用于将双子叶植物种子的贮藏养料转化成包含一种或多种基因产物的组合物的方法

专利名称：用于将双子叶植物种子的贮藏养料转化成包含一种或多种基因产物的组合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种基于源-库原理的方法，该方法使转基因双子叶植物种子的贮藏养料转化成包含一种或多种目的基因产物的组合物。本发明也公开了在子叶(包括幼苗)或萌芽种子或幼苗周围介质中包含至少一种基因产物的萌芽种子源性组合物。
真菌代表大量低成本生产糖基化蛋白最有效的宿主系统。虽然真菌已经成功地用来生产大量的真菌天然蛋白，但是它们在表达异源蛋白(例如治疗型哺乳动物蛋白)方面没有获得同样的成功。
真菌现在主要用于大规模生产同源性工业用酶，而研究的焦点已经转向发现生产糖基化异源蛋白的替代表达系统。因为植物宿主系统中的糖基化模式和折叠过程类似于哺乳动物系统中的糖基化模式和折叠过程，所以迄今为止植物宿主表达系统是最经济有效的可用系统。本发明的主要目的是生产药物和工业上重要的酶类。可涉及用烟草和/或马铃薯生产干扰素、脑啡肽、表皮生长因子和人血清白蛋白。转基因植物中的表达水平一直相当低。
在植物中，外源基因一般在发育植物器官内强组织特异性植物启动子下表达。典型的实例是种子贮藏蛋白启动子或马铃薯块茎中的块茎特异性patatin启动子。或者，使用细胞或细胞器培养物和藻类培养物，以及甚至更复杂的系统，包括植物病毒型系统，其中需要基因偶联在病毒基因组内并且与病毒蛋白同时表达。最高级的系统取决于诱导表达重组蛋白并将其分泌到介质中。
美国专利5,693,506和美国专利5,994,628公开了用于在单子叶植物萌芽种子中生产外源蛋白的生产系统。在细胞培养物或萌芽种子中，重组蛋白在强淀粉酶启动子下表达，并且所述蛋白分泌到生长培养基中或从麦芽中提取。在单子叶植物种子中，贮藏养料主要由淀粉胚乳组成。与双子叶植物种子中的蛋白贮藏相比，单子叶植物中几乎没有蛋白贮藏。另外，虽然淀粉酶在特定细胞中高表达，但是在种子中也只有少量细胞表达淀粉酶。这些细胞只限于胚的盾片和胚乳的糊粉层。非常需要提供更为经济有效的系统，该系统利用双子叶植物种子中的蛋白质和油类贮藏养料。美国专利5,543,576和美国专利5,714,474公开了其中转基因种子在不进行任何催芽而以磨碎形式作为额外酶源加入到饲料混合物中。
美国专利5,670,349公开了应用创伤诱导型HMGR/GMG2启动子在从田间收获的新鲜烟草叶片中表达重组蛋白。新鲜或贮藏植物材料由于切割或压碎产生的创伤触发表达快速增加。然而，烟草叶片中的蛋白含量比从双子叶植物种子获得的蛋白含量低。此外，就时间、空间和/或贮藏成本而论，新鲜叶片的耐贮藏性比干燥种子差。新鲜植物材料(例如从田间收获的叶片)的应用也是主要微生物污染源，该问题是发酵技术中的一个严重问题。
专利申请WO94/11519和WO97/32986公开了借助发麦芽同(malting)工艺在植物中生产降解产物和转化产物的方法和植物。在所述方法中，提出所述酶在催化脂肪酸分解成乙酰辅酶A的乙醛酸循环体中有活性。这种通常用以制备有机酸(它们可以从乙醛酸循环体中输出)以及为其它代谢途径(例如呼吸作用和蔗糖合成)所利用的乙酰辅酶A应被产生可用于生产生物降解热塑性塑料的多羟基链烷酸酯途径的酶编码基因取代。
虽然发麦芽是已知的并且尤其用以制备单子叶植物，但是值得注意的是所述工艺只限于加工淀粉。即使在专利WO94/11519和WO97/32986中公开的方法(虽然他们提出利用双子叶植物中的贮藏养料)只限于利用产生蔗糖和能量的酶和途径以及如何应用这些呼吸途径的产物进行再合成。
虽然发麦芽是已知的并且是利用植物的呼吸途径生产多羟基链烷酸酯的方法，但是应用双子叶植物中的贮藏养料生产蛋白质性产物(例如结构蛋白和酶)还没有得到解决。
需要指出的是，非常需要蛋白质性产物，并且本发明的主要目的是解决如下问题使植物中的贮藏养料转化成不同的蛋白质性产物，该蛋白质性产物可以进一步用以生产所需产物。
本发明的主要目的是提供一种在转基因双子叶植物种子的子叶中生产基因产物、尤其是蛋白质性基因产物的新的、更可行的、更经济有效的、不污染环境的工艺和生产系统。本发明的另一个优点是提供特定用途的生产系统，其中所述基因产物可以在限制条件下产生，而不是在田间产生。这使得可以在几乎无污染物的条件下实施本发明方法。
本发明的特征如权利要求书中所述。


图1B显示表达GUS基因的萌芽转基因种子。所述GUS基因与内肽酶启动子连接。
图1C显示表达GUS基因的萌芽转基因种子。所述GUS基因与水杨酸盐诱导型启动子连接。
图1D显示表达GUS基因的萌芽转基因种子。所述GUS基因与35S启动子连接。
图2显示无色底物β-葡糖苷酸(100μg/ml)，萌芽转基因种子产生的GUS酶将其酶促转化成蓝色吡喃葡糖苷酸和糖苷配基。
图3图示油菜(Brassica campestris)种子的各种萌发阶段，表示为开始萌发后的天数。
图4显示萌芽种子的SDS-PAGE凝胶。从干燥种子开始，每天收集样品。考马斯染色凝胶上标记出贮藏蛋白和Rubisco亚基。如图所示，萌发三天后，每天产生的Rubisco蛋白量显著增加。
图5显示采用RNA探针的萌芽种子的RNA印迹。从干燥种子开始，每天收集样品。
发明详述定义本发明中所用的大多数术语与它们在重组DNA技术领域、分子生物学领域和植物学领域、尤其是与转基因植物和基因产物的生产有关的领域中的一般含义相同。然而，使用的有些术语多少有些不同，下文对其进行更详细的解释。
术语“种子植物”是指高等植物种子植物门(Spermatophyta)，其特征在于包括完全发育的器官如根、茎、叶、花和维管系统在内的复杂结构。种子植物可分为两类被子植物和裸子植物。被子植物还可分为两个亚类，即单子叶植物和双子叶植物。单子叶植物成熟种子的胚仅包含一个子叶，该子叶已退化成吸收性盾片。在双子叶植物中，胚具有两个用作贮藏器官的子叶。在双子叶植物子叶中，需要贮藏沉积的同化物通过维管系统从母本植株运往种皮，最终运到子叶。种皮是母本组织，并且与胚没有共质性连接。同化物进入质外体空间，然后由胚摄入，进行共质重分配，用于合成养料。
术语“双子叶植物种子”是指得自双子叶植物的种子，与主要由糖类和非常少量的其它化合物组成的单子叶植物种子的贮藏养料相反，双子叶植物种子包含多用途贮藏养料，包括存在于子叶中的蛋白质、脂质和糖类。在本发明中，“双子叶植物种子”是指完整种子或预压碎种子(最好以干燥形式)获得的种子碎片。需要指出的是本发明涉及双子叶植物，而单子叶植物不能用来实现本发明目的。
按照本发明的方法，可用于生产目的基因产物的最优选植物属包括但不限于在种子中具有高蛋白质或油含量的双子叶植物。典型实例是以下植物属十字花科科(Brassicaceae)、蝶形花科(Fabaceae)和蓼科(Polygonaceae)。十字花科属包括例如以下种蔓菁(Brassicanapus)、油菜(Brassica campestris)、Camelina sativa、白芥(Sinapisalba)，蝶形花科属包括Lupinus angustifolius、菜豆(Phaseolusvulgaris)、大豆(Glysine max)、蚕豆(Vicia faba)、兵豆(Lens culinaris)、豌豆(Pisum sativum)、Vigna mungo和紫苜蓿(Medicago sativa)。蓼科属包括蓼属(Polygonum)种。此外，向日葵(Helianthus annuus)种子中由于高含油量也是潜在有用的植物。
术语“源-库原理”是指生产系统或生产实体，它可以分为两个不同的阶段，积蓄期(其中使蛋白质、糖类和脂质养料贮藏到种子中)和动员期/生产期(其中通常动员用于起动植物生长的积蓄养料代之以通过触发表达系统动员或用以生产一种或多种目的外源基因产物)。积蓄期包括栽培在田间基本上不表达所述基因产物的转基因植物，而所述基因产物的生产只限于限制条件下的萌发阶段。这可通过表达系统的特异性实现，详见本说明书下文。
术语“周围介质”是指液体、半固体或固体形式中的缓冲水溶液，它包含能够起始、增强、延迟或延长萌发最有利阶段的物质。“周围介质”可以包含上调某些过程的萌发诱导因子和/或下调某些其它过程的萌发诱导因子以及外部养分。“周围介质”也可以是湿润场所或房间。
术语“底物”是指固体、半固体或液体组合物或培养基，它包含的至少一种化合物或物质可以通过利用本发明的组合物(包含一种或多种目的基因产物催化剂)转化成更需要特性的另一种化合物或物质。
