 合其他的检查手段。序列表
<110>上海裕隆生物科技有限公司 <120>—种儿童先天性耳聋基因分析检测试剂盒 <160> 10
<210> 1 <211>20 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223〉根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童先天性耳聋基因分析检 测试剂盒中检测GJB2基因上第235位缺失型的DNA引物，命名为上游引物FlDel。 <400> 1
ccacatccgg ctatgggtct 20
<210>2 <211〉 19 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童先天性耳聋基因分析检 测试剂盒中检测GJB2基因上第235位缺失型的DNA引物，命名为上游引物F1CI。 <400〉 2
cacatccggc tatgggtcc 19
<210〉 3 <211>22 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童先天性耳聋基因分析检 测试剂盒中检测GJB2基因上第235位缺失型的DNA引物，命名为下游引物Rl。 <400> 3
tctccccctt gatgaacttc ct 22
<210>4 <211> 19 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童先天性耳聋基因分析检 测试剂盒中检测GJB2基因上16个碱基缺失型的引物，命名为上游引物F2I。 <400> 4
gccaggctgc aagaacgtg 19
10<210> 5 <211>20 <212〉 DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童先天性耳聋基因分析检 测试剂盒中检测GJB2基因上16个碱基缺失型的引物，命名为下游引物R21。 <400〉 5
acgtgcatgg ccactaggag 20
<210>6 <211> 19 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223〉根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童先天性耳聋基因分析检 测试剂盒中检测GJB2基因上16个碱基缺失型的引物，命名为上游引物F2Del。 <400〉 6
ctgcaaagga ggtgtgggg 19
<210>7 <211>23 <212>DNA <213〉人工序列 <220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童先天性耳聋基因分析检 测试剂盒中检测GJB2基因上16个碱基缺失型的引物，命名为下游引物R2Dd。 <400> 7
ggggaagtag tgatcgtegc tgg 23
<210〉 8
<211>216
<212>DNA
<213〉人属(Homo)
<400> 8
tctccccctt gatgaacttc ctcttcttct catgtctccg gtaggccacg tgcatggcca 60 ctaggagcgc tggcgtggac acgaagatca gctgcagggc ccatagccgg atgtgggaga 120 tggggaagta gtgatcgtag cacacgttct tgcagcctgg ctgcagggtg ttgcag織a 180
agtcggcctg ctcatctccc cacacctcct ttgcag 216
<210〉9
<211〉 199
<212> DNA
<213>人属(Homo)
<400> 9
11tctccccctt gatgaacttc ctcttcttct catgtctccg gtaggccacg tgcatggcca 60
ctaggagcgc tggcgtggac acgaagatca gttgcaggcc catagccgga tgtgggagat 120
ggggaagtag tgatcgtagc tggctgcagg gtgttgcaga caaagtcggc ctgctcatct 180
ccccacacct cctttgcag 199
<210> 10 <211〉 180 <212> DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana) <400> 10
ttcgttattg aatcttgttt tggttctctt gtgtggaatg cattgttctt gcttctctgg 60 aacttgggat atgatgacaa aaatacgata tctctaaggc taattgctgt gcggatgaaa 120 tatatttgca cgtcagtctg atcccattat gtatataaca ttaggagttg gtgcatgctc 180
1权利要求
1.一种儿童先天性耳聋基因分析检测试剂盒，其特征在于由DNA抽提试剂，预混PCR反应液，标准阳性对照品，标准阴性对照品组成；所述的预混PCR反应液含有SYBR green I，以及扩增与儿童先天性耳聋GJB2基因相关突变的引物；扩增GJB2基因上第235位缺失型的引物序列如下上游引物F1Del5-C CAC ATC CGG CTA TGG GTC T-3 20bp，上游引物F1CI 5-CAC ATC CGG CTA TGG GTC C-3 19bp，下游引物R1 5-TCT CCC CCT TGA TGA ACT TCC T-3 22bp；扩增GJB2基因上16个碱基缺失型的引物序列如下上游引物F2I5-GCC AGG CTG CAA GAA CGT G-3 19bp，下游引物R2I5-ACG TGC ATG GCC ACT AGG AG-320bp，上游引物F2Del5-CTG CAA AGG AGG TGT GGG G-3 19bp，下游引物R2Del5-GGG GAA GTA GTG ATC GTA GCT GG-3 23bp。
2.如权利要求1所述的儿童先天性耳聋基因分析检测试剂盒，其特征在于所述的阳性对照品有2个，分别包含如下的序列 SEQ1:TCTCCCCCTT GATGAACTTC CTCTTCTTCT CATGTCTCCG GTAGGCCACG TGCATGGCCA CTAGGAGCGC TGGCGTGGAC ACGAAGATCA GCTGCAGGGC CCATAGCCGG ATGTGGGAGA TGGGGAAGTA GTGATCGTAG CACACGTTCT TGCAGCCTGG CTGCAGGGTGSEQ2:TCTCCCCCTT GATGAACTTC CTCTTCTTCT CATGTCTCCG GTAGGCCACG TGCATGGCCA CTAGGAGCGC TGGCGTGGAC ACGAAGATCA GTTGCAGGCC CATAGCCGGA TGTGGGAGAT GGGGAAGTAG TGATCGTAGC TGGCTGCAGG GTGTTGCAGA CAAAGTCGGC CTGCTCATCT CCCCACACCT CCTTTGCAG。
3.如权利要求1或2所述的儿童先天性耳聋基因分析检测试剂盒，其特征在于 所述的阴性对照品包含的序列为SEQ3 : TTCGTTATTGAATCTTGTTTTGGTTCTCTT GTGTGGAATGCATTGTTCTTGCTTCTCTGGAACTTGGGAT ATGATGACAAAAATACGATA TCTCTAAGGC TAATTGCTGT GCGGATGAAATATATTTGCA CGTCAGTCTG ATCCCATTAT GTATATAACA TTAGGAGTTG GTGCATGCTC。
全文摘要
一种用于儿童先天性耳聋基因分析检测试剂盒，可以及早发现儿童先天性耳聋易感性。本试剂盒由DNA抽提试剂，预混PCR反应液，标准阳性对照品，标准阴性对照品组成。使用时以被测儿童的DNA样本为检测对象，经过样本DNA抽提后，使用试剂盒在荧光定量PCR仪上进行反应，结合反应结果进行诊断。本发明的使用可在儿童的任何年龄阶段进行，以做到早发现，早治疗；只需取其DNA样本，比如口腔样本，操作简便。能为儿童先天性耳聋的临床诊断提供有价值的参考信息，提早采取预防和治疗措施，有利于使儿童患者得到更好的治疗效果。
文档编号C12Q1/68GK101684493SQ20081020058
公开日2010年3月31日 申请日期2008年9月26日 优先权日2008年9月26日
发明者汪宁梅, 穆海东, 飒 黎 申请人:上海裕隆生物科技有限公司