专利名称：催泪因子生成酶的同功酶及编码该酶的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及到与当粉碎或切洋葱等时发生的催泪因子生成有关的催泪因子生成酶的同功酶，更详细地讲涉及到具有由存在于洋葱等的含硫化合物PeCSO(S-1-丙烯基-半胱氨酸硫化物)经蒜酶作用生成的分解物生成催泪因子(硫丙醇-S-氧化物)活性的催泪因子生成酶的3种同功酶、其氨基酸序列以及编码该同功酶的DNA等。
本发明的催泪因子生成酶的同功酶、其氨基酸序列以及编码该同功酶的DNA在实现以下几个方面工作都很有用例如控制催泪因子的生成，使粉碎或切洋葱等时发生的催泪因子的量减少的洋葱品种开发中用作材料或杂交物等的筛选标志，提供抑制该酶的表达量的信息，大量生产该酶，大量生产催泪因子等。
然而通过本发明人等的研究发现S-1-丙烯基-半胱氨酸硫化物只是被蒜酶分解，而不会生成催泪因子，要生成催泪因子必须要有其它酶(催泪因子生成酶)参与。
因此本发明人通过反复深入的研究，在对催泪因子生成酶的制造方法进行开发的同时，也阐明了催泪因子生成酶的理化性质，已经申请了专利(特开平10-25373号公报)。
即，有关存在于洋葱等的催泪因子(Lachrymatory Factor；LF)的形成及其分解虽然到目前为止已经报道了许多研究成果，但就上述催泪因子的生成机制以往都认为是蒜酶作用于上述前体物质PeCSO，经过次磺酸没有经过酶催化就形成了稳定的催泪因子。然而根据本发明人研究的结果发现实际上上述因子只通过蒜酶是不能生成的，还必须要有其它酶参与才能生成。
因此本发明人通过进一步深入研究发现了存在对上述次磺酸异构化后生成催泪因子的新酶(催泪因子生成酶)，由此了解到上述前体物质是如何通过该酶作用生成催泪因子(或香味成分)或与此成分不同的其它风味成分。
如果利用该催泪因子生成酶的氨基酸序列或编码该酶的DNA信息，例如在洋葱品种的开发中可以有效地进行基因重组或变异诱导和杂交等，对即便粉碎和切碎也很难生成催泪因子的洋葱的培育等发挥作用。
另外如果利用编码催泪因子生成酶的氨基酸序列的DNA信息，通过基因重组技术等大量生产该酶也是有可能的，例如在有效制造对泪缺乏症(干眼症)等的治疗中有用的催泪因子的技术的开发中也有用。
但是有关催泪因子生成酶的氨基酸序列及其编码该酶的基因到目前为止一例报道都没有，由于没有情报，关于催泪因子生成酶的基因水平研究是困难的。
本发明涉及到参与存在于洋葱等的催泪因子生成的催泪因子生成酶的3种同功酶、序列1～3所示的该蛋白质或多肽的氨基酸序列、序列4～5所示的含有编码上述蛋白质或多肽的碱基序列的DNA、上述同功酶的制造方法、含有上述DNA的重组载体、用该重组载体转化的转化体、通过培养该宿主细胞制造具有催泪因子生成酶活性的蛋白质或多肽的方法、以及与上述DNA相对应的mRNA互补的碱基序列的反义RNA。
即本发明的目的在于提供催泪因子生成酶的3种同功酶及其氨基酸序列。
另外提供编码催泪因子生成酶的同功酶蛋白质或多肽的基因序列也是本发明的目的。本发明的目的还在于提供通过对上述催泪因子生成酶同功酶的作用进行调控，实现抑制催泪因子生成酶活性的表达，或是抑制该酶活性的洋葱的生产方法等。
另外提供含有上述基因序列的重组载体、以及使通过基因重组技术有效制造催泪因子生成酶的同功酶得以实现的方法也是本发明的目的。
用于解决上述课题的本发明是由以下的技术手段构成的。
(1)对具有作用于存在于洋葱等的催泪因子前体生成催泪因子活性的催泪因子生成酶利用它们等电点的差别进行纯化，得到催泪因子生成酶的同功酶。
(2)含有序列1所示氨基酸序列或含有在该氨基酸序列中进行了附加、缺失或置换1个或多个氨基酸的氨基酸序列的，具有催泪因子生成酶活性的蛋白质或多肽。
(3)含有序列2所示氨基酸序列或含有在该氨基酸序列中进行了附加、缺失或置换1个或多个氨基酸的氨基酸序列的，具有催泪因子生成酶活性的蛋白质或多肽。
(4)含有序列3所示氨基酸序列或含有在该氨基酸序列中进行了附加、缺失或置换1个或多个氨基酸的氨基酸序列的，具有催泪因子生成酶活性的蛋白质或多肽。
(5)含有编码上述(2)、(3)或(4)记载的蛋白质或多肽的碱基序列的DNA。
(6)上述(5)记载的DNA，其中编码蛋白质或多肽的碱基序列是序列4所示的DNA。
(7)上述(5)记载的DNA，其中编码蛋白质或多肽的碱基序列是序列5所示的DNA。
(8)催泪因子生成酶同功酶的制造方法，其特征是对作用于存在于洋葱等的催泪因子前体生成催泪因子的催泪因子生成酶利用它们等电点的差别进行纯化，对同功酶E2-1、E2-2或E2-3进行分离。
(9)具有催泪因子生成酶活性的蛋白质或多肽的制造方法，其特征是对用含有上述(5)、(6)或(7)记载的DNA的重组载体转化的宿主细胞进行培养，对在培养基或细胞中产生的具有催泪因子生成酶活性的蛋白质或多肽进行分离。
(10)反义RNA，其特征是含有与上述(5)、(6)或(7)记载的DNA相对应的mRNA互补的碱基序列。
以下对本发明进行更详细地说明。
在本发明中为了完成上述课题，首先对用以往方法纯化的催泪因子生成酶(E2)中含有的同功酶利用其等电点的差别，通过等电聚焦电泳以及层析聚焦进行纯化，对3种同功酶进行分离。然后就3种同功酶，阐明其N末端氨基酸序列，以由此推测的基因碱基序列作为基础设计引物，以由洋葱的mRNA制作的cDNA作为模板通过PCR法有选择地合成催泪因子生成酶的基因。本发明人对这样获得的基因进行了结构解析，解析结果表明检测出一个开放读框，由于由基因推测的成熟蛋白质的分子量与分离的同功酶的分子量的实测值(MALDI-TOFMS)一致，由此可以确认上述基因是催泪因子生成酶的基因。
具有由S-1-丙烯基-半胱氨酸硫化物(PeCSO)经蒜酶作用生成的分解物中使催泪因子(硫代丙醇S-氧化物)生成的酶活性的催泪因子生成酶是改善洋葱风味和提高加工适应性方面的一个重要因素。因此在催泪因子生成酶的生产或植物育种领域中该催泪因子生成酶的氨基酸序列的确定以及编码该酶的基因序列的确定有非常重要的意义。