术语“种子源性组合物”是指可得自双子叶植物萌芽种子通过本发明方法生产的粗制混合物，所述混合物包含在双子叶植物萌芽种子(包括幼苗)的子叶中表达或分泌到萌芽种子或幼苗周围介质中的一种或多种从头合成的基因产物。“种子源性组合物”可以通过将其与底物接触而原样使用。当然种子源性组合物可以干燥和/或用合适的下游加工方法处理以及在使用之前进行分离和/或纯化。或者，所述底物是一种包含一种或多种能够修饰所述组合物中的一种或多种基因产物的化合物的试剂。例如，可以加入取代基或可以修饰基因产物的折叠模式或者除去或添加片段或部分，以便得到更稳定的产品。所述“种子源性组合物”也可以进行配制，即加入合适的添加剂，诸如制粒改善剂、填充剂、润滑剂等。也可以将本发明的萌芽种子源性组合物加入到动物饲料中，以改善饲料的消化特性。
术语“大致无菌的源-库生产系统”是指可以用诸如辐照消毒或化学消毒的方法对双子叶植物种子进行表面消毒。采用适用于无菌操作法和/或当在无菌或超净条件下操作时的方法，可以在预消毒的周围介质中或周围介质上进行所述萌发。全部生产都可以在无菌条下进行的事实是指可以避免种子被杀死或不发芽的主要原因，即可以避免种子污染真菌或细菌。此外，终产物也是基本上无污染物并且不易被具有蛋白酶解活性的污染物降解。因此，所述生产系统也特别适合用于生产要求高卫生标准的药用制品。
术语“起始转基因双子叶植物种子的萌发”是指提供有利于萌发的条件。它任选包括贮藏、干燥、消毒、加水、给种子补充诱导因子以及上调因子/下调因子以及外部养分。所述补充包括物理方法或化学方法。外部养分包括例如氮源和/或碳源、维生素、矿物质、微量元素等。生长因子、萌芽触发因子、诱导因子、在从头合成期间能够上调某些过程和下调其它过程的因子，包括例如植物激素(诸如植物生长素和细胞分裂素)。所述物理方法包括例如快速光照或长时间光照以及消毒和/或加热。
术语“表达系统”是指包含编码一种或多种目的基因产物、与诸如增强子、启动子和/或终止子的表达调节序列有效连接的一种或多种DNA序列的DNA构建体。所述表达系统最好使得它可被诱导或可在种子萌发过程中被诱导，但是如果双子叶植物在田间条件下增殖和栽培时它基本上沉默或可以将其沉默。所述表达调节序列最好包含一种可称为“暗箱(camera obscura)”启动子的启动子，即在无光照条件的暗房中保存种子时，在萌发时触发或在萌发期间激活的启动子。这不排除使用照明或光。反之，对所述源-库生产系统进行快速光照可以通过诱导和增强特异性启动子的活性来增加目的基因产物的产量。
所述表达系统利用这样的表达调节序列该表达调节序列尤其在起始萌发过程中从头合成过渡蛋白(积蓄在子叶中)时有活性。
所述诱导型表达系统包含的诱导型调节序列选自在起始萌发过程中从头合成并积蓄在植物的子叶和胚乳中的过渡蛋白的编码基因的调节序列。
通过选择合适的调节序列可以制备所述表达系统。选择方法包括如下步骤(a)从双子叶植物的子叶和/或叶片中分离总RNA；(b)用一种植物特异性引物和对起始萌发过程中从头合成并积蓄在所述植物的子叶和胚乳中的蛋白质具有特异性的引物，由所述分离RNA通过扩增制备cDNA；(c)收集并平板接种包含所述cDNA的克隆；(d)比较得自叶片源性RNA的克隆结果；和(e)回收显示在双子叶植物萌芽种子中活性增加的包含所述cDNA的克隆。
本发明中的术语“基因产物”是指蛋白质、多肽，包括结构蛋白和/或酶。所述“基因产物”通常是包含通过肽键连接在一起的至少两个氨基酸的肽。包含2-10个氨基酸的肽称为寡肽，而包含10个氨基酸以上的肽称为多肽。多肽可以是聚氨基酸链，例如仅由赖氨酸分子组成的聚赖氨酸链，但它也可以是蛋白质、蛋白质复合物或所述蛋白质的一部分或片段。
上段所述术语“基因产物”也可以指核苷酸型产物，例如mRNA。在所述术语中也包括例如可通过生物转化方法获得的其它所需生物化学品、化合物或物质，其中在本发明的种子源性组合物中存在的一种或多种所述基因产物当与底物接触时起催化剂作用，所述底物包含的化合物或物质可以转化成所需产物或按所需方式转化所述基因产物。
另一方面，“基因产物的衍生物”可应用转化方法获得，其中一种或多种本发明原始“基因产物”的修饰是通过让存在于所述底物中的试剂对其进行的修饰。所述基因产物可以通过改变其二级结构和/或三级结构而变得更稳定或更有活性，例如通过重折叠或不折叠氨基酸链、除去或添加片段、使结构或取代基与所述基因产物络合或加入到所述基因产物中。这样的“基因产物的衍生物”也包括在本发明的术语“基因产物”的范围内。通过本发明方法生产的基因产物通常为异种外源蛋白。这表明野生型植物不产生所述“基因产物”。换句话说，所述“基因产物”对于所述宿主植物不是天然的。不用说，运用本发明的方法可以生产天然种子产品。它尤其可用来增加某些药学上有效的天然同源植物源性制品的产量。
术语“用或不用下游加工法回收转基因双子叶植物萌芽种子表达的基因产物”是指用或不用任何下游加工法通过将子叶(包括幼苗)与周围液体介质分开，可以原样回收所述子叶(包括幼苗)。或者，原样回收所述周围介质。通过干燥、提取、过滤、压碎等可以改善所述“种子源性组合物”的耐贮藏性。这些方法中的许多方法可同时用来终止萌芽。在所需基因产物的从头合成速率下降和/或浓度降低之前，通常用加热、干燥、压碎、分离、提取、挤压和过滤终止萌芽。由于萌发的持续时间太长，就开始再使用从头合成的所需蛋白产生新生植株所需的其它物质，因此终止过程极其重要。本发明的一般描述双子叶植物萌芽种子中的贮藏养料(包括释放的氨基酸和其它生化底物)包含可再生的原料源实体，而所需转基因的表达通过转录调节、在萌发期间的子叶中以及对随后的幼苗生长起作用均构成生产(库)实体。因此，本发明尤其涉及包含两种实体—源和库的生产系统，即两个独立阶段—原料积蓄期和生产期，其中原料源用以从头合成所述基因产物以及由第一阶段生产系统获得的原料源的基因产物修饰产生的其衍生物或产物。
本发明的目的是开发一种基于源-库生产系统新方法，用以在双子叶植物种子中生产基因产物。所述生产系统包括两个不同的阶段。第一个阶段利用多用途的再生性原料资源(诸如蛋白质和油)，所述原料资源是栽培期间积蓄在双子叶植物中的贮藏养料，并且可以任选以种子形式收获。第二个阶段包括动员在萌芽转基因植物中的贮藏养料，通过加入或不加入增补剂(例如营养因子)和提供物理方法和/或化学方法以及基因工程从而诱导萌发和上调和/或下调从头合成(包括转录、表达和/或分泌)，从头合成所需基因产物来生产一种或多种基因产物。
本发明在其第一阶级利用存在于双子叶植物而在单子叶植物中缺乏的多用途贮藏养料，包括蛋白质、油和/或糖类，其中所述贮藏养料主要包括两种相关形式的淀粉—直链淀粉和支链淀粉。在单子叶植物中，淀粉在萌发和随后的新生苗的生长期间由淀粉酶带动转移。所获得的蔗糖用作能源和碳化合物源，但用于从头合成、尤其是蛋白质的原料比双子叶植物少得多，使得双子叶植物萌芽种子成为无可比拟的极好的源-库生产系统。
在本发明中，转基因双子叶植物种子常规从田间收获、运输和贮藏。贮藏种子的生活力可以保持相当长时间，通常长达数年。温度和种子含水量是决定贮藏期间种子生活力的主要因素。一般而言，种子的贮藏温度为0-5℃。贮藏种子的正常含水量为4-10％。如果含水量低于20％，则种子呼吸并产生热。如果通风条件差，则产生的热可以杀死种子。如果含水量高于20％，则可能由于微生物生长造成种子退化。
成熟干燥是种子发育中的正常过程，在成熟干燥期间种子进入代谢静止状态。然而，许多物种的种子可以不经干燥就萌芽。取自成熟果实的番茄种子，当将其放在水上时就可以发芽。在数种其它物种(包括油菜)中，在种子干燥期间，淀粉含量快速减少，而某些糖和寡糖浓度快速增加。此外，某些亲水蛋白质在干燥种子中大量表达。它们有能力吸水，认为它们在保护种子抵抗有害干燥效应方面起着重要作用。成熟干燥种子可以保持发芽能力，并且可以贮藏数天至许多年。粗制天然原料—双子叶植物种子可以稳定地贮藏多达数年。
在双子叶植物种子中，三酰甘油是亚细胞器(油体)中贮藏的脂质的主要贮藏形式。种子含油量在蓖麻籽中可以高达64％，或在油菜籽中可以高达48％。进入发育种子的蔗糖合成贮藏油。在细胞溶胶中，蔗糖转化成磷酸己糖(它被运往质体)或转化成甘油-3-磷酸(甘油主链)。在质体中，脂肪酸的合成始于磷酸己糖、苹果酸和乙酸。在内质网(ER)中，甘油主链和脂肪酸酯化成三酰甘油。
