用于氧化还原辅因子的酶再生的方法

用于氧化还原辅因子的酶再生的方法
【专利摘要】公开了一种用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD+/NADH和NADP+/NADPH的酶再生的方法。在该方法中，由于相同反应批次中进行的至少两种另外的酶催化氧化还原反应(产物形成反应)，两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型获得，且另一种以其氧化型获得。所公开的方法的特征在于：a)在将被还原的辅因子再转化为其初始氧化型的再生反应中，氧气或通式R1C(O)COOH的化合物被还原，且b)在将被氧化的辅因子再转化为其初始还原型的再生反应中，通式为R2CH(OH)R3的化合物被氧化，化合物中的R1、R2和R3具有不同含义。
【专利说明】用于氧化还原辅因子的酶再生的方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD+/NADH和NADP+/NADPH的酶再生的方法，其中，由于相同反应批次中进行的至少两种另外的酶催化氧化还原反应(=产物形成反应)，两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型累积，另一种以其氧化型累积。

【背景技术】
[0002]现有抟术
[0003]酶催化氧化还原反应用于工业操作，例如，制备手性醇类、α -氨基酸类和α _羟基酸类。工业氧化还原反应中使用的大部分酶类使用诸如NADH或NADPH的辅因子。酶氧化还原反应中，由原位辅因子再生体系存储氧化还原辅因子是人们特别感兴趣的。其原因是仅使用催化量的昂贵辅因子(NAD(P)+/NAD(P)H)是可能的。合适的脱氢酶类和其他酶类的可得导致各种辅因子再生体系的开发。
[0004]至今为止描述的再生体系可归类为:酶联的(enzyme-1 inked)、底物联的(substrate-linked)、体内的(活有机体内的天然辅因子再生体系)、光化学的、化学的或电酶的。本处描述的方法涉及一种酶联再生体系。酶联再生体系的优点为高选择性、适用于制备各种产品和辅因子的高再利用率(总转换数，TTN)。
[0005]在90年代中期，使用酶联辅因子再生体系的第一种工业方法用在吨级。在该方法中，使用来自博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的甲酸脱氢酶。现在已知的工业方法通常使用用于产物的合成的氧化还原酶和用于辅因子再生的另外的酶。
[0006]产物和用于辅因子再生的两种酶体系的形成中涉及的两种或更多种酶氧化还原反应(同时或依次)的方法在一个反应批次中进行，不必从其中区分被分离的中间产物。最近这样的酶级联反应(本文指一锅法反应)得到特别很大关注，因为其有效减少了运行成本、运行时间和环境影响。此外，氧化还原反应的酶级联有利于通过常规化学方法难以实施的转化。
[0007]然而，在一个一锅法反应中同时进行多个反应(氧化和还原)与平行的辅因子再生是具有挑战性的，因为对独立转化通常需要差异很大的反应条件。至今为止，仅进行了非常少量的使用相关联的辅因子再生体系的、包括氧化反应和还原反应的一锅法尝试。
[0008]在文献(AdvancedSynth.Catal., 2008,第 351 卷,第 9 期,第 1303-1311 页)中，描述了使用7 α -羟基类固醇脱氢酶(HSDH)、7 β -HSDH和12 a -HSDH的一锅法反应的实验。在该方法中，区域选择和立体选择的氧化在胆酸的7位和12位进行，随后区域选择和立体选择的还原在7位进行。在该方法中，使用乳酸脱氢酶(NAD+相关的)和葡萄糖脱氢酶(NADP+相关的)作为辅因子再生体系。丙酮酸盐和葡萄糖用作辅底物。尽管这个方法开始的目的是真实的一锅法方法，最后氧化反应和还原反应独立进行。这样，氧化步骤和还原步骤的分配出现在所谓的“茶包”反应器或膜反应器中。需要该分配以避免由于NADPH-葡萄糖脱氧酶的低辅因子选择性而产生副产物。然而，在一锅法反应中，葡萄糖脱氢酶NADP+部分转化为NAD+，这阻碍了氧化。在描述的方法中，仅12.5mM(~0.5% )的底物胆酸被使用，这从生态学的观点来看使该方法不受关注。
[0009]此外，描述了使用一锅法体系通过潜手性酮作为中间产物进行仲醇的消旋体的去消旋化的尝试(J.Am.Chem.Soc.，2008，第130卷，第13969-13972页)。仲醇类的去消旋化通过具有不同辅因子特异性的两种醇脱氢酶(S-特异性的和R-特异性的)达到。在该体系中，NADP通过NADPH氧化酶再生(过氧化氢制备)且NADH通过甲酸脱氢酶再生。使用甲酸盐和氧作为辅底物。在这样的体系中，使用4种酶，不划分氧化步骤和还原步骤。该方法的缺点为使用的底物的非常低的浓度0.2-0.5%，这不适合用于工业目的。