本发明人将阐明上述催泪因子生成酶(E2)的氨基酸序列以及编码该酶的基因序列作为主要目标开始进行研究。就是说，如果能够阐明催泪因子生成酶的遗传信息，例如就有望应用于在洋葱的加工时不产生催泪因子的洋葱品种的开发等。所以将对E2的结构基因序列进行确定，对其基因及其氨基酸序列进行阐明作为目标着手进行研究。
然而随着研究的进展，发现用通常纯化方法得到的E2纯化酶样品确定其N末端氨基酸序列是困难的。就是说，本发明人进行研究时，首先判明在用本发明人开发的以往方法得到的E2中含有多个同功酶，所以在阐明E2的氨基酸序列及其编码该序列的碱基序列之前，需要分离同功酶。本发明人根据这些见解进一步进行了多方面的研究，对E2的3种主要同功酶(E2-1、E2-2或E2-3)进行了分离，对其N末端的氨基酸序列进行了确定。以此序列为基础设计了引物，利用PCR等手法成功地确定了编码各个E2同功酶的基因序列和氨基酸序列。
关于这一方面如果详细一点说的话，就是用以往方法纯化的催泪因子生成酶的样品经SDS-PAGE电泳可以检测出一条带，推定是单一蛋白质，并尝试对N末端的氨基酸进行分析。然而在该部分纯化样品中，由于混有多个同功酶，不能特别确定N末端的氨基酸序列。
因此对离子交换树脂的种类和洗脱条件、凝胶过滤柱的大小和凝胶的种类等进行各种研究，尝试对同功酶进行分离，但无论使用哪一种方法都不能分离。如果通过使用非变性凝胶的凝胶电泳进行检测，检测出的同功酶是多条带。尝试从凝胶中切出进行纯化的方法。然而由于使用该方法各个同功酶的分离不充分，以及切出的同功酶的位置每次电泳都有所变动，不能正确切出，所以不能获得纯度高的同功酶。这样反复尝试的结果发现利用等电点差别的纯化方法，如果利用等电聚焦凝胶电泳以及层析聚焦，可以有效地分离多个同功酶。
而等电聚焦电泳可以采用例如用含有pH4.0～6.5的两性电解质的聚丙烯凝胶进行电泳，切出电泳后的凝胶，通过水或缓冲液进行洗脱分离同功酶的方法。而利用层析聚焦，如可以用无水哌嗪-HCl缓冲液对MonoP柱(Pharmacia生产)进行平衡后，通过使用Poly Buffer74(Pharmacia生产)的缓冲液进行洗脱后分离同功酶。
由于部分纯化的样品中含有的主要同功酶有3种(E2-1、E2-2和E2-3)，这3种同功酶可以通过等电聚焦凝胶电泳或层析聚焦进行纯化。然而即使采用这样的纯化方法，要想得到纯度高的同功酶需要反复多次进行纯化操作。通过这样的纯化过程本发明人在主要的3种同功酶的分离上获得了成功。
上述催泪因子生成酶样品最好是通过以洋葱等作为原料进行提取、纯化、制造，作为原料，与洋葱同样的只要是含有上述酶的材料可以使用洋葱以外的其它原料。这样的情况下，作为上述酶的提取、纯化工程以下例举的方法是比较合适的方法。
即，例如以洋葱作为原料，通过加水，用混合器等进行破碎。得到的破碎物经离心，获得的上清液进行盐析使蛋白质沉淀。然后将上述沉淀物溶解在磷酸缓冲液等缓冲液中，离心，其上清液作为粗酶液。
其中作为缓冲液可以使用各种缓冲液，例如磷酸钾缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、酒石酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、马来酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸-磷酸缓冲液等。
然后对通过上述方法得到的粗酶液通过将诸如羟基磷灰石柱、硫铵盐析、透析、阴离子交换、凝胶过滤等手段组合进行纯化，可以作为部分纯化的生成酶液。
从粗酶液开始的上述酶的部分纯化不限于上述方法，可以使用众所周知的分离、纯化方法，例如由粗酶液通过硫铵盐析法、有机溶剂沉淀法等可以获得粗酶蛋白，该粗酶蛋白可以进一步再通过使用离子交换、凝胶过滤、亲和层析等各种层析适当组合进行纯化。
作为获得催泪因子生成酶的同功酶的cDNA的具体方法例如可以采用通过以E2-1～E2-3的各个N末端氨基酸序列为基础制作cDNA探针，通过杂交从以洋葱的浆液提取的E2的mRNA作为模板制作的cDNA文库中钓出E2的cDNA的方法，或在mRNA的聚A链附加锚，使用与该锚互补的引物和以E2-1～E2-3的各个N末端氨基酸序列为基础制作的引物，以由mRNA合成的cDNA为模板，通过PCR法确定E2的3’末端侧序列之后，用5’RACE法将5’末端侧序列确定的方法等。上述3种同功酶最好是通过诸如以下的方法确定其基因序列，但并不限于以下的方法。
1)通过酚/SDS/LiCl法从洋葱的鳞片提取总RNA。
2)用寡dT柱处理总RNA，对mRNA进行纯化。
3)用逆转录酶处理RNA，合成cDNA。
4)使用以E2-1的N末端氨基酸5个残基为基础制作的简并引物和与附在聚A末端的锚部分对应的引物进行PCR，获得来自E2-1下游侧的扩增产物。
5)得到的扩增产物经纯化后，进行亚克隆，弄清其碱基序列。
6)通过PCR得到的扩增产物是否来自于E2-1可以通过由E2-1的MALDI-TOFMS测得的分子量测定结果与从氨基酸序列预测的分子量很好的一致性来确认。
7)使用由E2-1的内部序列设计的引物和由附加在连接在5’末端的寡dC链的锚设计的引物进行PCR(5’RACE)，得到来自上游侧的扩增产物。
8)得到的扩增产物经纯化后，进行亚克隆，确定其碱基序列。
对序列的分析结果进行解析，确认有E2-1的开放读框(ORF)存在，结果表明E2-1是以由169个氨基酸构成的蛋白质合成后，通过加工除去N末端的16个氨基酸之后变成了成熟的蛋白质。
即，获得催泪因子生成酶的同功酶的cDNA，并进行解析，结果表明E2-1、E2-2和E2-3是以同一个基因为基础翻译成蛋白质的，只是通过翻译后的加工方式不同生成了E2-1、E2-2和E2-3。另外也知道从E2-2的N末端开始的第2个，以及从E2-3的N末端开始的第4个氨基酸Asn在翻译后变成Asp。由此确定了E2-1、E2-2和E2-3的基因序列和氨基酸的一级序列。
实验结果表明E2-2和E2-3是以同一个基因为基础合成的，由于加工不同生成的同功酶。
对E2-3的N末端氨基酸序列一直解析到10个残基，结果表明E2-2的N末端氨基酸序列的5个残基与E2-3的N末端的第3个残基到第7个残基完全一致。