在双子叶植物种子中，在韧皮部中转运的主要氨基酸是谷氨酰胺和天冬酰胺。在种皮中，转运到子叶之前，部分谷氨酰胺和天冬酰胺转化成其它氨基酸。在子叶中，氨基酸用来合成包装于蛋白质体中的贮藏蛋白。在种子发育的早期，子叶细胞含有一个或两个大液泡，该液泡以后充满贮藏蛋白，然后逐渐分裂成不同的离散较小蛋白质体。双子叶植物种子通常含有两种或两种以上不同的贮藏蛋白。例如，油菜的总蛋白质含量为24％，含有例如2S清蛋白、napin、11S球蛋白和cruciferin。种子总蛋白质含量中，napin占20％，cruciferin占60％。在本发明中，利用所述蛋白质的编码基因切实可行。
贮藏蛋白一般由多基因家族编码。真核生物腔内质网蛋白的一个共同特征是保守的羧基端四肽KDEL，它用作ER保留信号并且总是存在于羧基末端。虽然已经认定末端20个氨基酸中的酸性残基组成对于有效保留具有一定重要性(Wandelt，C.I.等，Plant J.，2181-192，1992)，但是没有证据表明需要保留4个以上末端氨基酸(Pelham，H.R.B.，TIBS 15483-486，1990)。所提出的保留机制最可能是受体介导的，并涉及KDEL信号与膜受体的结合，然后信号-受体复合体快速反回内质网中(如果它以小泡释放的话)(Pelham，H.R.B.，TIBS15483-486，1990)。
遗传修饰蛋白不总是存在于其天然细胞区室中。例如在转基因烟草中表达的高甲硫氨酸菜豆蛋白仅存在于ER(内质网)、高尔基潴泡和高尔基小泡中。菜豆蛋白通常积蓄在烟草发育种子的蛋白质贮藏液泡基质中。结果表明，高甲硫氨酸菜豆蛋白或者在高尔基小泡中降解或者恰好在进入蛋白质贮藏液泡后降解(Hoffman，LM.等，Plant Mol.Biol.11717-730，1988)。已经报道，在烟草和苜蓿中高水平积蓄具有额外羧基末端KDEL序列的蚕豆种子贮藏蛋白豌豆球蛋白(Wandelt，C.I.等，Plant J.2181-192，1992)。与花椰菜花叶病毒35S启动子融合的修饰基因构建体和蛋白在转基因植物叶片的(ER)中积蓄。因此，似乎切实可行的是，当生产遗传修饰贮藏蛋白时，保留在ER中可以防止降解，从而在本发明中可以应用含有花椰菜花叶病毒35S启动子的DNA构建体。
cruciferin是六个亚基构成的六聚体，每个亚基含有由一个基因编码的一条链(Rdin，J.和Rask，L.，Physiol.Plant.79421-426，1990)。例如在蔓菁中，cruciferin基因在其成员中共享大约60％同源性。napin是蔓菁中第二种最重要的种子蛋白。与cruciferin亚基一样，napin是由两条不同的多肽链(用二硫键连接在一起)组成的单基因产物。cruciferin和napin均在内质网膜上合成，它们为含有内质网导向信号的前体(Ericson，M.L.等，J.Biol.Chem.，26114576-14581，1986)。
如上所述，cruciferin和napin均在其N末端含有内质网导向信号序列。蛋白质以未折叠状态进入内质网，所述信号序列在进入后立即被切除。近几年来，已经知道不是所有进入内质网的蛋白质均进一步加工并装进液泡中。内质网也含有大量的在其腔内保留并且有助于分泌蛋白成熟时的起始步骤的蛋白质。此外，在哺乳动物系统中也鉴定出了其中许多蛋白质(Pelham，H.R.B.，TIBS 15483-486，1990)，说明基因产物、尤其是蛋白质的糖基化作用在哺乳动物以及在植物中是相似的。在植物中，已经显示例如植物生长素结合蛋白保留在内质网中(Inohara，N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863564-3568，1989)。
通常在萌发期间出现的第一组蛋白酶是作用于不溶性天然贮藏蛋白的SH-依赖性蛋白酶。在Vigna mungo中，吸涨后立即起始SH-依赖性蛋白酶在子叶中的合成，并且直到第4天其合成增加，然后才减少(Okamoto，T.和Minamikawa，T.，J.Plant Physiol.，152(6)675-682，1998)。内肽酶活性从所述天然蛋白切下产生短链肽，所述蛋白进而增加对其它蛋白酶的敏感性。
第二组蛋白酶对天然贮藏蛋白无活性，但使短链肽水解成寡肽。同时也激活羧肽酶，从肽中释放氨基酸。这种蛋白酶解发生在蛋白质体中，寡肽和氨基酸释放在细胞溶胶中，其中寡肽由氨基肽酶和二肽酶或三肽酶进一步降解成氨基酸。贮藏器官释放的氨基酸进一步代谢成氨基酸的主要转运形式—天冬酰胺和谷氨酰胺。贮藏蛋白为萌发期间从头合成蛋白质的氨基酸源。
本发明方法的第二阶段包括萌发，其中移动栽培期间以双子叶植物种子的贮藏养料积蓄的原料，用以生产所需基因产物。萌发的高标度时间既快成本又低。由于原料可得自再生资源并且所需的能量输入得自太阳，因此生产量几乎是无限的。
在本发明中，萌发是指双子叶植物种子从吸水开始、呼吸作用增强和大分子合成、贮藏养料动员和亚细胞结构改变的发育过程。生理学上，萌发是止于胚轴开始延伸的短暂过程。在本发明中，萌发也包括胚轴延伸开始后的生长期。种子吸水通常不超过种子干重的2-3倍，但此后在幼苗发育中需要更多的水。萌发包含多个过程，如呼吸作用增强和大分子合成和亚细胞结构改变。萌发一般与胚根伸长一起完成，这是由于细胞膨胀而不是细胞分裂所致。萌发后按照子叶的最终结果幼苗类型有两种。在子叶留土类型的幼苗生长中，子叶不与发育幼苗一起露出土面。下胚轴短，但上胚轴伸长并使第一片真叶露出土面。在子叶出土类型幼苗生长中，子叶通过使下胚轴伸长而露出土面。在长出真叶前，子叶通常变得有光合活性。
当种子自然或在田间萌发时，它一般在干燥种子的休眠期后利用子叶的贮藏养料起始生理活性。包括基因表达在内的重要功能快速增强。有效量的氨基酸和其它生物化合物在萌发期间从子叶贮藏养料中释放，随后在幼苗生长期间发生结合。
也可以用表面消毒种子通过在水或补充对生产所需基因产物有益的化合物的水中孵育种子来起始萌发。在萌发期间，激活生产所需基因产物的基因表达。为了起始萌发，首先按照种子类型调节温度并通过压缩空气进行通气，通过将种子浸泡在水槽而使种子吸水，至含水量为40-50％。吸涨后，通常将种子移到100％湿度室中以让其发芽。通常温度为10-30℃，时间为2-10天、优选3-6天、最优选4-5天。
在本发明中，双子叶植物萌芽种子包括转基因子叶，即用编码所需基因产物的DNA序列稳定转化的双子叶植物的子叶。子叶是胚的一部分，它们作为贮藏器官。生理结构和细胞类型多样性在子叶中相当简单。子叶主要贮藏养料的动员在萌发后开始。在子叶中，三种主要形式的贮藏物质—蛋白质、油和糖类在幼苗生长期间酶促转化成转运形式。贮藏蛋白由子叶细胞中表达的一系列蛋白酶逐渐裂解。由子叶中有功能的启动子区调节的结构基因从头合成蛋白酶。
在萌发和随后的新生苗生长期间，贮藏脂质的动员在油体中由三酰甘油产生甘油和游离脂肪酸的酯解作用开始。在种子贮藏细胞中，甘油和游离脂肪酸在复杂反应中转化成蔗糖，包括许多酶和至少乙醛酸循环体和线粒体细胞器。蔗糖运往液泡或胚。
在动员期/生产期中，积蓄蛋白、糖类和脂质养料用作原材料源，并转化成商业上感兴趣的产物，而不是形成植株所需要的正常蛋白。通过将包含水的周围液体介质、半固体介质或固体介质，其中用任选的物理方法或化学方法，补充包括营养、萌芽诱导因子以及能够上调和/或下调生产中的某些步骤(转录、表达和/或分泌)的因子加入到种子中来起始动员。这种动员起始萌发，生产继续至长出绿色叶片。
已知污染是发酵技术中的一个严重问题。在大规模生产时污染分批发酵中的相当大部分(20-25％)。此外，使用新鲜植物材料的工艺(如马铃薯淀粉生产或玉米湿磨)在所述过程中也有微生物生长的问题。从田间收获的新鲜植物材料(如叶片)是可能引起终产物严重损失的主要污染源。
本发明描述了利用干燥种子为原料的系统。在田间只有有限的外源基因表达，而在工厂可控条件替代田间条件下，所述表达主要在环境安全下进行。双子叶植物干燥种子可以比单子叶植物干燥种子更易进行表面消毒，因为与单子叶植物的种子不同，双子叶植物种子通常具有致密、光滑的种皮。通过用化学药品如次氯酸盐、过氧化氢或用其它消毒化合物处理可以进行消毒。由于与单子叶植物种子的皱缩表面结构相反，双子叶植物种子具有光滑的表面，因此对双子叶植物种子消毒将有效得多。因而，可以在无菌条件下进行所需外源基因产物或天然基因产物的生产，这是一个非常好的优点，尤其当目标基因产物为治疗活性蛋白时，而且也避免了微生物降解终产物。
