用于定量受验物质的方法

用于定量受验物质的方法
【专利摘要】本发明提供了用于定量由氨基酸代表的受验物质的方法。该方法包括：使能够转化受验物质并且亦能够使用三磷酸腺苷(ATP)作为底物产生焦磷酸的酶作用于受验物质，并产生焦磷酸的步骤；让丙酮酸焦磷酸二激酶(PPDK)在一磷酸腺苷(AMP)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和定量所产生的丙酮酸的步骤。然后基于所获得的丙酮酸的量确定受验物质的量。根据本发明，可容易并迅速地定量来自于包含大量的各种杂质例如无机磷酸和尿素的生物体的样品中的氨基酸而不受杂质影响。
【专利说明】用于定量受验物质的方法
[0001]与相关申请的交叉参考
本申请要求于2012年2月9日在日本专利局提交的日本专利申请号2012-026534和于2012年3月26日在日本专利局提交的日本专利申请号2012-069625的基础上的公约优选权。这些申请的全部公开内容结合到本申请的公开内容中。

【技术领域】
[0002]本发明涉及用于定量焦磷酸的方法，包括允许焦磷酸与丙酮酸焦磷酸二激酶(PPDK)反应，和定量作为产物的丙酮酸，其适用于包含三磷酸腺苷(ATP)和无机磷酸的反应系统。本发明还涉及用于定量甲硫氨酸、瓜氨酸或精氨酸的方法，包括允许甲硫氨酸同腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)、瓜氨酸同精氨基琥珀酸合成酶(ASS)或精氨酸同精氨酸脱亚胺酶(ADI)和ASS反应，并通过前述用于定量焦磷酸的方法测量所产生的焦磷酸。
[0003]本发明进一步涉及用于测量样品中氨基酸含量的方法，所述方法包括在氨酰-tRNA合成酶(AARS)和(氨酰-AMP)-AARS复合物分解试剂的存在下使氨基酸反应，并定量产物。
[0004]本发明可用于医学领域例如天生代谢异常的筛查、生化领域例如蛋白水解产物分析以及食品和化妆品相关领域例如食品和化妆品的成分分析等等。

【背景技术】
[0005]生物样品包括血液中的氨基酸用作用于检测各种疾病的标记，从医学角度来说强烈需要开发用于定量它们的方法。另外，用于使用酶定量氨基酸的方法具有显示高选择性并允许在温和条件下快速定量的优良特性，因此其被认为是适于在实际医学站点应用于许多样品的方法。特别地，已经知道甲硫氨酸在高胱氨酸尿症患者中以高浓度累积，并且甲硫氨酸用作这些患者的临床普查的重要生物标记。另外，瓜氨酸和精氨酸为尿素循环的代谢产物，用作尿素循环代谢异常包括瓜氨酸尿症或精氨酸酶缺乏症的生物标记。用于定量这些氨基酸的简单且快速的方法也被期望应用于用于检测上述这些疾病的普查。
[0006]作为甲硫氨酸的酶定量方法，已知一种使用甲硫氨酸Y裂解酶的定量方法(非专利文献I)，并且已知一种使用功能上修饰的苯丙氨酸脱氢酶的定量方法(专利文献I)对高胱氨酸尿症的普查有效。然而，通过使用甲硫氨酸Y裂解酶的方法，氨也与甲硫氨酸一起被检出。氨通常以20-50 μ M的浓度存在于血液中，这是一个等于或高于血液甲硫氨酸浓度的水平。而且，由于血液氨水平还被运动、蛋白摄入等等改变，基于以上方法的血液检验大大受氨影响。而且，除甲硫氨酸外，甲硫氨酸Y裂解酶还显示与含硫氨基酸例如半胱氨酸和高半胱氨酸的反应性。因此，通过该定量方法，难以选择性地定量包含这些含硫氨基酸的样品中的甲硫氨酸。此外，由于功能上修饰的苯丙氨酸脱氢酶还显示与除甲硫氨酸外的其它支链氨基酸的反应性，因此用于除去支链氨基酸的预处理是需要的。
[0007]作为用于定量瓜氨酸的方法，已知一种包括使瓜氨酸与丁酮肟反应并检测产物显色的方法(非专利文献2)。然而，由于尿素及其类似化合物也类似瓜氨酸反应，该方法不能用于包含大量尿素的生物样品。而且，其还具有其它问题，例如，需要在酸性和高温条件下孵育的复杂操作，并且由于其为终止反应方法，不能监测瞬时瓜氨酸产生。另外，尚未知任何用于使用酶定量瓜氨酸的方法。
[0008]作为用于定量精氨酸的酶方法，已知一种使用精氨酸酶和尿素酶的定量方法(专利文献2)。由于在该定量方法中尿素和氨也与精氨酸一起被检测，该方法不能用于包含它们的生物样品。
[0009]作为用于定量焦磷酸的酶方法，存在一种用焦磷酸酶从焦磷酸产生无机磷酸并通过各种检测方法中的任一种定量无机磷酸的方法(1-a)。作为基于该原理的商业产品，PiPer焦磷酸测定试剂盒由Invitrogen出售，EnzChek焦磷酸测定试剂盒由Probe出售。然而，由于该测量方法还测出与焦磷酸一起的无机磷酸，该测量方法不能用于包含无机磷酸作为污染物的样品。另外，作为用于定量焦磷酸的酶方法，还存在用ATP硫酸化酶或PPDK从焦磷酸产生ATP并通过各种检测方法中的任一种定量ATP的方法(1-b)(专利文献3和4) ο作为基于该原理的商业产品，PPiLight无机焦磷酸测定试剂盒由Lanza Rockland出售。对于该方法中ATP的检测，使用了利用荧光素酶的发光方法或循环测定方法。然而，由于该原理，该方法不能用于包含ATP作为污染物的样品，并且当通过发光方法进行检测时，随时间流逝发光迅速衰退，因此此测量必须在严格的测量条件下使用昂贵的发光测量装置进行。基于循环测定法的检测可以以高灵敏度进行，但测量变得复杂，例如，监测吸光度以严格计算反应速率是必需的。此外，关于基于以上原理的测量，还已知一种使得能够甚至在包含ATP的样品中测量的改进方法(参考专利文献5)。然而，该方法使用进行ATP移除作为预处理，然后定量焦磷酸的步骤。因此，该方法可用于其中从反应系统除去ATP不引起任何问题的情况，但其不能用于其中需要ATP存在的反应系统。
[0010]此外，还已知用次黄嘌呤磷酸核糖转移酶从焦磷酸产生次黄嘌呤并定量次黄嘌呤的方法(1-C)(专利文献6)。此方法中使用的反应底物不包含无机磷酸和ATP，因此该方法使得能够测量焦磷酸而不受这些化合物的存在情况影响。然而，通过此方法，ATP不能响应焦磷酸消耗而再生。
[0011]氨酰-tRNA合成酶(AARS)为通过使用一种特定的氨基酸、ATP和tRNA作为底物产生氨酰-tRNA、AMP和焦磷酸的酶。存在与各个构成蛋白质的氨基酸相应的AARS。与各个构成蛋白质的氨基酸相应的AARS后文中用氨基酸名连上“RS”表示。例如，与丙氨酸相应的AARS表示为“AlaRS”，与半胱氨酸相应的AARS表示为“CysRS”。
[0012]已知AARS对氨基酸显示非常高的底物特异性。该酶催化的反应由以下的两步反应组成。
[0013][方程式I]
(反座式 i)AARS={AMP)-AARS 复合物+焦《#鐵
(反应式 2} {^St-AMP)-AARS I合物+tRNA=.氣聽-tRNA+AJP--..AARS