(E2-2的N末端氨基酸序列)
Ala Asp Gly Ala Arg(E2-3的N末端氨基酸序列)Asp Ser Ala Asp Gly Ala Arg Lys Trp Ser由该结果可知E2-3是在E2-2的N末端侧附加了Ser和Asp的蛋白质。
由以上结果可以认为E2-2和E2-3是以同一基因为基础合成的。
为了解析E2-3的基因序列，使用以E2-3的N末端氨基酸9个残基为基础制作的简并引物和根据附在聚A末端的锚设计的引物进行PCR，获得扩增产物。
得到的扩增产物经纯化后，进行亚克隆，确定其碱基序列。
对序列的分析结果进行解析，结果表明E2-3下游侧序列与在E2-1中确认的序列一致。
其中由于E2-3下游侧序列与在E2-1中确认的序列一致，5’RACE用引物与为确认E2-1上游序列使用的引物相同。
由于在5’RACE中使用共同的锚引物，考虑如果E2-3的上游序列与E2-1的上游序列不同，在用E2-1进行的5’RACE的扩增产物中就含有E2-3的上游序列和E2-1的上游序列两种序列。
因而从不同转化体提取DNA，对E2-1的5’RACE产物再进行2次测序。
解析结果表明追加进行的2次测序的2个5’RACE产物的序列与先前解析的E2-1的上游序列一致。
由以上结果可以认为E2-3的上游序列也与E2-1的上游序列相同的可能性很高。
所以又深入进行了各种研究，结果得出了E2-3是以与E2-1同一基因为基础被翻译的，以及在变成成熟蛋白质的过程中由Asn变成了Asp的结论。
上述结论的正确性也可以由通过MALDI-TOFMS测得的E2-2和E2-3的分子量测定结果与从氨基酸序列预测的分子量很好一致来确认E2-2(155氨基酸)的分子量为17689，实测值为17722。
E2-3(157氨基酸)的分子量为17892，实测值为17909。
以下就PeCSO、蒜酶、E2的混合系统中的最适pH和最适温度进行说明。
E2的最适pH均在4.5～5.0范围内，3种同功酶之间没有大的差别。
E2-1～3的最适温度在15℃到25℃的室温范围内也没有大的差别。
上述3种同功酶中的任一种无论分子量、最适pH以及在生成催泪因子的作用中都表现出明显的一致。在本发明中无论哪一种同功酶都包括在本发明的催泪因子生成酶同功酶中。
另外以E2-1为样品进行N末端氨基酸序列分析时，可检测出少量的其它2种同功酶(命名为E2-1-1、E2-1-2)，对这些酶的N末端氨基酸序列也进行了确定。
即，在粗纯化的E2样品中，除了上述3种同功酶之外，还含有少量的其它同功酶(E2-1-1、E2-1-2)。
以下给出了各个同功酶的N末端氨基酸序列和分子量。
由于认为从E2-2的N末端开始的第2个，以及从E2-3的N末端开始的第4个氨基酸Asp是以Asn形式合成后转变为Asp的，所以推测在上述位置的Asp为Asn的E2-2、E2-3也存在。由序列推测的分子量，E2-1(153个氨基酸)为17503、、E2-2(155个氨基酸)为17689、E2-3(157个氨基酸)为17892，与通过MS获得的测定值近似。
编码本发明的催泪因子生成酶同功酶的DNA包括序列4碱基序列给出的DNA，以及编码包括在上述蛋白质的氨基酸序列中进行附加、缺失、或置换1个或数个氨基酸后得到的衍生物的蛋白质或多肽的DNA。
本发明的具有催泪因子生成酶活性的蛋白质或多肽包括具有上述酶活性、在上述蛋白质的氨基酸序列中进行附加、缺失、或置换1个或数个氨基酸后得到的衍生物的蛋白质或多肽、用序列1～3氨基酸序列表示的具有上述酶活性的蛋白质或多肽。
编码本发明的上述E2同功酶的DNA、上述氨基酸序列可用于实现诸如控制催泪因子生成的方法，或以这些序列为标志，对供杂交用洋葱进行选择的方法，培育使催泪因子生成酶活性降低的洋葱品种的方法，通过基因重组技术大量生产催泪因子生成酶的方法等。
作为本发明的催泪因子生成酶同功酶的应用例子如以下例举的例子。
(1)催泪因子生成酶的生产将上述那样获得的催泪因子生成酶同功酶的cDNA整合到适当的表达载体中，可以制作重组载体。
使用的载体只要是在宿主细胞内可自主复制的，只要是具有可整合上述DNA，即E2同功酶基因的插入部位、而且含有可使该整合的DNA在宿主细胞内表达的区域的载体，其种类并没有限制。
而作为整合到载体的E2同功酶基因可以使用按照可编码具有本发明的催泪因子生成酶活性的蛋白质或多肽那样设计合成的DNA。而为了促进在整合的生物中的表达，使密码子转换为与整合生物相一致的密码子，不用说这些密码子变换后的DNA也包括在本发明范围中。以这样的氨基酸序列为基础的DNA的合成可以通过诸如利用DNA自动合成仪合成的寡核苷酸经退火后进行连接等方法适当实施。
另外，在E2-1、E2-2、E2-3中尽管N末端的氨基酸序列不同，但酶的性质显著一致所表明的那样，在E2-1、E2-2、E2-3中即使附加、缺失1个或数个氨基酸，获得与天然E2相同酶性质的酶的可能性是存在的。而即使置换一部分氨基酸残基，获得与天然E2相同酶性质的酶的可能性也是存在的。这样的基因改变有时可以使用市售基因部位特异的变异导入试剂盒，通过插入合成基因等的方法容易实现。因此作为整合到载体的E2同功酶基因只要是维持与天然E2相同酶性质的，即使其变异体也可以。然后将上述重组表达载体导入宿主细胞，得到转化体。重组表达载体向宿主细胞的导入可以通过惯用的方法进行。作为该导入方法如感受态细胞法、原生质体法、磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、显微注射法、微脂粒融合法等，可以根据所用的宿主采用各种任意方法。作为产生本发明的E2同功酶的宿主，合适的宿主如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、曲霉菌等微生物，蚕培养细胞等细胞。
可以通过培养上述操作得到的转化体，使E2同功酶产生在培养物中。通过利用众所周知的方法对同功酶进行分离，或纯化，稳定获得催泪因子生成酶同功酶是有可能的。