回收的基因产物可以基本上无污染物，可以为干燥植物种子源性组合物，所述组合物包含在转基因双子叶植物种子的萌发期间积蓄、最好是通过中断萌发过程在最大积蓄点回收的一种或多种基因产物。回收的基因产物可以为双子叶植物发芽种子的下游加工混合物或为贮藏稳定形式。所述组合物包含例如蛋白质、酶类、肽、激素、生长因子、疫苗、氨基酸、维生素和/或抗生素。
本发明运用工程改造的基因表达系统驱动合成以生产所需基因产物，并且利用萌发初期释放的氨基酸、碳化合物和其它基因产物作为用于从头合成转基因产物的原料源。在萌芽种子中形成的天然基因产物(例如蛋白酶、脂酶、淀粉酶等)可以用作转基因酶的底物或用以形成所需生物化学品。
本发明目的是提供包括至少一种表达系统的转基因植物，所述表达系统包含编码至少一种所需基因产物的至少一种DNA序列，该序列与表达调节序列功能性相关，所述表达调节序列可诱导或可以在萌发期间诱导，并且基本上沉默或当转基因双子叶植物在田间条件下生长时可以使其沉默。在黑暗(非光照条件)中有活性的启动子—本文中称为暗箱启动子(包括或多或少不依赖光的Rubisco启动子)可用于本发明的表达系统。
本发明可生产不同需要基因产物以及其它非基因生物化学品。在萌发期间表达的转基因产生第一基因产物—RNA，从中其它RNA产物可以原样获得或转化后获得。RNA期通常是暂时性的，所回收的基因产物为蛋白质性产物。主要有两种蛋白质产物—酶产物和非酶产物，它们通常为结构蛋白、疫苗、激素等。所述酶能够修饰得自植物的胞内底物，可将其转化为所需的生化化合物。或者，加入可以转化得到另一种生化化合物的胞外底物。接下来，所述蛋白质无论它是酶促活性蛋白还是非酶促活性蛋白，都可以在获得所述蛋白衍生物的情况下将其与试剂接触。
在本发明中，设计的异种外源基因或DNA序列在萌发双子叶植物子叶中最适表达。检查植物基因和异源基因之间的序列特征，以便由异源表达外源转基因。在植物中，将这些基因的结构与已知的植物基因进行比较将是有益的。已用苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)内毒素基因(cry)进行了本领域的开拓性工作。不得不在原始基因序列中进行数种修饰，以便增强富含AT的cry基因在植物中的表达。
植物中一种优选的转录起始序列是 (以粗体表示非常保守核苷酸位置)。终止密码子TGA、TAG和TAA中，第一个终止密码子稍微优选，TAA很少用于单子叶植物。按照密码子选择表可以将基因序列中的密码子转变成植物的合适密码子。应检查转变DNA序列在植物中存在减少表达的推定位点。在植物中，推定的聚腺苷酸化信号序列通常是 及其变异 和 (最保守的 核苷酸用粗体标明)。基因序列中排除的推定剪接位点是CAN7-9AGTNNA。另外，所述DNA序列应不含ATTTA序列，这是一个推定的mRNA降解元件。
转录终止子序列可得自种子中表达的不同基因或其它植物基因，例如得自Rubisco基因。可以使用得自不同细菌(例如农杆菌属(Agrobacterium))的终止子以及nos基因终止子或ocs基因终止子。nos基因编码胭脂碱合酶(Depicker，A.等，(1982)J.Mol.Appl.Genet.1561-573；Shaw，C.H.等，(1984)Nucl.Acids Res.127831-7846；和An，G.等，(1986)Mol.Gen.Genet.203245-250)。ocs基因编码章鱼碱合酶(Koncz，C.等，(1983)EMBO J.31597-1603.Dhaese P.等，(1983)EMBO J.2419-426)。
RNA聚合酶II在植物中基本上与其它真核生物相同的方式转录蛋白质编码基因。在一般水平上，在真核细胞内，在转录起始区(启动子)中可以发现非常相似的调节元件。TATA框位于转录起始位点上游的25-40个核苷酸，翻译起始密码子ATG位于转录起始位点下游的40-80个核苷酸。在成熟mRNA中，可读框位于ATG密码子后，终止于三个终止密码子UGA、UAG或UAA之一。
不同来源的启动子都可用于植物的转基因表达。它们中的许多得自农杆菌(Agrobacterium ssp.)和植物病毒，如组成型表达的农杆菌nos启动子和花椰菜花叶病毒35S启动子。当需要在特定组织中表达的情况下，可以应用组织特异性启动子。组织特异性启动子通常也是发育上的可控启动子，使得它们仅在组织的某个发育阶段有活性。在本发明中，希望所述启动子是萌芽种子特异性启动子。
Rubisco(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶)在萌芽子叶中高达50％总蛋白。在CO2分子与核酮糖-1，5-二磷酸缩合形成两分子3-磷酸甘油酸的情况下，它是催化多种反应的最丰富的植物蛋白。Rubisco位于类囊体膜的基质表面。所述酶由8个大亚基(由叶绿体基因组编码)和8个小亚基组成。所述小亚基由核多基因家族(rbcS基因)编码。所述小亚基在胞质多核糖体上合成(前体蛋白)。装配为全酶之前，它被转运到质体并进行加工。RbcS基因表达是组织和发育期特异性的，并且通过光敏色素系统而受光控制。
在本发明中，最优选的基因产物或蛋白质生产系统利用Rubisco小亚基基因启动子。Rubisco小亚基基因启动子可以分离自黑暗(暗箱)中或无光照条件下生长的油菜子叶。这种启动子可以以非常高的水平生产外源蛋白。我们的工作已说明黑暗中萌发油菜子叶所有从头合成蛋白中的约50％是Rubisco小亚基蛋白和Rubisco大亚基蛋白。在萌芽种子中，天然RbcS基因转录物的mRNA水平高达500pg/μg总RNA。吸水开始后约60小时达到最大表达。蔓菁天然RbcS基因转录物的mRNA水平得出相似的结果(Fiebig，C.等，Bot.Acta 103(3)258-265，1990)。为了增加表达，可用可见光对萌芽种子照射较短或较长时间。为了阻抑天然rbcS启动子活性，可以加入单糖、二糖或寡糖、优选蔗糖或葡萄糖。如果从转基因启动子中去除蔗糖效应元件，则它将不被蔗糖阻抑。产生的Rubisco酶越少，则保留用于转基因表达的游离氨基酸越多。此外，也可用反义技术下调内源rbcS基因表达通过在萌芽种子中表达反义rbcS基因。
因为Rubisco是最丰富的植物蛋白，所以它已经用作本发明的优选启动子，但是本发明的表达系统决不限于所述启动子的应用。对蛋白质生产有利的转基因子叶包括用以生产蛋白质的启动子系统，并且最好是包括子叶中高活性的光诱导型Rubisco启动子。通过筛选在子叶中、尤其是在非光照条件下表达的Rubisco cDNA，有可能获得其它高表达Rubisco启动子。采用寡-T-引物和高度保守Rubisco编码序列5’末端的序列，通过RT-PCR可以产生cDNA。在子叶中，可以对高表达cDNA测序，可变的3’非翻译区(UTR)可以用作探针，以检测植物组织中的表达水平。通过运用数种方法，采用cDNA序列数据库，可以分离基本上只在子叶中表达的启动子。以相似的方式，可应用cDNA信息获得其它基本为种子特异性的发芽激活型启动子和/或诱导型启动子，本文将其称为暗箱启动子。
许多蛋白酶和脂酶在发芽种子的子叶中特异性表达。一种特征鉴定最完全的酶是Vigna mungo巯基-内肽酶(SH-EP)，该酶在吸水后立即在子叶中从头合成。一般而言，SH-EP mRNA量一直增加到第3天或第4天。SH-EP启动子区(基因库号EMBL X51900)与GUS基因融合，便于测定双子叶植物种子萌发期间的表达水平。
除以组织特异性方式调节的启动子外，还可以使用可以通过各种刺激激活的诱导型启动子。一类被称为热激基因或应激基因的基因存在于从细菌到人的所有生物中。胁迫处理(例如热激)后起始这些基因的转录，翻译该转录物产生的蛋白质可以暂时保护细胞。热激mRNA和蛋白的产生只是一种暂时现象，几小时后，热激基因的表达达到平稳，随后下降。如果缓慢升高温度，而不是突然升高温度，生物可以耐受温度，否则可能致死，也就是生物可以适应较高温度。可以对发芽种子进行加热，以增加热激启动子活性。已显示于40℃处理2小时后大豆热激(HS)mRNA水平从几乎检测不到的水平增加到15000-20000拷贝。美国5,447,858中介绍的HS启动子区也可以作为诱导型启动子用于本发明的表达系统中。通过PCR克隆的HS启动子与GUS基因融合，以测定种子萌发期间的表达水平。