+ (总反应) Il基酸τ ΑΤΡ-? I RN A =氨酿-1 RNA- ATP->焦碳酸
从非专利文献3等知道，如上述反应式所示形成了 “(氨酰-AMP)-AARS复合物”，此复合物为刚性的，AARS在不存在tRNA的情况下仍然被捕获在该复合物中，等等。非专利文献3还描述，若将羟胺加入前述复合物中，该复合物分解产生氨基酸异羟肟酸和AMP。
[0014]非专利文献4报道了一种用于定量氨基酸的方法，包括加入极小量的tRNA使样品中的部分氨基酸按照前述反应式I和2反应。
[0015]专利文献7和8报道了一种用于定量氨基酸的方法，包括仅允许样品中一部分氨基酸类似于前述反应式I的反应反应，而不添加tRNA。
[0016]现有技术参考专利文献
专利文献1:日本专利未实审的公布(Kokai)号2008-86312，用于使用功能上修饰的苯丙氨酸脱氢酶分析生物样品中的L-甲硫氨酸的方法。
[0017]专利文献2:日本专利未实审的公布(Kokai)号8_336399，用于检测精氨酸的方法和精氨酸传感器。
[0018]专利文献3:日本专利未实审的公布(Kokai)号2009-225784，用于测量焦磷酸的方法。
[0019]专利文献4:日本专利未实审的公布(Kokai)号2007-097471，用于测定核苷酸序列的方法和试剂。
[0020]专利文献5:日本专利未实审的公布(Kokai)号2006-187251，用于定量焦磷酸的方法。
[0021]专利文献6:日本专利未实审的公布(Kokai)号2003-174900，用于定量焦磷酸和核酸的方法及其装置。
[0022]专利文献7:日本专利未实审的公布(Kokai)号2011-50357，用于分析氨基酸的方法和生物传感器。
[0023]专利文献8:日本专利未实审的公布(Kokai)号2006-166709，用于氨基酸分析的生物传感装置、用于氨基酸分析的生物传感器和用于氨基酸分析的氨酰-tRNA合成酶。
[0024]非专利文献
非专利文献 I:Research of psychosomatic disorders, Ministry of Health andWelfare (心身障碍研究，卫生福利部)，1993, "Research on evaluat1n method of massscreening system (普查系统评估方法的研究)〃，第237-240页(1993)
非专利文献 2:Boyde, T.R.& Rahmatullah Μ.(1980), Optimizat1n ofcondit1ns for the colorimetric determinat1n of ci trulline, usingdiacetylmonoxime (使用丁酮月亏比色测定瓜氨酸的条件的优化)，Anal.B1chem.，107，424-431
非专利文献 3:Baldwin, A.N.& Berg, P.(1966)，Transfer ribonucleicacid-1nduced hydrolysis of valyl adenylate bound to isoleucyl ribonucleic acidsynthetase (转移核糖核酸诱导的与异亮氨酰核糖核酸合成酶结合的纟颜氨酰腺苷酸的水解)，J.B1l.Chem.，241，839-845
非专利文献 4:Forbes, C.D., Myung, J., Szewczak, A.A.& Landro, J.A.(2007), A high-throughput competitive scintillat1n proximity aminoacyl-tRNAsynthetase charging assay to measure amino acid concentrat1n (测量氛基酸浓度的高通量竞争性闪烁迫近氨酰-tRNA合成酶负载测定法)，Anal.B1chem., 363，246-254发明简述
本发明要达到的目标
生物样品(包括血浆)包含大量的各种各样的污染物，包括无机磷酸和尿素，用于分析它们中所包含的受验物质的方法需要不受这些污染物影响。
[0025]通过使用ATP与测量的受验物质一起作为底物产生焦磷酸的酶非常有希望作为用于测量的酶，这是由于其高底物特异性和其基于ATP水解(此为放能反应)的高反应性。基于ATP水解的高反应性具体地描述为反应可不可逆地前进，反应可以以高反应速率前进，可促进甚至由于局部高能的缺点没有ATP水解不能前进的各种反应，等等。而且，由于血液焦磷酸浓度在几μΜ以下，大大低于以几十至几百μΜ级存在的氨基酸浓度，焦磷酸产生酶的使用具有这样的优点，即，即使样品被检验目标来源的焦磷酸污染，也几乎不影响氨基酸的定量值。作为使用这样的焦磷酸产生酶用于分析生物样品的前提，定量焦磷酸是必需的，并且用于定量焦磷酸的方法需要满足下列要求:
其可用于包含大量无机磷酸的生物样品。
[0026]其可在用于与使用ATP作为底物的焦磷酸产生酶偶联的ATP的存在下进行。
[0027]其可从焦磷酸再生ΑΤΡ，避免酶促反应产物的累积和底物的再生。
[0028]然而，还未知任何满足这些要求的用于定量焦磷酸的方法，因此使用前述焦磷酸产生酶测量氨基酸还未实际进行。
[0029]已知AARS对氨基酸显示极高的底物特异性，而且其为有希望作为用于定量氨基酸的酶的酶。
[0030]非专利文献4的定量方法为这样一种方法，其包括混合样品、ATP、tRNA和作为测量对象的放射性标记氨基酸，然后允许AARS作用于该混合物，将所产生的氨酰-tRNA吸附在小珠上并测量其放射性以定量作为测量对象的氨基酸。在非专利文献4的定量方法中，使用放射性同位素是不可避免的，这是因为该方法计算掺入产物中的标记氨基酸的存在比率。因此，该定量方法仅可在可以处理放射性同位素的环境中使用。而且，该定量方法还需要复杂的过程例如吸附在小珠上和从小珠分离。此外，在该定量方法中，tRNA以高达0.5mg/ml的高浓度作为最大浓度加入到反应混合物中。然而，如果将该浓度转化为相应于作为测量对象的氨基酸的tRNA摩尔浓度，计算为30 (Pg)/60 (μ1)/30，000 (g/mol)/20 = 0.8μΜ (假定tRNA的分子量为30，000，并且包含等量的与氨基酸相应的20种tRNA)。所获反应产物的摩尔浓度低于前述浓度，并且不使用放射性同位素难以定量如此小量的化合物。因此,在这样的如非专利文献4添加tRNA的方法中，必须检出极小量的反应产物,可以说使用放射性同位素是不可避免的。
[0031]专利文献7和8的定量方法为包括仅使氨基酸、ATP和AARS反应(该反应条件后文将被称为“无tRNA添加的条件”)并检测产物的方法。由于在这些定量方法中不使用tRNA,认为前述反应式2的反应不能前进。