(2)利用反义RNA生产不生成催泪因子的植物根据编码本发明的E2同功酶的基因的碱基序列，通过使反义RNA在植物内进行表达，可以抑制上述遗传信息的表达。反义RNA具有与mRNA互补的碱基序列，通过与mRNA形成碱基对，阻断基因信息，抑制作为最终产物的E2同功酶蛋白质的合成。在本发明中可以使用的反义RNA是与以序列5所示碱基序列为基础合成的mRNA进行特异杂交的寡核苷酸。
反义核苷酸的靶部位因基因不同而不同，不存在无论哪个部位都可以的共有序列。而且一般来说，ATG起始部位可以成为靶部位的候补。另外在最近，由于有数种用于设计靶部位和反义核苷酸的计算机软件(HYBsimulator等)出售，利用这些软件设计反义核苷酸也是有可能的。另外反义核苷酸的长度为18～23mer，GC含量最好在50％以上。
作为使上述反义RNA在植物内发挥作用的方法，如将cDNA反向整合到表达载体的启动子的下游，导入宿主细胞之后，合成反义RNA的方法。
作为导入外源基因的方法可以使用利用土壤杆菌进行转化的方法、通过直接导入的转化法，但就洋葱等单子叶植物来说，由于通过直接导入进行的转化方法更能得到好的结果(参照Klein，T.M.et al.Nature327，70-73，1987)，所以直接导入的方法最好。
(3)E2蛋白质的大量生产含有有编码本发明中E2蛋白质的多肽的碱基序列的DNA的表达载体可以通过诸如以下的操作制造(a)分离编码E2的RNA，(b)由该RNA合成单链的cDNA，然后再合成双链DNA，(c)将该cDNA整合到质粒中，(d)用得到的质粒转化宿主，(e)培养得到的转化体，然后用合适的方法分离目的质粒，(f)从该质粒切出克隆的DNA，(g)将该克隆的DNA连接在表达型载体的启动子的下游。
编码E2的RNA只要是含有E2的材料，洋葱以外的材料也可以使用。作为从含有E2材料制备RNA的方法如酚/SDS-LiCl法(细胞工程别册、细胞工学系列2、植物的PCR实验程序p51秀润社)等。以这样得到的RNA为模板，使用逆转录酶合成cDNA，将得到的cDNA整合到质粒中。
作为整合cDNA的质粒如来自大肠杆菌的pBR322(基因(Gene)，2，95(1997))，pBR325(基因(Gene)，4，121(1978))，来自枯草杆菌的pUB110(Biochemical and Biophysical Research Communication(生物化学和生物物理研究通讯)，112，678(1983))等，即使是其它的质粒，只要是在宿主内能保持复制能力的无论哪一种都可以用。作为向质粒整合的方法一般都是制作载体和插入成分的摩尔比为1∶1到1∶10的混合液，然后用T4连接酶处理的方法(细胞工程别册、生物实验说明书 (2)基因解析基础、p78秀润社)。将这样获得的质粒导入适当的宿主，如埃希氏菌(Eschechia)属菌，芽孢杆菌(Bacillus)属菌等。
作为上述埃希氏菌属(Eschechia)菌的例子如大肠杆菌(Escherichia coli)(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，60，160(1968))等。作为上述芽孢杆菌属菌如枯草杆菌(Bacillus subtilis)MI 114(gene，24，255(1983))等。作为转化的方法如氯化钙法(Biochemicaland Biophysical Research Communication，49，1568(1972))等。从这样操作得到的转化体中，使用噬斑杂交法(Gene，10，63(1980))和DNA碱基序列确定法(Proc.Natl.Acad.Sci.，74，560(1977))等，选择出所需要的菌落。通过这样的操作可以得到带有被克隆的含有编码E2的碱基序列DNA的载体的微生物。
然后从该微生物分离质粒。作为分离法如碱法(Nucleic AcidsResearch，1513(1979))等。含有被克隆的编码E2的碱基序列的质粒可以保持原状，或按照要求用限制酶切。被克隆的基因连接在适合表达的载体中启动子的下游，可以得到表达型载体。
作为载体如来自大肠杆菌的质粒(例如pBR322)，来自枯草杆菌的质粒(例如pUB110)，来自酵母的质粒(例如pSH19)或λ噬菌体等噬菌体和逆转录病毒、牛痘病毒等动物病毒等。该基因在其5’末端含有翻译起始密码子ATG，而在3’末端也可以含有作为翻译终止密码子的TAA、TGA或TAG。而当转化时的宿主是埃希氏菌属菌时，启动子最好是trp启动子、lac启动子、recA启动子等，当宿主是芽孢杆菌属菌时，启动子最好是SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等，宿主是酵母时，启动子最好是PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子等。尤其当宿主是埃希氏菌属菌时启动子为lac启动子最好。宿主是动物细胞时如来自SV40的启动子、逆转录病毒的启动子等，尤其是来自SV40的启动子最好。
使用上述那样构建的含有DNA的载体，制造转化体。作为宿主如埃希氏菌属菌、芽孢杆菌属菌、酵母、动物细胞等。作为上述埃希氏菌属菌、芽孢杆菌属菌的具体例子如上述例举那样的菌。作为上述酵母如酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)AH22R等。作为动物细胞如传代细胞COS-7、Vero、中国仓鼠细胞CHO等。这样操作可以得到用含有DNA的载体转化的转化体。举一个例子，如后面叙述的实施例(11)中得到的Escherichia coli BL21/pGEX-4T-3-E2-3-1，该微生物根据布达佩斯条约，于2001年7月25日以保藏号FERM BP-7675保藏于独立行政法人产业技术研究所专利生物保藏中心，并保管在该研究所中。对宿主是埃希氏菌属菌、芽孢杆菌属菌的转化体进行培养时，作为培养用的培养基，液体培养基比较合适，其中应当含有该转化体生长所必需的碳源、氮源、无机物等。