在动员贮藏养料的情况下，数种类型的水解酶在萌芽种子中从头合成并起作用。贮藏养料转化为转运形式(如三酰甘油转化为蔗糖)包括数种基因的高度表达，如异柠檬酸裂合酶和苹果酸脱氢酶。这些基因的启动子可以用于转基因表达。采用PCR，可以克隆烟草植物(Nicotiana tabacum)的水杨酸诱导型启动子。它可用来在萌芽种子中表达异源基因。
本发明非常好的环境优势是所述外源基因在田间条件下的栽培期间不表达。所述基因与贮藏养料一起增加和收获，而在限制条件下可以进行外源基因产物的萌发限制性表达。
重要的是，本发明可以生产任何商业上感兴趣的基因产物。这些基因产物包括对所述植物而言为异源的酶类。换句话说，它们对产生它们的该植物物种而言不是天然的。也包括对产生它们的植物而言为同源的酶类。采用重组DNA技术一般过量表达所述同源蛋白。目的酶包括但不限于诸如蛋白水解酶的水解酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、磷酸酶、脂酶、磷酸脂酶、果胶酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、溶菌酶、支链淀粉酶和壳多糖酶、过氧化物酶以及诸如果胶裂合酶的裂合酶和诸如葡萄糖异构酶的异构酶。
用本发明的方法和生产系统也有可能生产结构蛋白。本发明某些有趣的实施方案是例如胶原蛋白、明胶、spidroin、丝蛋白，而且可以生产许多其它种类的蛋白质性基因产物，包括酶抑制剂(例如胰蛋白酶抑制剂)、治疗肽(如干扰素、胰岛素、神经肽、脑啡肽、促生长素抑制素)等。也可以生产其它聚氨基酸(例如聚赖氨酸和聚谷氨酸)，以及纤维、膜、外壳蛋白、治疗蛋白或药物、anti-scalants或食品/饲料添加剂和疫苗(例如LTB)和生长因子(例如GM-CSF)。也可以合成非蛋白质性基因产物，包括聚-β-羟基-丁酸酯。
由于萌发期间的从头合成是一种快速短暂的瞬时过程，因此必需在所需基因产物的量开始下降之前中断或终止萌发。这可以在所需基因产物浓度下降之前通过终止萌发(或者通过加热、codin-N2(烘干)，或者通过压碎或切割双子叶植物发芽种子(包括幼苗))，回收所述所需基因产物来达到。如果通过加热终止萌发，则所需基因产物可以回收为耐贮藏性好的粗制干燥产品，意味着也可以以粗制贮藏稳定形式回收所述酶。可以通过压碎或切割萌芽种子在其峰值终止所需蛋白的合成。如果通过切割或压碎终止萌发，则所述基因产物可以回收作为粗制混合物，它可以原样使用或可以进行下游加工(也就是配制)、贮藏、以及运输和贮藏。它最好在例如生物转化过程中原样使用。不用说所需基因产物可以通过常规熟知的方法进行分离和纯化。
如果所述基因产物用于生物转化，则将其与底物(即某种化合物或化合物的混合物接触，也就是让所述基因产物(通常为酶)与所述底物中的化合物反应。基因产物(例如酶)用作催化剂和修饰所述底物中的化合物，或者所述底物或试剂含有至少一种能够修饰所述基因产物的物质或化合物，例如可以修饰其折叠模式，可以进行糖基化或去糖基化或提供取代基以促进所述基因产物与基它产物的缀合。
在本发明中，萌发后在可以生产所需基因产物的条件下，所述底物中富含所述基因产物。种子源性组合物包括子叶、下胚轴、根以及子叶留土型植物中的上胚轴、有时是小的初生叶。所述基因产物可以提取出来或保留在所述组合物中。
当种子中贮藏的天然基因产物因萌发而动员时，所述基因产物可以是本发明表达系统提供的基因编码的蛋白质或由转基因酶产生的某些其它生化化合物，并且所述基因产物原样使用和使其作用于所加入的外源底物以达到对所述底物的所需(生物)转化。
如果从所述组合物中提取所述基因产物，则它可以以新鲜形式或干燥形式使用。干燥可在加热干燥器中于40-80℃或在冻干机中于-20至-80℃进行。干燥物质可以是粉碎物质或粉状物质。提取前，所述组合物可以进行机械粉碎和/或酶处理，使总蛋白进入浆液或溶液中。然后所述细胞碎片可以通过诸如离心、沉淀和/或过滤的任何常规方法进行分离。
上清液或滤液通常在介质总蛋白中包含1-40％(w/w)所需基因产物，最好是至少约30％(w/w)。当所需基因产物不溶于水时，它可以例如用常规溶剂萃取。或者，可以采用复性或溶解和/或提取所述产物而不丧失所需产物活性的其它方法。
从水性介质分离目的蛋白后，可以用常规方法纯化所述基因产物。由于所述基因产物包含存在于混合物总蛋白中的大部分，通常为任何单个蛋白的最大百分比，因此纯化大大简化了。此外，纯化后产物中的污染物不可能生理性涉及所述基因产物的任何应用，包括治疗应用。
如不从所述组合物提取所述基因产物，而是将其保留在所述组合物中，则它也可以以新鲜形式或干燥形式进行回收。所述干燥可以如上所述进行。干燥物质可以进一步粉碎或磨成粉状。新鲜材料可以通过机械粉碎或酶处理而捣碎。干燥物质和新鲜材料可以用作基因产物源。如果基因产物为酶，则可以将合适的底物加入到水性混合物或干燥组合物中或作为新鲜材料使用。
在本发明的一个实施方案中，包含一种或多种目的蛋白的双子叶植物发芽种子、子叶和/或幼苗可以用作饲料添加剂。双子叶植物发芽种子可以与正常非转基因种子混合，以获得所需浓度目的基因产物的动物饲料。
萌芽种子源性混合物或组合物可以进行干燥和贮藏。当例如所述重组蛋白可用于饲料应用时，所述基因产物可以分离或将其保留在所述材料中。所述基因产物可以用来提高动物饲料的蛋白价值，或它可以为例如生长激素或疫苗。此外，以严格控制方式也可以产生不稳定或有毒物质，这使得有效蛋白生产与生态方面和农业价值综合起来。
下文更详细地介绍本发明。公开实施例和实验细节以达到本领域技术人员加深了解并提供指导。
采用NcoI酶使所述启动子与GUS基因连接。将启动子-GUS构建体克隆到植物转化载体pGPTV-hpt(Becker等1992，Plant Mol.Biol.201195-97)中。按照Kuvshinov，V.等介绍的方法(Plant Cell Reports18773-777，1999)转化油菜。让转基因植株在温室中生长，直到它们产生种子。将所述转基因种子进行萌发并用于组织化学GUS测定。
结果示于附图中。
图1A的左边显示表达GUS基因的转基因油菜的发芽种子。所述GUS基因与大豆热激启动子连接。右边显示未转化的对照幼苗。
图1B显示表达GUS基因的转基因油菜的发芽种子。所述GUS基因与所述内肽酶启动子连接。
图1C显示表达GUS基因的转基因油菜的发芽种子。所述GUS基因与水杨酸诱导型启动子连接。
图1D显示表达GUS基因的转基因油菜的发芽种子。所述GUS基因与所述35S启动子连接。
图2显示含有底物β-葡糖苷酸(100μg/ml)的无色缓冲溶液，在发芽转基因种子产生的GUS酶的作用下，无色β-葡糖苷酸酶促转化为蓝色吡喃葡糖苷酸和糖苷配基。
图3显示不同萌发阶段的油菜种子，表示为开始萌发后的天数。使表面消毒的种子在体外条件下萌发，体外条件为于温度为22℃时光照16小时和温度为18℃时无光照(黑暗)条件下保持8小时。
图4显示发芽种子的SDS-PAGE凝胶。从干燥种子开始，每天收集样品。将材料在液氮中匀浆，重悬于含850mM NaCl的50mM Tris，pH8.0溶液中。离心后，将澄清的上清液与加样缓冲液混合。贮藏蛋白和Rubisco亚基在考马斯染色的凝胶上标出。萌发三天后，每天产生的Rubisco蛋白量相当大。
图5显示采用RNA探针的发芽种子RNA印迹。从干燥种子开始，每天收集样品。所述反义序列探针含有外显子3的197bp和rubisco小亚基cDNA 3’-UTR区的153bp(未公布)。在所述反应中采用DIG-UTP用T7-启动子由pBluescript质粒产生所述探针。每条泳道加样3μg总RNA。采用Qiagen RNeasy Plant Mini Kit提取RNA。基本上按照生产商的方案，用DIG Easy Hyb缓冲液进行杂交。