[0010]另一种一锅法体系描述在WO 2009/121785 A2中。在该方法中，将光活性的仲醇的异构体氧化为酮且随后还原为对应的旋光对映体，其中使用具有相反的立体选择性和不同的辅因子特异性的两种醇脱氢酶。通过所谓的“氢化物转移体系”仅使用一种另外的酶将辅因子再生。对于再生辅因子，使用各种酶类，诸如甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶。该方法的缺点是使用的底物的浓度低。
[0011]现在已知的涉及辅因子再生体系的酶一锅法方法的缺点全部为非常低的底物浓度，这对工业过程是无效率的。
[0012]与此相反，其中使用辅因子再生体系的很多独立酶氧化还原反应已经是已知的。描述了使用微生物、细胞裂解物或独立酶类的实验，同时NAD(P)H或NAD(P) +再生。用于独立的氧化还原反应的已知酶辅因子再生体系包括,例如用于NADH的甲酸脱氢酶(甲酸盐作为辅底物)、用于NADH的来自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的醇脱氢酶(2-丙醇作为辅底物)、用于NADH和NADPH的脱氢酶(H2作为辅底物)、用于NADPH的来自肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)的葡萄糖_6_磷酸脱氢酶(葡萄糖_6_磷酸盐作为辅底物)、用于NADH和NADPH的葡萄糖脱氢酶(葡萄糖作为辅底物)、用于NADH的NADH氧化酶(O2作为辅底物)和用于NADH的亚磷酸脱氢酶(亚磷酸盐作为辅底物)。
[0013]这样的独立的氧化还原反应的使用的例子为以适当的潜手性酮类化合物制备手性羟基化合物。在该方法中，辅因子通过另外的酶再生。这些方法的共同点是其构成了单独的还原反应且再生了 NAD (P)H(参见例如EP I 152 054)。
[0014]已经描述了在更高底物浓度(约> 1%)下进行的、使用与辅因子再生体系结合的羟基类固醇脱氢酶类的酶方法(EP I 731618 ；W0 2007/118644 ；Appl.Microb1l.B1technol.，2011，第 90 卷，第 127-135 页)。在该方法中，辅因子 NAD (P)H 或 NAD (P)通过不同酶类(诸如，例如乳酸脱氢酶(丙酮酸盐作为辅底物)、来自布氏热厌氧杆菌(T.brockii)的醇脱氢酶(异丙醇作为辅底物)、来自短乳酸杆菌(L.brevis)、小型利什曼原虫(L.minor)、檬酸明串珠菌(Leuconostoc carnosum)、嗜热厌氧乙醇菌(T.ethanolicus)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)的醇脱氢酶)再生。然而,这些已知的方法仅涉及将单独的单个反应用于氧化羟基化合物或用于还原氧代化合物。
[0015]已经描述了使用苹果酸脱氢酶(苹果酸盐酶)的、用于NADH的辅因子再生体系(Can.J.Chem.Eng.1992，第70卷，第306-312页)。在该申请的公开内容中，其用于通过丙氨酸脱氢酶使丙酮酸盐还原胺化。辅因子再生过程中出现的丙酮酸盐随后用于产物形成反应。
[0016]在WO 2004/022764中，同样描述了通过苹果酸脱氢酶再生NADH。与前面描述的申请所公开的不同，没有另外使用苹果酸盐的氧化脱羧过程中出现的丙酮酸盐。
[0017]已经描述了涉及辅因子再生体系将D-木糖酶还原为木糖醇的例子(FEBS J.，2005，第272卷，第3816-3827页)。使用来自假单胞菌属的亚磷酸脱氢酶的NADPH相关的突变型作为辅因子再生酶。这也是用于形成产物的单个反应。
[0018]已经描述了富手性对映异构体的有机化合物(例如醇类或氨基酸类)的酶制备的另外例子(Organic Letters, 2003，第 5 卷，第 3649-3650 页；US 7，163，815 ；B1chem.Eng.J.，2008，第39 (2)卷，第319-327页；EP I 285 962)。在该体系中，使用来自短乳酸杆菌或旧金山乳酸杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)的NAD (P)H相关的氧化酶作为辅因子再生酶。这些试验同样组成了用于形成产物的单个反应。
[0019]在WO 2011/000693中，描述了 17β-羟基类固醇脱氢酶以及能够在4-雄甾烯-3，17-二酮的17位处进行氧化还原反应的方法。同样，这也为单独的还原反应。以上提到的独立进行的氧化反应或还原反应缺少一锅法反应的优点，诸如，例如由于节省时间和材料而节约成本以及由于酶级联反应的更好转换率。