作为培养埃希氏菌属菌的培养基最好是诸如LB培养基或SOC培养基(细胞工程别册生物实验说明书、1.分子生物学实验的基础，p98-99，秀润社)。根据需要为了使启动子更有效地发挥作用，可以添加诸如异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)那样的试剂。当宿主是埃希氏菌属菌时，通常在15～43℃范围内培养3～24小时，根据需要可以通气和搅拌。当对宿主为动物细胞的转化体进行培养时，作为培养基可以使用诸如含有大约5～20％胎牛血清的MEN培养基(Science，122，501(152)(1952))、DMEM培养基(Virology，8，396(1959))等。pH大约为6～8最好。培养通常从大约30℃到40℃进行大约15小时到60小时，根据需要可以提高二氧化碳浓度。
在从上述培养物中分离纯化E2蛋白质时，可以通过诸如以下的方法进行。在从培养菌体和细胞提取E2蛋白质时，培养后用常用的方法收集菌体或细胞，然后悬浮于含有盐酸胍等蛋白变性剂的缓冲液中，可以适当使用通过超声波、溶菌酶和(或冻融)破坏菌体或细胞后，经离心得到E2蛋白质的方法等。在从上述上清液中纯化E2蛋白质时，可以将大家都知道的分离和纯化方法适当组合用于纯化。作为大家都知道的分离和纯化方法如利用盐析或溶剂沉淀法等的溶解性的方法、透析法、凝胶过滤法等利用分子量差别的方法、离子交换层析等利用电荷差别的方法、亲和层析等利用特异亲和性的方法、反相高效液相层析等利用疏水性差别的方法等。
图2表示同功酶的最适pH。
图3表示同功酶的最适温度。
图4表示由737个碱基构成的全长碱基序列和E2的氨基酸序列。
图5表示由被EcoRI和NotI切出的673个碱基构成的E2-3-1的碱基和160个氨基酸序列。
图6表示由被EcoRI和NotI切出的673个碱基构成的E2-3-2的碱基和160个氨基酸序列。
图7表示E2-3-1和E2-3-2的cDNA的制作和亚克隆程序。
图8表示表达质粒的构建和转化体的制作程序。
图9表示用从谷胱甘肽葡聚糖4Fast Flow柱得到的洗脱液稀释5000倍后的样品进行的活性测定结果。
发明的最佳实施方案以下根据实施例对本发明进行具体的说明，但本发明并不受以下实施例的任何限定。
1)利用层析聚焦进行纯化层析聚焦用柱子Mono P HR5/20(5φ×200mm)(Pharmacia公司生产)用起始缓冲液(0.025M无水哌嗪用HCl调到pH5.7后的缓冲液)平衡后，上500μl的样品。上样后用洗脱缓冲液(Pharmacia生产的10％ Polybuffer用HCl调到pH4.0后的缓冲液)进行洗脱，对洗脱液进行分级回收。洗脱液的流速为0.5ml/min，分析温度为4℃，测定280nm的吸收和催泪因子生成酶活性。
2)活性的测定方法活性的测定方法如下将样品用稀释用缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，pH6.5)稀释，向10μl稀释的样品中添加蒜中的蒜酶(50单位/ml)40μl和PeCcSO溶液(20mg/ml)20μl，于室温反应3分钟后，将1μl反应液加到HPLC上，对催泪因子的生成量进行定量。在分析中使用OSD柱(4.6φ×250mm)(Senshu科学公司生产)、或DOCOSIL柱(4.6φ×250mm)(Senshu科学公司生产)。此外流动相中含有30％(v/v)的酸性MeOH，流速为0.6ml/min，柱温为35℃，检测波长为254nm。
3)结果用Mono P纯化的结果表明在E2中存在几个同功酶，其中含量高的同功酶有3种。对这3种同功酶(E2-1、E2-2和E2-3)进行了分离。
图1给出了Mono P的代表性的洗脱图。E2-1是级分4，E2-2是级分6，E2-3是级分10、11。而在E2-1中含有微量成分E2-1-1和E2-1-2。
可以确定N末端氨基酸序列的E2的同功酶含量多的有3种，含量少的有2种，一共有5种。
(2)同功酶最适pH和最适温度的比较纯化的E2-1、E2-2和E2-3各个样品用350mM的磷酸钾缓冲液(pH2.4～8.0)稀释，利用与上述(1)相同的方法进行活性测定。反应液的pH在反应结束后测定。活性的大小以表现出最大活性的点为100％，用相对值进行评价。
实验结果表明E2各个同功酶的最适pH只要在4.5～5.0范围内的任何pH下都非常类似。图2给出了最适pH的测定结果。
用上述(1)给出的方法制备反应液，使反应温度从0℃变化到60℃。活性的大小以表现出最大活性的点为100％，用相对值进行评价。实验结果表明E2各个同功酶的最适温度只要在15℃～25℃范围内的任何温度下都非常类似。图2给出了最适温度的测定结果。
(3)催泪因子生成酶同功酶N末端氨基酸序列的确定通过对用等电聚焦电泳和层析聚焦纯化的催泪因子生成酶同功酶用异硫氰酸盐法进行分析，确定N末端的氨基酸序列。此时，作为蛋白质序列分析仪使用G100A(HEWLETT PACKARD)，而PTH分析仪使用1090(HEWLETT PACKARD)。
得到的N末端的氨基酸序列如下
(4)来自洋葱的cDNA的合成采用酚/SDS/LiCl法从洋葱的鳞片提取总RNA。然后用寡dT柱纤维素层析分离含有mRNA的聚A-RNA1.5μg，以此为模板使用寡dT引物和逆转录酶合成cDNA。在从总RNA制备mRNA过程中，使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia生产)，而在以mRNA为模板合成cDNA中使用RTG-T-Primed First-Strand试剂盒(Pharmacia生产)。
(5)编码E2-1的cDNA的3’末端侧碱基序列的确定由E2-1的N末端氨基酸序列推定DNA的碱基序列，制作合成引物、5’-GGIGCI(A/C)GIAA(A/G)TGG-3’。另外也制备了与附在寡dT引物的锚部分互补的反向引物、5’-TGGAATTCGCGGCCGCAG-3’。使用制作的2个引物，以来自洋葱的cDNA作为模板，使用热循环仪(PE Biosystems Co.生产)，在以下的温度条件下进行PCR反应。