[0032]在专利文献7和8中，没有讨论如反应式I中提到的(氨酰-AMP) -AARS复合物的存在，但其描述AARS催化下列反应式I’的反应。如果假定反应如反应式I’中所述前进，并且平衡被打破使得反应完全向右前进，可认为焦磷酸以与氨基酸相同的摩尔数产生，并且可通过定量焦磷酸定量氨基酸。然而，这两篇发明专利均未提及不是反应式I的反应而是反应式I’的反应前进这一描述的任何基础。
[0033][方程式2]
(反应式I’)氨基酸+ATP =氨酰-AMP+焦磷酸
本发明的发明人在如专利文献7和8所述的无tRNA添加的条件下进行了测量。然而，至少通过本发明的发明人所使用的检测方法，不能检测到显著的焦磷酸产生(参考实施例
6、11，无羟胺添加的样品)。认为无显著焦磷酸产生的原因为实际发生的反应不是前述反应式I’的反应，而是前述反应式I的反应。在反应式I的反应中，当I摩尔氨基酸反应，消耗I摩尔AARS用于形成复合物。因此，除非AARS以至少比样品中氨基酸高的摩尔浓度加入到系统中，否则理论上不可能产生与样品中氨基酸相同量的焦磷酸。
[0034]本发明的发明人在实施例6、11中所使用的反应混合物中的AARS浓度为约9 μΜ,显著低于氨基酸浓度。而且，专利文献7、8和非专利文献4中未描述AARS以高于作为测量对象的氨基酸的摩尔浓度加入到系统中。在专利文献2中(段落
[0024])，定量0-100 μΜ氨基酸时的AARS浓度为10 μΜ,因此可以说AARS没有以高于氨基酸的浓度添加。因此，认为以下是合理的:若假定反应式I的反应在专利文献7和8的方法中前进到最大程度，则样品中仅极小部分氨基酸可用于该反应并且产物也小量获得。前述专利文献中没有显示否定上述的任何数据。
[0035]如果与样品中的氨基酸相比仅产生极小量的产物，则如专利文献7中所使用的基于荧光方法、传感器电极等这样的高灵敏度的检测系统变得不可避免，并且用广泛使用的检测系统例如基于吸光度方法的那些进行检测变得不可能。而且，甚至当使用高灵敏度检测系统时，可导致各种问题，例如灵敏度降低、测量值变化和背景值提高。
[0036]如上所述，使用AARS的已知氨基酸定量方法具有问题，例如，其需要使用放射性同位素的复杂过程，以及仅样品中极小部分氨基酸可反应，因此它们没有被广泛使用。
[0037]用于达到本发明目标的手段
本发明的发明人发现，如果焦磷酸与PPDK反应并且所产生的丙酮酸与丙酮酸脱氢酶或丙酮酸氧化酶反应，可实现焦磷酸的定量而不受无机磷酸或ATP存在的影响，并且能够使ATP再生。
[0038]他们进一步发现，如果甲硫氨酸与AdoMetS反应，用前述焦磷酸定量系统测量所产生的焦磷酸，则可选择性地定量甲硫氨酸而不用任何预处理，并实现了基于以上的甲硫氨酸定量系统。而且，他们还发现，如果瓜氨酸与ASS反应，用前述焦磷酸定量系统测量所产生的焦磷酸，则可在温和条件下选择性地定量瓜氨酸，并实现了基于以上的瓜氨酸定量系统。此外，他们还发现，如果精氨酸与ADI反应，用前述焦磷酸定量系统测量所产生的焦磷酸，则可选择性定量精氨酸，并实现了基于以上的精氨酸定量系统。
[0039]本发明的发明人进一步发现，在无tRNA添加的条件下AARS反应混合物中未观察到显著的焦磷酸产生，但若加入分解(氨酰-AMP)-AARS复合物的试剂，焦磷酸以与样品中氨基酸相等的量产生。因此，他们发现通过使反应混合物中基本上所有量的氨基酸如前述反应式I的复合物分解反应进行反应可以以高灵敏度和小误差定量氨基酸，并完成本发明。
[0040][I]用于定量受验物质的方法，包括:
允许可通过使用三磷酸腺苷(ATP)作为底物并对受验物质进行转化而产生焦磷酸的酶作用于受验物质以产生焦磷酸的步骤；允许丙酮酸焦磷酸二激酶(ProK)在一磷酸腺苷(AMP)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和定量所产生的丙酮酸的步骤，和其中基于所获得的丙酮酸的量确定受验物质的量。
[0041][2] [I]的方法，其中所述受验物质为氨基酸。
[0042][3]用于定量甲硫氨酸的方法，包括:
允许腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)在ATP的存在下作用于甲硫氨酸以产生腺苷甲硫氨酸和焦磷酸的步骤；
允许PPDK在AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和定量所产生的丙酮酸的步骤，
和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定甲硫氨酸的量。
[0043][4]用于定量瓜氨酸的方法，包括:
允许精氨基琥珀酸合成酶(ASS)在天冬氨酸和ATP的存在下作用于瓜氨酸以产生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步骤； 允许PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，
和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定瓜氨酸的量。
[0044][5]用于定量精氨酸的方法，包括:
允许精氨酸脱亚胺酶(ADI)作用于精氨酸以产生氨和瓜氨酸的步骤；
允许ASS作用于所产生的瓜氨酸以产生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步骤；
允许PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，
和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定精氨酸的量。
[0045][6]用于定量氨基酸的方法，包括:
允许与氨基酸相应的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP)-AARS复合物分解试剂的存在下作用于该氨基酸和ATP以获得焦磷酸的步骤(A);和定量步骤(A)中所产生的焦磷酸的步骤(B)，和
其中步骤(B)包括允许PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；以及
定量所产生的丙酮酸的步骤，和
基于所获得的丙酮酸的量确定所述氨基酸的量。
[0046][7] [6]的方法，其中所述复合物分解试剂为胺或负碳离子。
[0047][8] [7]的方法，其中所述复合物分解试剂为羟胺、肼或甲胺。
[0048][9] [6]_[8]中任一项的方法，所述方法在不存在tRNA的情况下进行。