油菜幼苗的SDS-page分析。使油菜种子连续在1-7天内萌发。将5对子叶在液氮中研磨，重悬于裂解-加样缓冲液(50mM Tris HClpH8.5、2％SDS、0.1％溴酚蓝、10％甘油、2％巯基乙醇(2-ME))中。按照Laemmli的方法(1970)，将样品在水浴中煮沸10分钟，在15％SDS-PAGE凝胶中分析。估计吸涨后4天起始Rbc基因表达。b.油菜子叶的RNA-纯化采用Qiagen RNeasy Kit，纯化4日龄子叶的RNA。c.由油菜子叶的总RNA进行cDNA-合成将2μg总RNA和10ng notI-d(T)18引物的16μl水溶液在温度为70℃时孵育5分钟。将混合物转移到冰上，加入5μl5x反应缓冲液、2.5μl5mM dNTP、20U核糖核酸酶抑制剂和200U M-MLV反转录酶。反应混合物在温度为42℃时孵育1小时。d.PCR-扩增子叶细胞中表达的cDNA克隆通过应用由胸腺嘧啶核苷酸和不同的二核苷酸锚着点组成的12种引物系列为3’引物，而将蔓菁rbc基因(基因库登记号g17849)外显子no III起始区的49-mer寡核苷酸变为5’引物，使PCR起始最优化。起始最优化表明只有GCT11为3’引物才产生PCR-产物。为了克隆该PCR-产物，用NotI-限制位点构建49-mer寡核苷酸。所述引物列入表1中。表1.用于PCR-分离rubisco cDNA-克隆的引物用于起始筛选的3’引物15′TTTTTTTTTTTCA3′(SEQ.ID1)25′TTTTTTTTTTTCT3′(SEQ.ID2)35′TTTTTTTTTTTCC3′(SEQ.ID3)45′TTTTTTTTTTTCG3′(SEQ.ID4)55′TTTTTTTTTTTGA3′(SEQ.ID5)65′TTTTTTTTTTTGT3′(SEQ.ID6)75′TTTTTTTTTTTGC3′(SEQ.ID7)85′TTTTTTTTTTTGG3′(SEQ.ID8)95′TTTTTTTTTTTAA3′(SEQ.ID9)105′TTTTTTTTTTTAT3′(SEQ.ID10)115′TTTTTTTTTTTAC3′(SEQ.ID11)125′TTTTTTTTTTTAG3′(SEQ.ID12)5’引物(SEQ.ID13)5’CGCGGATCCCACGGGTTTGTTTACCGTGAGCACGGAAGCACCCCCGGAT3’用于克隆rbc cDNA-克隆的3’引物(SEQ.ID14)5’AAGGAAAAAAGCGGCCGCAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGC 3’为了克隆rbc cDNA-片段，在将1μl cDNA-合成反应混合物用作模板、100nM 5’引物、100nM 3’引物、100μM dNTP和1.25U Pfu DNA聚合酶/25μl反应体积中进行PCR-扩增。将所获得的PCR-片段克隆到pUK21-载体的NotI位点和BamHI位点。对7个单个克隆测序。依照序列将克隆分为两组，分别包括3个相似代表和4个相似代表。从两组中选出一个代表进行进一步研究。该序列命名为utr2(SEQ.ID15)和utr8(SEQ.ID16)utr2-序列(SEQ.ID15)TTCGCGTTGT AAGACATTTC ATAAATAATA TCTACCTCATTTCATTTCCA TTTGTCTGTTT TCTTTGGCTTT TTGTTTCTGAGGCATGTTAT ATCGGATTGT CAAGTGTCTG ATTTATGAACAACATGTAAT CTCTATATGC ATATTTCTutr8-序列(SEQ.ID16)TTCGCTTTCA TATAATAATA TCTTCCTCAT TTCATTTCCAATAAGTCTGT TTCTTTTTTC TCTTTGGATT TCTGTTACGAGACTTTCTAT ATCGGATTGT AAAATGTCTG ATTTTATGAACATGTAATTT CGG CAAATAe.油菜rubisco小亚基启动子I型(65A)的克隆采用与蔓菁rubisco小亚基基因互补的bnrb1(SEQ.ID17)(5’-GAATTCTAACGACCCTTTTCCG-3’)为5’引物，将对UTR 65A(SEQ.ID24)有特异性的UTR2(SEQ.ID18)(5’-GGCCACACTTGACAATCCGATATAACATGCCTCA-3’)为3’引物，扩增带有所述启动子和对应于UTR 65A(SEQ.ID24)的基因的2.8kb片段。按照生产商的建议，用pfx Platinum DNA聚合酶(Life Technologies)进行所述扩增。采用所得片段为模板扩增所述启动子区。在独立反应中，将与蔓菁rubisco小亚基基因互补的Bnrb3(SEQ.ID19)(5’-AAAAAGCTTCTAGACCCTTTTCCGTCATAAGTTTTATA-3’)用作5’引物，将RbSiB(SEQ.ID20)和RBNCO(SEQ.ID21)用作3’引物。RbSiB(5’-CAGGTCTCCCATGCAGCTAACTCTTCCTCCGTTGCT-3’)的3’端与蔓菁rubisco小亚基基因推定的叶绿体引导信号肽的末端互补，RbSiB的5’端带有用于克隆到植物表达载体中的Eco311位点，该位点含有切割后留下含ATG的NcoI位点匹配末端。RBNCO(SEQ.ID21)(5’-GAGGAAGCCATGGCTACTTCTT-3’)与蔓菁rubisco小亚基基因编码区的起点相匹配，只是有2个核苷酸改变，它产生ATG密码子附近的NcoI位点。f.评估油菜叶片和幼苗中编码核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基的mRNA库采用RNeasy试剂盒(Qiagen)，由成熟叶片和4日龄幼苗分离总RNA。采用Oligo(dT)纤维素柱，按照生产商的建议(New EnglandBiolabs)，进一步纯化信使RNA。用寡T引物(SEQ.ID22)(CUACUACUACUAGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN)和莫洛尼鼠类白血病病毒逆转录酶(Moloney Murine LeukaemiaVirus Reverse Transcriptase)(Promega)合成总cDNA库。采用两个PCR循环(94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟)扩增rubisco小亚基cDNA。PCR引物寡T引物和识别rubisco小亚基的末位外显子末端的引物(SEQ.ID23)(CAUCAUCAUCAUTCGACGATCATCGGATTCGACA)。所述PCR产物用尿嘧啶DNA糖基化酶消化，克隆到pAMP1载体(CloneAMPpAMP System LIFE TECHNOLOGIES)中。对总共102个克隆进行DNA测序分析。42个克隆得自萌芽幼苗，60个克隆得自成熟叶片。发现了mRNA的3种不同类型(I型、II型和III型)。不同类型序列的序列及其在萌芽幼苗和成熟叶片中的分布百分比示于表2中。表2.不同类型mRNA的序列和分布百分比
3种不同类型mRNA的序列如下I型(SEQ.D24)TTAATTCGCGTTGTAAGACATTTCATAAATAATATCTACTCATTTCATTTCCATTTGTCTGTTTTCTTTGGCTTTTTGTTTCTGAGGCATGTTATATCGGATTGTCAAGTGTCTGATTTATGAACATGTAATCTCTATATTGCATATTTTCTTCTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAII型(SEQ.ID25)TTAATTTGCTATGACATTCACATAATAATCTCTGCTCATTTCATTTCCAATTGTCTGTTTCTTTTCCCTTGGTTTTCTGTTTCTCAGACATTCTATATCGGATTGTCAAATGTGTGATTGTGAACATGTAATCTCTATATTGCTTCTTCGTCTTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAIII型(SEQ.ID26)TTAATTCGCTTTCATATAATAATATCTTCTCATTTCATTTCCAATAAGTCTGTTTCTTTTTTTCTCTTTGGATTTCTGTTACGAGACTTTCTATATCGGATTGTAAAATGTCTGATTTTATGAACATGTAATTTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAg.最丰富的油菜rubisco小亚基基因的克隆按照定量测序分析102个克隆rubisco小亚基UTR-克隆，一种油莱rubisco小亚基基因占转录物的56％。该克隆命名为UTR56(III型，SEQ.ID26)。为了克隆相应的基因及其上游区，设计的4个引物用于两步PCR。