即，在95℃下进行9分钟的热变性后，反复进行如下40次反应循环于94℃进行1分钟热变性，然后在43℃进行1分钟退火，再于72℃下进行1分钟的延长反应，然后于72℃下进行2分钟的延长反应后，终止反应。结果可以得到大约660bp的单一的产物。另外在引物的碱基序列中，「/」表示「或」，而「I」表示次黄嘌呤核苷。
(6)通过PCR扩增的编码E2-1的cDNA的3’末端侧碱基序列的确定为了确定通过PCR扩增的大约660bp的碱基序列，将扩增的产物从琼脂糖凝胶中切出进行纯化，亚克隆到pGEM-T Easy Vector。然后导入大肠杆菌(XL1-Blue)，扩增后从重组的大肠杆菌中提取质粒，进行纯化。以该质粒作为样品，利用双脱氧法确定3’末端侧碱基序列。
(7)编码E2-1的cDNA5’末端侧碱基序列的确定在进行E2-1的5’末端侧cDNA的解析中利用5’RACE法。具体来说，使用5’RACE系统试剂盒(LIFE TECHNOLOGIES公司生产)，在由mRNA合成的cDNA的5’末端加上寡dC尾巴之后作为模板使用。引物使用试剂盒带的锚接引物Anchor primer，5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGII GGGIIG-3’和以在E2-1的3’末端侧cDNA的解析中已经知道的序列作为基础制作的反向引物，5’-TCCTCGTACCCTGTAAAACACTCAG-3’，使用热循环仪(PE Biosystems Co.生产)，在以下的温度条件下进行PCR反应。
即，在95℃下进行9分钟的热变性后，反复进行如下40次反应循环于94℃进行1分钟热变性，然后在55℃下进行1分钟退火，再于72℃下进行1分钟的延长反应，进行完循环反应后于72℃下进行7分钟的延长反应后，终止反应。扩增结果可以得到大约430bp的单一产物。
(8)来自E2-1的cDNA的5’末端侧碱基序列的解析为了确定通过PCR扩增的大约430bp的碱基序列，将扩增的产物从琼脂糖凝胶中切出进行纯化，通过与上述3’末端侧碱基序列情况同样的程序确定序列。序列5给出了通过3’端和5’端的解析得到的全长碱基序列。而序列4给出了在序列5检测出的开发读框部分的序列。
(9)由碱基序列得到的氨基酸序列由序列4给出的碱基序列推测氨基酸序列，然后与E2-1的N末端氨基酸序列进行比较，由于在后者序列中发现了相当的序列，所以可以确认分离的cDNA是催泪性物质同功酶E2-1的cDNA。另外也确认通过MALDI-TOFMS测定的E2-1分子量与由碱基序列得到的氨基酸序列推测的分子量一致。
E2-1的分子量测定值为17465、计算值为17503。
另外对分离的cDNA编码的蛋白质的氨基酸序列与成熟的蛋白质的氨基酸序列进行比较研究时，结果发现在cDNA编码的蛋白质的N末端侧存在成熟蛋白质中不含有的肽。该结果表明E2-1翻译成蛋白质后，N末端一侧的16个氨基酸被切去后变成了成熟的蛋白质。序列1给出了该成熟的E2-1的氨基酸序列。
(10)E2-2、E2-3氨基酸序列的确定通过与上述(2)～(9)同样的方法确定E2-2、E2-3的氨基酸序列。
从上述同功酶的N末端的氨基酸序列的分析结果可以预测E2-2大概是N末端的氨基酸比E2-1多2个残基的产物，E2-3是比E2-1多4个残基的产物，实际上如果将由从编码E2-1的基因推定的氨基酸与E2-2、E2-3的N末端氨基酸比较，确定只有一处不一致。
不一致的氨基酸E2-2N末端的第2个残基、E2-3的N末端的第4个残基是天冬氨酸，而在编码E2-1的基因中编码天冬酰胺。因此，由于考虑到编码E-1的基因和编码E2-2或E2-3的基因可能不同，用与上述E2-1的基因解析同样的方法对编码E2-2和E2-3的基因进行了解析。
首先，由E2-3的N-末端氨基酸9残基序列制作如下的E2-3-N9-1和E2-3-N9-2以及E2-3-Asp 3种合成引物，用于3’末端侧碱基序列确定。E2-3-N9-1··5’-GA(C/T)AG(C/T)GCI(A/G)A(C/T)GGIGCICGIAA(A/G)TGG-3’E2-3-N9-2··5’-GA(C/T)TCIGCI(A/G)A(C/T)GGIGCICGIAA(A/G)TGG-3’E2-3-Asp··5’-GATAGTGCTGA(C/T)GGAGCTCGAAAATGG-3’通过E2-3-N9-1的引物和上述(5)合成的反向引物的组合，以及E2-3-N9-2和反向引物的组合，E2-3-Asp引物和方向引物的组合，以来自洋葱的cDNA为模板，使用热循环仪(PE Biosystems Co.生产)，进行PCR反应。PCR条件除了退火温度改为53℃外，其它条件与上述(5)的条件一样。
PCR的结果表明，无论通过哪一种引物的组合都得到大约660bp的单一产物。而得到的3种产物的碱基序列除去引物部分，其它与E2-1的序列一致。该结果表明编码E2-2和E2-3的基因的3’末端侧的碱基序列与编码E2-1的基因序列相同。
接下来确定5’末端侧碱基序列。对于用与上述(7)情况同样的程序扩增的产物再进行2次测序，结果表明扩增产物的碱基序列无论哪一个都与E2-1的5’末端侧序列一样。
以上结果表明编码E2-2和E2-3基因与编码E2-1的基因相同。
由于编码E2同功酶的基因是相同，可以确定E2-2的N末端的第2个残基、以及E2-3的N末端的第4个残基的天冬氨酸是以天冬酰胺翻译后，然后转换为天冬氨酸的。
有关天冬酰胺转换为天冬氨酸的反应Journal of LiqidChromatography(液相色谱杂志)，15(6&7)，1115-1128(1992))等文献已经介绍了，据报道在天冬酰胺的C末端结合上甘氨酸就很容易引起向天冬氨酸的转换。
由于由碱基序列推定的E2-2的分子量(17689)与E2-2的分子量测定值(17722)，E2-3的分子量(17892)与E2-2的分子量测定值(17909)大体上一致，所以也可确认编码E2-2和E2-3的碱基序列与编码E2-1的cDNA相同。
以上结果表明E2-2是在翻译成蛋白质后，切去N末端侧的14个氨基酸，以及从N末端开始的第2个天冬酰胺经过转换为天冬氨酸反应后变成成熟蛋白质的，E2-3是在翻译成蛋白质后，切去N末端侧的12个氨基酸，以及从N末端开始的第4个天冬酰胺经过转换为天冬氨酸反应后变成成熟蛋白质的。