[0049][10] [6]_[9]中任一项的方法，所述方法用于定量一个样品中的两种或更多种氨基酸，并且包括步骤:
制备与作为定量对象的各个氨基酸相应的AARS，
制备包含除AARS外的所需组分的反应试剂， 混合反应试剂与样品，
将混合物至少分成与受验氨基酸的种类数相应的部分，和向所分成的部分中分别加入不同的AARS。
[0050][11] [6]-[10]中任一项的方法，其中AARS得自嗜热生物，并且步骤(A)在50°C或更高的温度下进行。
[0051][12] [1]-[11]中任一项的方法，其中定量丙酮酸的步骤包括:
允许(i)乳酸脱氢酶、(?)丙酮酸氧化酶、(iii)丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶或(iv)丙酮酸脱羧酶和醛脱氢酶作用于丙酮酸的步骤。
[0052][13] [1]-[12]中任一项的方法，所述方法用于定量样品中的受验物质，其中所述样品可包含ATP或磷酸。
[0053][14] [13]的方法，其中所述样品得自血液。
[0054][15]用于[3]中定量甲硫氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、AdoMetS, AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
[0055][16]用于[4]中定量瓜氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、ASS、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
[0056][17]用于[5]中定量精氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、ASS、AD1、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
[0057][18]用于[6]中定量氨基酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、AARS, AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
[0058][19]用于定量氨基酸的方法，包括:
允许与氨基酸相应的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP)-AARS复合物分解试剂的存在下作用于该氨基酸和ATP以获得反应产物的步骤(A);和定量步骤(A)中所产生的产物的步骤(B)，和其中基于所获得的产物的量确定所述氨基酸的量。
[0059]本发明还提供以下:
[I]用于定量焦磷酸的方法，包括:
允许丙酮酸焦磷酸二激酶(ProK)在一磷酸腺苷(AMP)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于焦磷酸以产生三磷酸腺苷(ATP)、磷酸和丙酮酸的步骤，和定量所产生的丙酮酸的步骤，和其中基于所获得的丙酮酸的量确定焦磷酸的量。
[0060][2] [I]的方法，其中定量丙酮酸的步骤包括:
允许(i)乳酸脱氢酶、(?)丙酮酸氧化酶、(iii)丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶或(iv)丙酮酸脱羧酶和醛脱氢酶作用于丙酮酸的步骤。
[0061][3] [I]的方法，其用于定量样品中焦磷酸，并且其中所述样品可包含ATP或磷酸。
[0062][4] [3]的方法，其中所述样品得自血液。
[0063][5]用于定量受验物质的方法，包括:
允许可通过使用ATP作为底物并对受验物质进行转化而产生焦磷酸的酶作用于受验物质以产生焦磷酸的步骤；
允许PPDK在AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，和其中基于所获得的丙酮酸的量确定受验物质的量。
[0064][6]用于定量甲硫氨酸的方法，包括:
允许腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)在ATP的存在下作用于甲硫氨酸以产生腺苷甲硫氨酸和焦磷酸的步骤；
允许PPDK在AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，和其中基于所获得的丙酮酸的量确定甲硫氨酸的量。
[0065][7]用于定量瓜氨酸的方法，包括:
允许精氨基琥珀酸合成酶(ASS)在天冬氨酸和ATP存在情况下作用于瓜氨酸以产生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步骤；
允许PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定瓜氨酸的量。
[0066][8]用于定量精氨酸的方法，包括:
允许精氨酸脱亚胺酶(ADI)作用于精氨酸以产生氨和瓜氨酸的步骤；
允许ASS作用于所产生的瓜氨酸以产生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步骤；
允许PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定精氨酸的量。
[0067][9]用于[6]中定量甲硫氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、AdoMetS、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
[0068][10]用于[7]中定量瓜氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、ASS、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
[0069][11]用于[8]中定量精氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、ASS、AD1、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
[0070]本发明进一步提供以下:
[I]用于定量氨基酸的方法，包括:
允许与氨基酸相应的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP)-AARS复合物分解试剂的存在下作用于该氨基酸和三磷酸腺苷(ATP)以获得反应产物的步骤(A);和定量步骤(A)中所产生的产物的步骤(B)，和其中基于所获得的产物的量确定所述氨基酸的量。
[0071][2] [I]的方法，所述方法在不存在tRNA的情况下进行。
[0072][3] [I]或[2]的方法，其中所述复合物分解试剂为胺或负碳离子。
[0073][4] [3]的方法，其中所述复合物分解试剂为羟胺、肼或甲胺。
[0074][5] [1]-[4]中任一项的方法，其中所述产物在步骤(B)中通过测量吸光度定量。
[0075][6] [1]-[5]中任一项的方法，其中在步骤(B)中定量的产物为焦磷酸，并且焦磷酸的定量包括允许丙酮酸焦磷酸二激酶(PTOK)作用于焦磷酸的步骤。
[0076][7] [1]-[6]中任一项的方法，所述方法用于定量样品中的氨基酸，并且所述样品得自血液。
[0077][8] [1]-[7]中任一项的方法，所述方法用于定量一个样品中的两种或更多种氨基酸，并且包括步骤:
制备与作为定量对象的各个氨基酸相应的AARS， 制备包含除AARS外的所需组分的反应试剂，
混合反应试剂与样品，
将混合物至少分成与受验氨基酸的种类数相应的部分，和向所分成的部分中分别加入不同的AARS。
[0078][9] [1]-[8]中任一项的方法，其中AARS得自嗜热生物，并且步骤(A)在50°C或更高的温度下进行。
[0079]发明效果
由于本发明用于定量焦磷酸的方法的定量能力不受无机磷酸或ATP存在的影响，所以其可在包含大量污染物的样品例如血液中进行。而且，由于使用了 PPDK，因此在与通过使用ATP作为底物产生焦磷酸的酶的偶联系统中，ATP可从焦磷酸再生。根据本发明，反应完成后系统显示用于定量的信号强度仅小量变化，并且该系统使得能够基于吸光度测量定量。因此，所述方法可方便地甚至在缺乏昂贵的专门用途的装置例如发光检测装置的测量条件中进行。
[0080]本发明的甲硫氨酸定量方法可针对包含除甲硫氨酸外的氨基酸或氨的样品作为对象进行而无需任何预处理。而且，由于其不是终止反应方法，并且样品中基本上全部的甲硫氨酸可作为相应量的焦磷酸定量，因而能够容易地监测甲硫氨酸随时间的产生。
[0081 ] 本发明的瓜氨酸定量方法可针对包含除瓜氨酸外的氨基酸或尿素的样品作为对象进行而无需任何预处理。而且，其不需要高温孵育，使得能够容易地监测瓜氨酸随时间的产生。
[0082]本发明的精氨酸定量方法可针对包含除精氨酸和瓜氨酸外的氨基酸、尿素或氨的样品作为对象进行而无需任何预处理。
[0083]与非专利文献4中所述的定量方法相比，本发明使用AARS的定量方法显示了下列无法比拟的优势。
[0084]-由于它们不使用放射性同位素及对其的检测装置，故其可用普通装置在普通环境中使用。
[0085]-它们不需要复杂的过程例如酶促反应后吸附在小珠上和从小珠分离以及反应混合物与样品的混合，因为样品可用于测量。
[0086]-鉴于即使除去吸附在小珠上和后续过程所需要的时间，非专利文献4中所述的定量方法也需要2小时用于测量，本发明方法使能够在约10分钟内测量。
[0087]与专利文献7和8中所述的定量方法相比，本发明使用AARS的定量方法显示下列无法比拟的优势。
[0088]-由于产物以与样品中氨基酸的量相等的量获得，使得能够进行高灵敏度和高精度定量。
[0089]-它们使得能够用普通的吸光度测量而不使用任何荧光试剂或传感器电极定量。
[0090]-鉴于专利文献7和8中所述的定量方法分别需要40分钟(专利文献7，段落
[0075])和55分钟(专利文献8，段落
[0024])用于测量，本发明方法使得能够在约10分钟内测量。
[0091]附图简述
[图1]图1为显示使用乳酸脱氢酶的情况下的焦磷酸校正曲线的曲线图(用比色计测量)。
[0092][图2]图2为显示使用乳酸脱氢酶的情况下的焦磷酸校正曲线的曲线图(用酶标仪测量)。
[0093][图3]图3为显示使用丙酮酸氧化酶和显色染料的情况下的焦磷酸校正曲线的曲线图。
[0094][图4]图4为显示使用丙酮酸氧化酶和荧光染料的情况下的焦磷酸校正曲线的曲线图。
[0095][图5]图5为显示用包含磷酸或ATP的反应混合物建立的焦磷酸校正曲线的曲线图。
[0096][图6]图6为显示通过向生物样品中加入焦磷酸所进行的试验的结果的曲线图。
[0097][图7]图7为显示甲硫氨酸校正曲线的曲线图。
[0098][图8]图8为显示瓜氨酸校正曲线的曲线图。
[0099][图9]图9为显示精氨酸校正曲线的曲线图。
[0100][图10]图10显示加入不同浓度的羟胺(0、50、100、200、400、600、800和1000
mM)时Tyr定量反应混合物的吸光度的瞬时变化。曲线图中的数字(25、50、100和150)代表反应混合物中的Tyr浓度(μΜ)。水平轴代表开始测量后的时间，垂直轴代表吸光度与无Tyr添加的样品所观察到的吸光度相比的差异。结果通过对每个反应混合物制备一个样品并用其进行测量来获得。
[0101] [图11]图11显示从测量开始后20分钟获得的测量值建立的Tyr校正曲线。曲线图中的数字(0、50、100、200、400、600、800和1000)代表用于各个校正曲线的羟胺浓度(mM)。对于包含200、400、600、800和1000 mM羟胺的样品所获得的结果，还绘制了初级近似线。
[0102][图12]图12显示Tyr浓度与吸光度差异的相关系数的瞬时变化。曲线图中的数字(0、50、100、200、400、600、800 和 1000)代表羟胺浓度(mM)。
[0103][图13]图13显示通过使用得自于栖热袍菌属(Jhermotoga)的CysRS获得的Cys校正曲线。
[0104][图14]图14显示通过使用得自于栖热袍菌属的LysRS获得的Lys校正曲线。
[0105][图15]图15显示通过使用得自于栖热袍菌属的SerRS获得的Ser校正曲线。
[0106][图16]图16显示通过使用得自于栖热袍菌属的TyrRS获得的Tyr校正曲线。
[0107][图17]图17显示通过使用得自于栖热菌属(Jhernms)的TyrRS获得的Tyr校正曲线。
[0108][图18]图18显示通过使用钥蓝方法获得的His校正曲线。
[0109][图19]图19显示通过使用钥蓝方法获得的Pro校正曲线。
[0110][图20]图20显示通过使用钥蓝方法获得的Trp校正曲线。
[0111][图21]图21显示通过使用得自于栖热菌属的IleRS并在70°C进行反应获得的Ile校正曲线。
[0112][图22]图22显示通过使用得自于栖热菌属的MetRS并在70°C进行反应获得的Met校正曲线。