在第一步PCR中，将属于蔓菁rubisco小亚基基因(登记号x61097)的一部分的引物bnrb4(SEQ.ID27)(5’-GGCCATGAATTCTAACGACCCTTTTCC GTCATAAAAGT-3’)用作5’引物。对UTR56(SEQ.ID26)有特异性的引物56r6(SEQ.D28)(5’-CGCGATATAGAAATTACATGTTCATAAAATCAGACATTTTAC-3’)用作3’引物。第一步PCR的组成为75mM Tris，pH8.0(25℃)，20mM(NH4)SO4，0.01％Tween 20，2mM MgCl2，200μM dNTP，0.2μM引物，0.025单位/μl Taq DNA聚合酶，0.0016单位/μl Pfu DNA聚合酶和100pg/μl油菜DNA。程序为94℃，4分钟，30X[(94℃，30秒)，(38℃，30秒)，(72℃，3分钟)]。由琼脂糖凝胶纯化预期的2.8kb片段。因为没有某些序列信息，所以采用bnrb5(SEQ.ID29)(5’-GAGGTACCCGCGGCCGC GAATTCTAACGACCCTTTTCCGTCATAAAAG-3’)(它的3’端与bnrb4(SEQ.ID27)互补，而5’端延伸带有NotI 8-碱基切割位点)和56r7(SEQ.ID30)(5’-GAGAATTCGGCGCGCCATAGAAATTACATGTTCATAAAATCAGACA-3’)(它的3’端与56r6(SEQ.ID28)互补，而5’端延伸带有AscI8-碱基切割位点)，重扩增所述片段。PCR组成类似于第一步PCR，但进行了以下改进将得自第一步PCR的25pg/μl凝胶纯化片段用作模板，并且只进行7个循环。
将所得产物沉淀，用AscI和NotI限制性酶切割，然后凝胶纯化。将所述片段克隆到修饰pNEB193的pAN(PmeI位点变成NotI位点)中，所述修饰pNEB193的pAN为用AscI和NotI打开，用Shrimp碱性磷酸酶处理，加热失活所述酶后凝胶纯化。对所得克隆中的4个克隆测序，以确证它们携带UTR56序列。
采用bnrb5(SEQ.ID29)为5’引物，3’引物为RbSiB(SEQ.ID20)和RBNCO(SEQ.ID21)(参见上文)，扩增所述启动区。PCR条件类似于用于扩增全基因的条件，但进行以下改进将带有所述克隆的5ng/μl质粒DNA(用AscI线性化)用作模板，只进行10个循环。
序列表<110>尤尼克罗普有限公司(UniCrop Ltd)<120>用于将双子叶植物种子的贮藏养料转化成包含一种或多种基因产物的组合物的方法<130>9H08PCT<140><141><150>19992659<151>1999-12-10<160>30<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述-<220><223>3’引物<400>1tttttttttt tca13<210>2<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述-<220><223>3’引物<400>2tttttttttt tct13<210>3<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述-<220><223>3’引物<400>3tttttttttt tcc13<210>4<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述-<220><223>3’引物<400>4tttttttttt tcg13<210>5<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述-<220><223>3’引物<400>5tttttttttt tga13<210>6<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述-<220><223>3’引物<400>6tttttttttt tgt13<210>7<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述-<220><223>3’引物<400>7tttttttttt tgc13<210>8<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述-<220><223>3’引物<400>8tttttttttt tgg13<210>9<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述-<220><223>3’引物<400>9tttttttttt taa13<210>10<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述-<220><223>3’引物<400>10tttttttttt tat13<210>11<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述-<220><223>3’引物<400>11tttttttttt tac13<210>12<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述-<220><223>3’引物<400>12tttttttttt tag13<210>13<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>5’引物<220><223>人工序列描述-<400>13cgcggatccc acgggtttgt ttaccgtgag cacggaagca cccccggat 49<210>14<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述-<220><223>用于克隆rbc cDNA-克隆的3’引物<400>14aaggaaaaaa gcggccgcaa tttttttttt tttttttttt tttttttgc 49<210>15<211>150<212>DNA<213>油莱(Brassica campestris)<220><223>utr2-序列<400>15ttcgcgttgt aagacatttc ataaataata tctacctcat ttcatttcca tttgtctgtt 60ttctttggct ttttgtttct gaggcatgtt atatcggatt gtcaagtgtc tgatttatga 120acaacatgta atctctatat gcatatttct 150<210>16<211>139<212>DNA<213>油菜<220><223>utr8-序列<400>16ttcgctttca tataataata tcttcctcat ttcatttcca ataagtctgt ttcttttttc 60tctttggatt tctgttacga gactttctat atcggattgt aaaatgtctg attttatgaa 120catgtaattt cggcaaata 139<210>17<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>bnrb1<220><223>人工序列描述-<400>17gaattctaac gacccttttc cg22<210>18<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>UTR2<220><223>人工序列描述-<400>18ggccacactt gacaatccga tataacatgc ctca 34<210>19<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>bnrb3<220><223>人工序列描述-<400>19aaaaagcttc tagacccttt tccgtcataa gttttata 38<210>20<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>RhSiB<220><223>人工序列描述-<400>20caggtctccc atgcagctaa