序列2、3分别给出了上述结果。另外序列4给出了由含有编码上述E2-1、E2-2、E2-3的基因区的507个碱基构成的结构基因(ORF)的碱基序列，而序列5给出了由737个碱基构成的全长碱基序列，图4给出了该全长碱基序列和E2的氨基酸序列。
(11)表达质粒的构建根据在本实施例E2-2、E2-3的氨基酸序列的确定中叙述的方法，使用E2-3-N9-1的正向引物和与附加在寡dT引物后的锚部分互补的反向引物(上述(5)合成的反向引物)，以来自洋葱的cDNA作为模板，进行PCR反应，得到大约660bp的产物(产物A)。
另外用E2-3-N9-2取代E2-3-N9-1作为正向引物进行PCR，同样得到大约660bp的产物(产物B)。
将得到的产物A和B通过先前叙述的碱基序列确定方法亚克隆到pGEM-T Easy Vector后，导入大肠杆菌(XL1-Blue)，对碱基序列进行解析。图7给出了亚克隆程序。
从带有整合了产物A的pGEM-T Easy Vector的大肠杆菌中得到了带有编码序列3所示多肽的碱基序列的大肠杆菌(XL1-Blue/pGEM-T-E2-3-1)。序列6和序列7以及图5给出了导入到XL1-Blue/pGEM-T-E2-3-1的产物A的碱基序列以及对应的氨基酸序列。
同样，从带有整合了产物B的pGEM-T Easy Vector的大肠杆菌中得到了带有编码只是序列3氨基酸序列第4位Asp被Asn取代的多肽的碱基序列的大肠杆菌(XL1-Blue/pGEM-T-E2-3-2)。序列8和序列9以及图6给出了导入到XL1-Blue/pGEM-T-E2-3-2的产物B的碱基序列以及对应的氨基酸序列。
作为蛋白质表达用载体使用在谷胱甘肽S转移酶(GST)基因序列的下游带有蛋白酶识别部位和多克隆位点的pGEX-4T-3(AmershamPharmacia公司生产)(图8)。
将pGEX-4T-3经EcoRI(Takara公司制)和NotI酶(Takara公司制)切后得到的大片段和上述的pGEM-T-E2-3-1经EcoRI和NotI酶切后得到的大约700bp片段进行连接，也可构建表达质粒pGEX-4T-3-E2-3-2。
(12)使用表达载体的大肠杆菌转化体的制作和培养 使用感受态细胞法将上述pGEX-4T-3-E2-3-1导入到大肠杆菌BL21-Gold(STRATAGENE公司生产)，得到转化体BL21-Gold/pGEX-4T-3-E2-3-1(图8)。
同样将上述pGEX-4T-3-E2-3-2导入到大肠杆菌BL21-Gold(STRATAGENE公司生产)，得到转化体BL21-Gold/pGEX-4T-3-E2-3-2。
将得到的转化体于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基中在37℃下振荡培养。如果向培养基中添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行生产诱导，在菌体内可蓄积GST和E2-3-1的融合蛋白(以下称之为GST-E2-3-Asp)以及GST和E2-3-2的融合蛋白(以下称之为GST-E2-3-Asn)。
(13)蛋白质的分离(纯化)对上述那样制作的转化体，经离心分离收集菌体后，进行超声破碎。将经离心回收的上清加到谷胱甘肽葡聚糖4 Fast Flow柱(AmershamPharmacia公司生产)，使GST融合蛋白吸附。将柱子洗净后，用含有还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱融合蛋白，得到2种E2-3融合蛋白样品(GST-E2-3-Asp、GST-E2-3-Asn)的纯化物。
将2种融合蛋白样品加到HiTrap Desalting柱上(AmershamPharmacia公司生产)，除去还原型谷胱甘肽，再吸附于谷胱甘肽葡聚糖4 Fast Flow柱，将柱子洗净后，用含有纤维蛋白酶的缓冲液充满柱子，于室温下进行2小时蛋白酶处理，从融合蛋白中切除GST附属物。从柱子中将除去GST附属物的GST-E2-3-Asp和GST-E2-3-Asn洗脱出来，再向该洗脱出的溶液中加入Benzamidine Sepharose 6B，经离心分离除去洗脱溶液中的纤维蛋白酶，得到2种重组E2-3(RC-E2-3-Asp、RC-E2-3-Asn)。
(14)重组蛋白质的催泪因子生成酶活性就融合蛋白样品GST-E2-3-Asp、GST-E2-3-Asn以及除去GST附属物的重组E2-3样品RC-E2-3-Asp、RC-E2-3-Asn的催泪因子生成酶活性进行测定。
结果在融合蛋白样品GST-E2-3-Asp、GST-E2-3-Asn中检测出催泪因子生成酶活性。另外对用没有导入E2-3基因的表达质粒pGEX-4T制作的转化体(BL21-Gold/pGEX-4T-3-GST)进行培养，即使经谷胱甘肽葡聚糖柱处理也没有检测出催泪因子生成酶活性。而代替样品使用磷酸缓冲液的空白也没有催泪因子生成酶活性。图9给出了用从谷胱甘肽葡聚糖4Fast Flow柱得到的洗脱液稀释5000倍后的样品进行的活性测定结果。
由以上结果可以确认即使在E2-3的N末端结合了GST(分子量约为27000)那样的大的蛋白质的融合蛋白也具有催泪因子生成酶活性。
另外由于在RC-E2-3-Asp和RC-E2-3-Asn中也检测出催泪因子生成酶活性，所以用考马斯亮篮结合方法(Bradford法)对蛋白质进行定量，算出比活性。
结果表明RC-E2-3-Asp和RC-E2-3-Asn的比活性没有差别。另外天然的E2-3和重组得到的E2-3的比活性也处于同一水平。