[0113][图23]图23显示通过使用得自于栖热菌属的TyrRS并在70°C进行反应获得的Tyr校正曲线。
[0114][图24]图24显示通过使用肼作为复合物分解试剂获得的Tyr校正曲线。
[0115][图25]图25显示通过使用甲胺作为复合物分解试剂获得的Tyr校正曲线。
[0116]用于实施本发明的方式
本发明提供用于定量受验物质的方法，受验物质的典型实例包括氨基酸。本发明方法包括下列步骤:
允许可通过使用三磷酸腺苷(ATP)作为底物并对受验物质进行转化而产生焦磷酸的酶作用于受验物质以产生焦磷酸的步骤；
允许丙酮酸焦磷酸二激酶(PI3DK)在一磷酸腺苷(AMP)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和定量所产生的丙酮酸的步骤。
[0117]此外，在本发明的方法中，受验物质的量基于所获得的丙酮酸的量确定。本发明的方法还具有这样的特征，第一步反应里消耗的ATP在检测焦磷酸的同时再生。
[0118]作为通过使用ATP与受验物质一起作为底物产生焦磷酸的酶，已经知道多种不同的酶，并且根据EC分类已注册几十种以上的酶。实例包括，例如，黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶(FAD合成酶)、磷酸核酮糖激酶、链霉素3’ ’ -腺苷酰转移酶、生物素-CoA连接酶和乙酰乙酸-CoA连接酶。在本说明书中，通过使用ATP与受验物质一起作为底物产生焦磷酸的酶可通过举例来说明，特别是腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)、精氨基琥珀酸合成酶(ASS)、精氨酸脱亚胺酶(ADI)和氨酰-tRNA合成酶(AARS)，但本领域技术人员将能够理解的是，此说明可适当应用于其它酶的使用。
[0119]通过使用ATP与受验物质一起作为底物产生焦磷酸的酶可根据来源、存在位置(细胞膜、细胞质、细胞外等)、底物特异性和反应特异性、活性位点、活性位点的残基等等分类。例如，虽然目前为止尚未知任何不含AARS的生物，但存在不含AdoMetS、ASS或ADI的生物。另外，AdoMetS和ASS与氨基酸的侧链部分反应，AARS与氨基酸的羧基反应。
[0120]1.用于利用特别的焦磷酸定量方法定量氨基酸的方法
根据本发明的一个实施方案，提供了使用特别的用于定量焦磷酸的方法来定量甲硫氨酸的方法、定量瓜氨酸的方法和定量精氨酸的方法。
[0121]本发明使用的术语受验物质的“定量(定量化)”意指测量受验物质的量，除非特别指明，并且该量可测量为绝对量，或可测量为样品中的浓度。
[0122][用于定量焦磷酸的方法]
本发明用于定量焦磷酸的方法包括:
允许PPDK在金属离子、AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤(1-A)，和
定量所产生的丙酮酸的步骤(1-B)，和基于所获得的丙酮酸的量确定焦磷酸的量。
[0123]步骤(1-A)可通过用PTOK、金属离子、AMP和PEP孵育样品中的焦磷酸来进行。PPDK催化的反应由下列反应式表示。
[0124][式I]
焦磷酸+ PEP + AMP —丙酮酸+ ATP +磷酸
本发明使用的术语“磷酸”指无机磷酸(H3PO4),除非特别指明。磷酸还可被称为正磷酸。
[0125]用于本发明的PPDK不受来源、酶名称、EC编号、生产方法等限制，只要其为显示对前述反应的催化作用的酶。例如，得自丙酸杆菌属{Prop1nibacteriuni)或热变形菌属(Jhermoproteus')的那些,更特别地，可优选使用得自费氏丙酸杆菌(Prop1nibacteriumfreudenreichii) (Pf)和附着热变形菌(Jlwrmoproteusteimx) (Tt)的那些。Pf-来源的PPDK为充分研究的细菌来源的酶的一种。其优势在于可期望在大肠杆菌(Bscherichiacoli)表达系统中大量表达，其可作为与甘油的混合物在4°C稳定贮存，并且甚至反复冻融后不显示活性显著降低。由于Tt为超级嗜热生物，Tt-来源的PPDK在这些方面占优势:可期望其能在常温下纯化，并且甚至在高温时其不变性且可用。更特别地，可优选使用得自费氏丙酸杆菌亚种NBRC 12426菌株或附着热变形菌NBRC 100435菌株的酶。
[0126]所使用的PPDK的量无特别限制，只要其使得能够进行本发明的焦磷酸定量，并且其可适当地根据样品中包含的焦磷酸的量、使用的装置、PPDK纯度和类型决定。所使用的PPDK的量，就最低量而言，优选0.001 U/ml或更多、更优选0.005 U/ml或更多、还更优选0.01 U/ml或更多。无论如何，就最大量而言，所述量优选10 U/ml或更低、更优选5 U/ml或更低、还更优选I U/ml或更低。
[0127]步骤(1-A)在AMP的存在下进行。存在的AMP浓度，就最小浓度而言，为0.01 mM或更高、更优选0.025 mM或更高、还更优选0.05 mM或更高。此外，无论如何，就最大浓度而言，优选20 mM或更低、更优选10 mM或更低、还更优选5 mM或更低。
[0128]步骤(1-A)还在高能磷酸化合物例如PEP的存在下进行。存在的PEP浓度，就最小浓度而言，优选0.01 mM或更高、更优选0.025 mM或更高、还更优选0.05 mM或更高。而且，无论如何，就最大浓度而言，优选20 mM或更低、更优选10 mM或更低、还更优选5 mM或更低。
[0129]步骤(1-A)优选在金属离子的存在下进行。所述金属离子可为镁离子、钴离子和锰离子中的任一种，并且优选镁离子。所使用的金属离子的量，就最小量而言，在例如镁离子的情况下，优选AMP浓度的0.1当量或更多、更优选AMP浓度的0.2当量或更多、还更优选AMP浓度的0.4当量或更多。而且，无论如何，就最大量而言，优选10当量或更低、更优选5当量或更低、还更优选2.5当量或更低。最优选的量为磷酸供体的0.5-2当量，例如，I
=I里。
[0130]在步骤(1-B)中，反应系统中的丙酮酸被定量，并且其可通过使用例如乳酸脱氢酶反应定量。乳酸脱氢酶为一种分布在广泛范围的生物中的酶，并且催化下列反应。
[0131][式2]
丙酮酸+ NADH —乳酸+ NAD+
对于本发明，可使用得自于各种生物的乳酸脱氢酶。例如，得自兔子、猪、牛、家禽、乳酸菌或酵母的多种乳酸脱氢酶已在市场出售，并且可优选使用这些中的任一种。