【发明内容】

[0020]方法的目的和描述
[0021]本发明的目的是提供一种用于再生氧化还原辅因子NAD+/NADH和/或(例如，和)NADP+/NADPH以由其在一个反应批次中以经济的方式进行两种或更多种酶催化氧化还原反应的方法。
[0022]根据本发明，该目的以原来提到的方法来达到，其中提供了用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD+/NADH和/或(例如，和)NADP+/NADPH的酶再生的方法，其中，由于在相同反应批次中进行至少两种另外的酶催化氧化还原反应(产物形成反应)，两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型累积且另一种以其氧化型累积，该方法的特征在于:
[0023]a)在将被还原的辅因子再转化为其初始氧化型的再生反应中，氧气或以下通式的化合物被还原:
[0024]

【权利要求】
1.一种用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD+/NADH和/或，特别是和，NADP+/NADPH的酶再生的方法，其中，由于相同反应批次中进行的至少两种另外的酶催化氧化还原反应(产物形成反应)，所述两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型累积，且另一种以其氧化型累积，其特征在于: a)在将被还原的辅因子再转化为其初始氧化型的再生反应中，氧气或以下通式的化合物被还原:
其中R1表示直链或支链(C1-C4)-烷基基团或(C1-C4)-羧基烷基基团，和 b)在将被氧化的辅因子再转化为其初始还原型的再生反应中，(C4-C8)-环烷醇或以下通式的化合物被氧化:
其中R2和R3独立地选自由H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、芳基、羧基或(C1-C4)羧基烷基、特别是环烷基构成的组，其中所述烷基为直链或支链烷基，所述烯基为直链或支链烯基且包括一至三个双键，所述芳基特别是C6-C12芳基，所述环烷基例如为C3-C8环烷基。
2.根据权利要求1所述的用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD+/NADH和/或，特别是和，NADP+/NADPH的酶再生的方法，其中由于相同反应批次中进行的至少两种另外的酶催化氧化还原反应(=产物形成反应)，所述两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型累积，且另一种以其氧化型累积，其特征在于: a)在被氧化的辅因子的再生过程中，以下通式的化合物被还原:
其中R1表示取代或未取代的C1-C4烷基基团，和 b)在被还原的辅因子的再生过程中，以下通式的化合物被氧化:
其中R2和R3相互独立地选自由下列构成的组:
1)-H， 2)-(C1-C6)烷基，其中所述烷基为直链或支链烷基， 3)-(C1-C6)烯基，其中所述烯基为直链或支链烯基且任选地包括最多三个双键， 4)-环烷基，特别是C3-C8环烷基， 5)_芳基，特别是C6-C12芳基， 6)-(C1-C4)羧基烷基，在式I的化合物为丙酮酸盐的情况下，任选为羧基。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中R2和R3相互独立地选自由H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、芳基、羧基或(C1-C4)羧基烷基构成的组，其中所述烷基为直链或支链烷基，所述烯基为直链或支链烯基且包括一至三个双键，所述芳基特别是C6-C12芳基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述氧化反应和所述还原反应在相同的底物(分子主链)上发生。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述氧化反应和所述还原反应按时间顺序平行地进行。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，在将被氧化的辅因子再转化为其初始还原型的再生反应中，通过醇脱氢酶将2-丙醇氧化为丙酮。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，在将被还原的辅因予再转化为其初始氧化型的再生反应中，通过乳酸脱氢酶将丙酮酸盐还原为乳酸盐。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在将被氧化的辅因子再转化为其初始还原型的再生反应中，通过苹果酸脱氢酶将苹果酸盐氧化为丙酮酸盐和C02。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于在相同反应批次中分别进行以下通式的化合物的至少一种氧化反应和至少一种还原反应:
其中 R4表示氢、甲基基团、羟基基团或氧代基团， R5表示氢、羟基基团、氧代基团或甲基基团， R6表示氢或羟基基团， R7表示氢、-COR13、取代的或未取代的C1-C4羧基烷基基团，其中R13为未取代或被羟基基团取代的C1-C4烷基基团，所述取代的C1X4羧基烷基基团特别为被羟基基团取代的C1X4羧基烷基基团， 或R6与R7 —起表示氧代基团， R8表示氢、甲基基团、羟基基团或氧代基团， R9表示氢、甲基基团、羟基基团或氧代基团， R10表示氢、甲基基团或卤素， R11表示氢、甲基基团、羟基基团、氧代基团或卤素，和 R12表示氢、羟基基团、氧代基团或甲基基团， 其中结构元素
表示苯环或包括6个碳原子和0、1或2个C-C双键的环；特别是其中反应批次中提供的用于产物的形成中涉及的还原反应的底物的浓度< 5% (重量/体积)。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法用于将式VII的脱氢表雄酮(DHEA)转化为式VIII的睾酮
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法用于使用两种立体特异性相反的羟基类固醇脱氢酶、通过氧化为式V的酮基石胆酸且随后还原为式VI的立体特异性羟基化合物3 α，7 β - 二羟基-5 β -胆留烷酸(熊去氧胆酸)而使式IV的3 α，7 α - 二羟基-5 β_胆甾烷酸(鹅去氧胆酸)酶差向异构化:
特别是由此氧化反应由来自大肠杆菌的7 α -羟基类固醇脱氢酶催化和/或还原反应由来自扭链瘤胃球菌Ruminococcus torques的7β -羟基类固醇脱氢酶催化。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法用于使用其中两种具有相反的立体特异性的3种立体特异性羟基类固醇脱氢酶、通过下列使式IX的3α，7α，12α_三羟基-5 β_胆留烷酸(胆留烷酸)酶差向异构化:
A)通过氧化以获得式X的3α，7 α - 二羟基-12-氧代-5 β -胆留焼酸(12-氧代-⑶C)
使所述式X的3 α，7 α - 二羟基_12_氧代_5 β -胆留烷酸(12-氧代-⑶C)进一步反应以获得式XI的3 α -羟基-7，12- 二氧代-5 β -胆留焼酸(12氧代-KLC)
且随后还原为式XII的立体异构羟基化合物3 α，7 β - 二羟基-12-氧代_5 β -胆甾烷酸(12-酮基-熊去氧胆酸)
B)通过氧化以获得式XIII的3α，12 α - 二羟基-7-氧代_5 β -胆甾烷酸
接下来通过酶氧化以获得式XI的所述3 α -羟基-7，12- 二氧代-5 β -胆留烷酸(12氧代-KLC)，且随后通过还原以获得式XII的所述立体异构羟基化合物3 α，7 β - 二羟基-12-氧代-5 β -胆留烷酸(12-酮基-熊去氧胆酸)， 或 C)通过氧化以获得式XIII的3 α ,12α- 二羟基_7_氧代_5 β -胆留烧酸，接下来通过酶还原以获得式XIV的3 α，7 β，12 α -三羟基-5 β -胆甾烷酸
且随后通过氧化以获得式XII的所述立体异构羟基化合物3 α，7 β - 二羟基-12-氧代-5 β -胆留烷酸(12-酮基-熊去氧胆酸)。
13.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于(:5-或C6-糖类的异构化，特别是用于通过还原为山梨糖醇且随后氧化为果糖的葡萄糖的异构化。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应批次中提供的用于产物的形成中涉及的氧化反应的底物的浓度为至少5% (重量/体积)和更高、特别是7% (重量/体积)和更高、特别是9% (重量/体积)和更高。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述产物形成反应中整体上达到> 70%、特别是> 90%的转换率。
【文档编号】C13K11/00GK104136620SQ201380008572
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年2月6日 优先权日:2012年2月7日
【发明者】奥迪文·艾尔特, 妮可·司道宁, 玛塔·苏, 本德·梅耶 申请人:安尼基有限责任公司