产业上利用的可能性本发明涉及到与粉碎或切洋葱等时产生的催泪因子有关的催泪因子生成酶的同功酶，该蛋白质或多肽的氨基酸序列以及编码该同功酶的DNA等，如果利用本发明在以下1)～7)个方面工作都会见到特别好的效果1)可以提供对用以往方法纯化困难的E2酶的3种同功酶(E2-1、E2-2、E2-3)的分离方法，2)可以提供这些同功酶的氨基酸序列，3)可以提供编码这些同功酶的碱基序列，4)上述氨基酸序列以及编码该序列的DNA在诸如减少粉碎或切洋葱等时产生的催泪因子量的洋葱品种的开发中作为选择供杂交用的材料的指标等是有用的，5)由上述DNA得到的信息在为了抑制该酶的表达量所必需的反义核苷酸的设计中是有用的，6)通过基因重组技术有效制作出催泪因子生成酶是可能的，7)可以使有效生产在泪缺乏症(干眼)等治疗中发挥作用的催泪因子能够实现。
保藏的微生物的附言保藏机关的名称和地址独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6(邮政编码305-8966))保藏日期2001年7月25日保藏号FERM BP-7675微生物表示E2-3-1
序列表序列表<110>好侍食品株式会社<120>催泪因子生成酶的同功酶及编码该酶的基因<130>F-0107<140><141><150>JP P2000-267813<151>2000-09-04<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>153<212>PRT<213>Allium cepa<400>1Gly Ala Arg Lys Trp Ser Gly Lys Val His Ala Leu Leu Pro Asn Thr1 5 10 15Lys Pro Glu Gln Ala Trp Thr Leu Leu Lys Asp Phe Ile Asn Leu His20 25 30Lys Val Met Pro Ser Leu Ser Val Cys Glu Leu Val Glu Gly Glu Ala35 40 45Asn Val Val Gly Cys Val Arg Tyr Val Lys Gly Ile Met His Pro Ile50 55 60Glu Glu Glu Phe Trp Ala Lys Glu Lys Leu Val Ala Leu Asp Asn Lys65 70 75 80Asn Met Ser Tyr Ser Tyr Ile Phe Thr Glu Cys Phe Thr Gly Tyr Glu85 90 95Asp Tyr Thr Ala Thr Met Gln Ile Val Glu Gly Pro Glu His Lys Gly100 105 110Ser Arg Phe Asp Trp Ser Phe Gln Cys Lys Tyr Ile Glu Gly Met Thr115 120 125Glu Ser Ala Phe Thr Glu Ile Leu Gln His Trp Ala Thr Glu Ile Gly130 135 140Gln Lys Ile Glu Glu Val Cys Ser Ala145 150<210>2<211>155<212>PRT<213>Allium cepa<400>2Ala Asp Gly Ala Arg Lys Trp Ser Gly Lys Val His Ala Leu Leu Pro1 5 10 15Asn Thr Lys Pro Glu 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Gln130 135 140His Trp Ala Thr Glu Ile Gly Gln Lys Ile Glu Glu Val Cys Ser Ala145 150 155 160
权利要求
1.对作用于存在于洋葱等的催泪因子前体具有生成催泪因子的活性的催泪因子生成酶利用它们等电点的差别进行纯化，得到的催泪因子生成酶的同功酶。
2.含有序列1所示氨基酸序列或含有在该氨基酸序列中进行了附加、缺失或置换1个或多个氨基酸的氨基酸序列的，具有催泪因子生成酶活性的蛋白质或多肽。
3.含有序列2所示氨基酸序列或含有在该氨基酸序列中进行了附加、缺失或置换1个或多个氨基酸的氨基酸序列的，具有催泪因子生成酶活性的蛋白质或多肽。
4.含有序列3所示氨基酸序列或含有在该氨基酸序列中进行了附加、缺失或置换1个或多个氨基酸的氨基酸序列的，具有催泪因子生成酶活性的蛋白质或多肽。
5.含有编码权利要求2、3或4记载的蛋白质或多肽的碱基序列的DNA。
6.权利要求5记载的DNA，其中编码蛋白质或多肽的碱基序列是序列4所示的DNA。
7.权利要求5记载的DNA，其中编码蛋白质或多肽的碱基序列是序列5所示的DNA。
8.重组载体，其特征是含有编码所期望基因产物的碱基序列和载体，该碱基序列是权利要求5、6或7记载的碱基序列。
9.用权利要求8记载的重组载体对微生物进行转化的转化体。
10.催泪因子生成酶同功酶的制造方法，其特征是对作用于存在于洋葱等的催泪因子前体生成催泪因子的催泪因子生成酶利用它们等电点的差别，通过纯化对同功酶E2-1、E2-2或E2-3进行分离。
11.具有催泪因子生成酶活性的蛋白质或多肽的制造方法，其特征是对用含有权利要求5、6或7记载的DNA的重组载体转化的宿主细胞进行培养，对在培养基或细胞中产生的具有催泪因子生成酶活性的蛋白质或多肽进行分离。
12.反义RNA，其特征是含有与权利要求5、6或7记载的DNA相对应的mRNA互补的碱基序列。
全文摘要
本发明的目的在于提供催泪因子生成酶的同功酶、其氨基酸序列以及编码该酶的基因等，本发明涉及到与存在于洋葱等的催泪因子的生成有关的催泪因子生成酶的3种同功酶、其蛋白质或多肽的氨基酸序列(如序列1～3所示)、含有编码上述蛋白质或多肽的DNA(如碱基序列4～5所示)，上述同功酶的制造方法，含有上述DNA的重组质粒，用该质粒转化的转化体，培养该宿主细胞、制造含有催泪因子生成酶活性的蛋白质或多肽的方法，以及含有与上述DNA相对应的mRNA互补的碱基序列的反义RNA。
文档编号C12N9/88GK1447859SQ01814378
公开日2003年10月8日 申请日期2001年8月30日 优先权日2000年9月4日
发明者今井真介, 柘植信昭, 朝武宗明 申请人:好侍食品株式会社