[0132]所使用的乳酸脱氢酶的量无特别限制，只要使得能够进行本发明焦磷酸的定量，并且可适当地根据样品包含的焦磷酸的量、使用的装置、酶纯度和类型决定。所使用的酶量，就最小量而言，优选0.002 U/ml或更多、更优选0.005 U/ml或更多、还更优选0.01 U/ml或更多。此外,无论如何,就最大量而言,优选4 U/ml或更低、更优选2 U/ml或更低、还更优选I U/ml或更低。
[0133]此外， 步骤(1-B)还在NADH的存在下进行。NADH浓度的影响比较显著。例如，如果NADH浓度过度低，则吸光度的检测变得困难，如果其过度高，其减少量的测量值的精确度降低。存在的NADH的量，就最小浓度而言，优选0.01 mM或更高、更优选0.02 mM或更高、还更优选0.05 mM或更高。无论如何,就最大浓度而言,优选4 mM或更低、更优选2 mM或更低、还更优选I mM或更低。
[0134]在使用乳酸脱氢酶的系统中，丙酮酸的产量通过测量340 nm处的吸光度测量NADH量的减少来计算，NADH的量随反应前进减少。
[0135]使用乳酸脱氢酶的步骤(1-B)可与步骤(1-A)在同一系统中同时前进。尽管反应温度适当地考虑所使用酶的最佳温度等决定，反应可适当地在室温至37°C，例如30°C的温度下进行。尽管反应时间可适当地考虑试验样品中含有的焦磷酸的量等决定，但反应迅速前进，样品中基本上全部量的焦磷酸可在20分钟内，例如约7-13分钟内用于NADH的氧化。若需要，这些步骤可在适当的缓冲液例如20 mM咪唑-HCl (pH 7.0)中进行。上述系统中的组分浓度可由本领域技术人员适当确定，例如，其可在下列范围内。
[0136]MgCl2:0.5-50 mM
PEP:0.05-5 mM
AMP:0.05-5 mM
NADH:0.05-1 mM
PPDK:0.01-1 U/ml
乳酸脱氢酶:0.01-1 U/ml
在使用乳酸脱氢酶反应的实施方案中，可定量至少0-200 μΜ范围内的焦磷酸。
[0137]步骤(1-B)也可在过氧化氢检测系统中通过使用丙酮酸氧化酶催化的反应进行。
[0138]丙酮酸氧化酶催化下列反应。
[0139][式3]
丙酮酸+磷酸+ O2 + H2O —乙酰磷酸+ 二氧化碳+ H2O2
可用于本发明的丙酮酸氧化酶无特别限制，可优选使用得自不同类型的生物的那些，例如，得自假单胞菌属{Pseudomonas、的那些。
[0140]所使用的丙酮酸氧化酶的量无特别限制，只要使得能够进行本发明的焦磷酸定量，并且可适当地根据样品中包含的焦磷酸的量、使用的装置、酶的纯度和类型决定。所使用的酶量，就最小量而言，优选0.03 U/ml或更多、更优选0.07 U/ml或更多、还更优选0.15U/ml或更多。无论如何,就最大量而言,优选60 U/ml或更少、更优选30 U/ml或更少、还更优选15 U/ml或更少。
[0141]由丙酮酸氧化酶作用所产生的过氧化氢可通过已知的方法，例如通过使用过氧化物酶反应定量。所述过氧化物酶可为任何可用于定量过氧化氢的过氧化物酶，并且其实例包括辣根来源的过氧化物酶。
[0142]所使用的过氧化物酶的量无特别限制，只要使得能够进行本发明的焦磷酸定量，并且可适当地根据样品中包含的焦磷酸的量、使用的装置、酶的纯度和类型决定。所使用的酶量，就最小量而言，优选0.03 U/ml或更多、更优选0.07 U/ml或更多、还更优选0.15 U/ml或更多。无论如何,就最大量而言,优选300 U/ml或更少、更优选150 U/ml或更少、还更优选75 U/ml或更少。
[0143]另外,作为与过氧化物酶反应的电子受体,可使用可用作所使用的过氧化物酶的底物的任何显色剂或荧光剂。显色剂的实例包括，例如，4-氨基安替比林:苯酚等。伴随辣根来源的过氧化物酶，过氧化氢与前述显色剂如下所示反应，并且作为产物的醌亚胺染料可通过在505 nm处测量吸光值检测。
[0144][式4]
2H20 + 4-氨基安替比林+苯酌.一醌亚胺染料+ 4H20
此外，与过氧化物酶反应的荧光剂的实例包括10-乙酰基-3，7- 二羟基吩噁嗪(ADHP)等。伴随辣根来源的过氧化物酶，过氧化氢与ADHP反应产生突光物质试卤灵(resorufin),并且其可基于590 nm处的荧光(激发，530 nm)检测。本领域技术人员可根据使用的过氧化酶类型适当地选择显色剂和荧光剂例如，4-氨基安替比林和ADHP。此外，检测波长也可由本领域技术人员根据使用的显色剂或荧光剂类型适当地选择。
[0145]使用丙酮酸氧化酶的步骤(1-B)也可与步骤(1-A)在同一系统中同时前进。尽管反应温度考虑所使用酶的最佳温度等适当决定，但反应可适当地在室温至37°C，例如30°C的温度下进行。尽管反应时间可考虑试验样品中包含的焦磷酸的量适当决定，但反应迅速前进，样品中基本上全部量的焦磷酸可在20分钟内，例如约7-13分钟内用于产生过氧化氢。若需要，这些步骤可在适当的缓冲液例如20 mM咪唑-HCl (pH 7.0)中进行。
[0146]当所有的步骤在同一系统中通过使用4-氨基安替比林和苯酚进行时，组分的浓度可由本领域技术人员适当地确定，并且例如，其可在下列范围内。
[0147]MgCl2:2.5-250 mM
NH4Cl:1-100 mM
PEP:0.05-5 mM
AMP:0.05-5 mM
PPDK:0.01-1 U/ml
4-氨基安替比林:0.1-10 mM
苯酚:0.1-10 mM丙酮酸氧化酶:0.15-15 U/ml 过氧化物酶:0.15-75 U/ml
在使用4-氨基安替比林和苯酚的实施方案中，可定量至少0-200 μΜ范围内的焦磷酸。
[0148]当所有的步骤在同一系统中通过使用ADHP进行时，组分的浓度可由本领域技术人员适当地确定，并且例如，其可在下列范围内。
[0149]MgCl2:0.5-50 mM
NH4Cl:1-100 mM
PEP:0.05-5 mM
AMP:0.05-5 mM
PPDK:0.01-1 U/ml
Na-PO4:0.05-5 mM
ADHP:50 μΜ
丙酮酸氧化酶:0.15-15 U/ml 过氧化物酶:0.15-75 U/ml
在使用ADHP的实施方案中，可定量至少0-10 μΜ范围内的焦磷酸。根据此实施方案，可测量痕量的焦磷酸。
[0150]步骤(1-B)还可为在这样的系统中进行的步骤，所述系统经构建使得除两种前述酶外丙酮酸还与显色剂例如2，4- 二硝基苯肼反应，并测量产物的吸光度。值得推荐的是关注该系统用除丙酮酸外的2-含氧酸可同样显色这一事实。步骤(1-B)还可在经构建使得通过使用丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶检测NADH的减少的系统中进行。此外，其还可为在经构建使得通过使用丙酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶检测NADH产生的系统中进行的步骤。进行这些步骤所需的条件可由本领域技术人员适当地设计。