ctcttcctcc gttgct 36<210>21<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>RBNCO<220><223>人工序列描述-<400>21gaggaagcca tggctacttc tt 22<210>22<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述-<220><223>Oligo T引物<400>22cacacacagc ggccgctttt tttttttttt tttttttttt tvn 43<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述-<220><223>rubisco小亚基末位外显子的末端<400>23cacacacatc gacgatcatc ggattcgaca 30<210>24<211>180<212>DNA<213>油菜<220><223>I型<400>24ttaattcgcg ttgtaagaca tttcataaat aatatctact catttcattt ccatttgtct 60gttttctttg gctttttgtt tctgaggcat gttatatcgg attgtcaagt gtctgattta 120tgaacatgta atctctatat tgcatatttt cttcttggaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180<210>25<211>180<212>DNA<213>油菜<220><223>II型<400>25ttaatttgct atgacattca cataataatc tctgctcatt tcatttccaa ttgtctgttt 60cttttccctt tggttttctg tttctcagac attctatatc ggattgtcaa atgtgtgatt 120gtgaacatgt aatctctata ttgcttcttc gtcttggtaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180<210>26<211>176<212>DNA<213>油菜<220><223>III型<400>26ttaattcgct ttcatataat aatatcttct catttcattt ccaataagtc tgtttctttt 60tttctctttg gatttctgtt acgagacttt ctatatcgga ttgtaaaatg tctgatttta 120tgaacatgta atttctaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 176<210>27<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>bnrb4<220><223>人工序列描述-<400>27ggccatgaat tctaacgacc cttttccgtc ataaaagt 38<210>28<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述-<220><223>56r6<400>28cgcgatatag aaattacatg ttcataaaat cagacatttt ac 42<210>29<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>bnrb5<220><223>人工序列描述-<400>29gaggtacccg cggccgcgaa ttctaacgac ccttttccgt cataaaag 48<210>30<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>56r7<220><223>人工序列描述-<400>30gagaattcgg cgcgccatag aaattacatg ttcataaaat cagaca 4权利要求
1.一种基于源-库原理的方法，该方法用于将双子叶植物种子中的蛋白质、糖类和脂质养料转化成包含一种或多种所需基因产物的组合物，所述方法包括以下步骤(a)栽培转基因双子叶植物，该植物具有萌发启动时诱导的表达系统，以便提供可以作为转基因双子叶植物种子收获的内部贮藏原料源；(b)所述诱导型表达系统包含诱导型调节序列，所述诱导型调节序列选自在萌发启动时从头合成并积蓄在所述植物子叶和胚乳中的蛋白的编码基因的调节序列，(c)将包含整合到所述植物基因组的一种或多种表达系统的压碎或未压碎转基因双子叶植物种子与周围介质接触并启动萌发，所述萌发动员内部原料源；(d)利用整合在所述植物基因组中的转基因表达系统由步骤(c)中动员的内部原料源从头合成一种或多种所需基因产物；(e)任选在从头合成下降之前终止所述萌发；(f)用或不用下游加工法回收包含一种或多种所述基因产物和/或通过步骤(d)生化反应获得的产物的组合物。
2.权利要求1的方法，其中将包含至少一种基因产物的组合物与包含至少一种可以由一种或多种所述基因产物催化的生化反应转化的化合物的底物接触。
3.权利要求1的方法，其中将包含至少一种基因产物的组合物与包含至少一种能够修饰一种或多种所述基因产物的化合物的试剂接触。
4.权利要求1-3的方法，其中任选消毒包含所述原料源的转基因双子叶植物种子，在基本无菌的条件下进行萌发，获得基本无菌的源-库生产系统。
5.权利要求1的方法，其中所述表达系统包含诱导和/或可在萌发时诱导的启动子。
6.权利要求3的方法，其中所述启动子基本上沉默或可以在田间条件下栽培所述转基因植物时保持沉默。
7.权利要求1的方法，其中所述周围介质为任选的缓冲水溶液。
8.权利要求1的方法，其中所述源-库生产系统补充至少一种用于诱导萌发的物理方法或化学方法。
9.权利要求1的方法，其中所述源-库生产系统补充至少一种外部养分。
10.权利要求1的方法，其中所述源-库生产系统补充至少一种上调从头合成所需基因产物的方法。
11.权利要求1的方法，其中所述源-库生产系统补充至少一种下调从头合成在萌发期间正常产生的基因产物的方法。
12.权利要求1的方法，其中所述萌发任选用至少一种包括加热、干燥、压碎、分离、提取、挤压和过滤的方法终止，随后用或不用下游加工法回收所述基因产物中的至少一种产物。
13.一种种子源性组合物，所述组合物包含在包括幼苗在内的子叶中表达的一种或多种基因产物和/或包含由包括幼苗在内的子叶分泌到周围介质中的一种或多种基因产物。
14.权利要求13的种子源性组合物，所述组合物包括含至少一种可以由所述组合物转化或可以修饰所述组合物中的一种基因产物的化合物的底物或试剂。
15.权利要求13-14中任一项的种子源性组合物，所述组合物为干燥形式或下游加工形式。
16.权利要求15的种子源性组合物，所述组合物包含一种或多种合适的配制成分。
17.一种可用于权利要求1的方法的表达系统，所述表达系统包含一种或多种调节序列，所述调节序列得自编码萌发启动时从头合成并积蓄在所述植物子叶和胚乳中的蛋白的基因。
18.一种选择用于构建权利要求17的表达系统的调节序列的方法，所述方法包括以下步骤(a)从双子叶植物的子叶和叶片中分离总RNA；(b)用一种植物特异性引物和一种对在萌发启动期间从头合成并积蓄在所述植物的子叶和胚乳中的蛋白质具有特异性的引物扩增所述RNA，从而制备cDNA；(c)收集并平板接种包含所述cDNA的克隆；(d)比较叶片源性RNA获得的克隆结果；和(e)回收显示在双子叶植物萌芽种子中活性增加的包含所述cDNA的克隆。
全文摘要
本发明涉及一种基于源－库原理的方法，所述方法由包含诱导或可在萌发期间诱导的表达系统的压碎或未压碎双子叶植物萌芽种子生产目的产品。所述产品为包含一种或多种基因产物的种子源性组合物。或者，所述产品为通过将所述组合物与包含一种能够由原样形式、干燥形式或下游加工形式的种子源性组合物转化的物质的底物接触获得的目的产品。
文档编号C12N15/09GK1407850SQ00816869
公开日2003年4月2日 申请日期2000年12月8日 优先权日1999年12月10日
发明者K·科伊伍, V·库夫施诺夫, A·卡纳瓦, E·佩胡 申请人:尤尼克罗普有限公司