[0151]本发明用于定量焦磷酸的方法可甚至在焦磷酸或ATP的存在下进行。此外，其具有可产生ATP这一优点。作为用于定量焦磷酸的常规方法，存在用焦磷酸酶从焦磷酸产生无机磷酸并通过各种检测方法中的任一种定量无机磷酸的方法(1-a)、用ATP硫酸化酶或PPDK从焦磷酸产生ATP并通过各种检测方法中的任一种定量ATP的方法(1-b)和用次黄嘌呤磷酸核糖转移酶从焦磷酸产生次黄嘌呤并定量次黄嘌呤的方法(1-c)，但它们不具有如上所述的特征。
[0152]本发明方法和常规方法的特征在下表中概括给出。
[0153][表 I]

【权利要求】
1.用于定量受验物质的方法，包括: 允许可通过使用三磷酸腺苷(ATP)作为底物并对受验物质进行转化而产生焦磷酸的酶作用于受验物质以产生焦磷酸的步骤； 允许丙酮酸焦磷酸二激酶(PI3DK)在一磷酸腺苷(AMP)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和定量所产生的丙酮酸的步骤，和其中基于所获得的丙酮酸的量确定受验物质的量。
2.权利要求1的方法，其中所述受验物质为氨基酸。
3.用于定量甲硫氨酸的方法，包括: 允许腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)在ATP的存在下作用于甲硫氨酸以产生腺苷甲硫氨酸和焦磷酸的步骤； 允许PPDK在AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和定量所产生的丙酮酸的步骤， 和 其中基于所获得的丙酮酸的量确定甲硫氨酸的量。
4.用于定量瓜氨酸的方法，包括: 允许精氨基琥珀酸合成酶(ASS)在天冬氨酸和ATP的存在下作用于瓜氨酸以产生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步骤； 允许PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和 定量所产生的丙酮酸的步骤， 和 其中基于所获得的丙酮酸的量确定瓜氨酸的量。
5.用于定量精氨酸的方法，包括: 允许精氨酸脱亚胺酶(ADI)作用于精氨酸以产生氨和瓜氨酸的步骤； 允许ASS作用于瓜氨酸以产生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步骤； 允许PPDK在AMP和PEP 的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和 定量所产生的丙酮酸的步骤， 和 其中基于所获得的丙酮酸的量确定精氨酸的量。
6.用于定量氨基酸的方法，包括: 允许与所述氨基酸相应的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP) -AARS复合物分解试剂的存在下作用于所述氨基酸和ATP以获得焦磷酸的步骤(A);和定量步骤(A)中所产生的焦磷酸的步骤(B)，和 其中步骤(B)包括允许PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；以及 定量所产生的丙酮酸的步骤，和基于所获得的丙酮酸的量确定所述氨基酸的量。
7.权利要求6的方法，其中所述复合物分解试剂为胺或负碳离子。
8.权利要求7的方法，其中所述复合物分解试剂为羟胺、肼或甲胺。
9.权利要求6-8中任一项的方法，所述方法在不存在tRNA的情况下进行。
10.权利要求6-9中任一项的方法，所述方法用于定量一个样品中的两种或更多种氨基酸，并且包括步骤: 配制与作为定量对象的各个氨基酸相应的AARS， 配制包含除AARS外的所需组分的反应试剂， 混合反应试剂与样品， 将混合物至少分成与受验氨基酸的种类数相应的部分，和 向所分成的部分中分别加入不同的AARS。
11.权利要求6-10中任一项的方法，其中AARS得自嗜热生物，并且步骤(A)在50°C或更高的温度下进行。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中定量丙酮酸的步骤包括: 允许(i)乳酸脱氢酶、(?)丙酮酸氧化酶、(iii)丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶或(iv)丙酮酸脱羧酶和醛脱氢酶作用于丙酮酸的步骤。
13.权利要求1-12中任一项的方法，所述方法用于定量样品中的受验物质，其中所述样品可包含ATP或磷酸。
14.权利要求13的方法，其中所述样品得自血液。
15.用于权利要求3的定量甲硫氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、AdoMetS、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
16.用于权利要求4的定量瓜氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、ASS、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
17.用于权利要求5的定量精氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、ASS、AD1、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
18.用于权利要求6的定量氨基酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、AARS、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
19.用于定量氨基酸的方法，包括: 允许与所述氨基酸相应的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP)-AARS复合物分解试剂的存在下作用于所述氨基酸和ATP以获得反应产物的步骤(A);和 定量步骤(A)中所产生的产物的步骤(B)，和 其中基于所获得的产物的量确定所述氨基酸的量。
【文档编号】C12Q1/25GK104136627SQ201380008746
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年2月8日 优先权日:2012年2月9日
【发明者】浅野泰久, 龟谷将史 申请人:富山县政府, 味之素株式会社