糖基化作为植酸酶的稳定剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供具有增加的稳定性的经修饰的酶，优选植酸酶，所述增加的稳定性假设是由增加的糖基化引起。可修饰所述酶以在氨基酸序列中引入或增加氨基酸序列中的糖基化位点数目，或者可通过使用特定的宿主产生方法增加糖基化，或采用这两种方法。本发明的酶具有增加的在升高的温度下处理后的稳定性，所述在升高的温度下处理后的稳定性可通过在处理如加热之后的失活可逆性或回收率百分比来测量。本发明的酶可应用于例如食品、饲料和饲料制丸。
【专利说明】糖基化作为植酸酶的稳定剂
[0001] 优先权
[0002] 本申请要求2012年2月7日提交的系列号为61/595, 941的美国临时专利申请的 优先权，特此将该专利以引用的方式并入本文。
【技术领域】
[0003] 本教导内容涉及经修饰的植酸酶的领域。更具体地讲，本教导内容涉及通过突变 植酸酶自身和/或由于涉及去糖基化缺陷型宿主细胞的植酸酶产生方法而进行的植酸酶 糖基化。在一些实施例中，所涉及的植酸酶是真菌植酸酶或细菌植酸酶，并且可来自布丘氏 菌属（Buttiauxella) 〇
【背景技术】
[0004] 植酸盐是磷在谷类和豆类中的主要储存形式。然而，单胃动物如猪、家禽和鱼不能 代谢或吸收植酸盐（或植酸）并因而其被排泄，从而在高密度家畜生产的区域导致潜在的 磷污染。此外，植酸还通过螯合金属剂如钙、铜和锌而在单胃动物中充当抗营养剂。
[0005] 为了给这些动物的生长和健康提供足够的磷酸盐，将无机磷酸盐添加至它们的饮 食。这种添加可能是昂贵的并且进一步增加潜在的污染问题。
[0006] 通过植酸酶的作用，植酸盐通常被水解而产生低级磷酸肌醇和无机磷酸盐。植 酸酶可用作动物饲料的添加剂，其中它们可改善无机磷对动物的可利用率以及降低对 环境的磷酸盐污染（Wodzinski RJ, Ullah AH. Adv Appl Microbiol.(《应用微生物进 展》）42, 263-302(1996))。
[0007] 文献中已描述了许多真菌来源的植酸酶（Wyss M.等人，Appl. Environ. Microbiol.(《应用和环境微生物学》）65(2), 367-373(1999) ;Berka R.M.等人，Appl. Environ. Microbiol.(《应用和环境微生物学》）64(11) ,4423-4427 (1998) ;Lassen S.等 人，Appl. Environ. Microbiol.(《应用和环境微生物学》）67(1〇)，4701-4707 (2001))和 细菌来源的植酸酶（Greiner R.等人，Arch. Biochem. Biophys.(《生物化学与生物物理 学集刊》）303(1), 107-113(193) ;Kerovuo 等人，Appl. Environ. Microbiol.(《应用和环 境微生物学》）64(6) ,2079-2085 (1998) ;Kim H.W·等人，Biotechnol. Lett.(《生物技术 通讯》）25, 1231-1234(2003) ;Greiner R.等人，Arch. Biochem. Biophys.(《生物化学 与生物物理学集刊》）341 (2),201-206(1997) ;Yoon S.J.等人，Enzyme and microbial technol.(《酶和微生物技术》）18, 449-454 (1996) ;Zinin N.V.等人，FEMS Microbiol. Lett.(《FEMS 微生物通讯》）236, 283-290(2004))。具体地讲，BPll (W02006/043178)、 BP17(W02008/097619)和BP111(W02009/129489)由于它们的稳定性，尤其是它们的热稳 定性是适用于食品和动物饲料中的已知变体植酸酶。这些植酸酶是布丘氏菌属Pl_29(以 登录号NCMB4124保藏）的野生型植酸酶的变体。植酸酶已知可经历可逆的热失活 (Wyss，Appl.Envir.Microbiol·(《应用和环境微生物学》）（1998)64:4446)。
[0008] 动物饲料可能会在高温下制备、生产和加工。特别是它们可能由丸粒（pellet)或 颗粒（granule)如W099/32595和W02007/044968中描述的那些形成。动物饲料的制备因 而要求饲料和饲料成分在高温下是热稳定的。因此如果饲料酶（尤其是植酸酶）在暴露于 高温或升高的温度后保留高水平的酶活性，则是有利的。
[0009] 可以在氨基酸水平上修饰酶以引入糖基化位点，这可促进酶的糖基化。例如， N连接聚糖附连于分泌性蛋白表面上的基序NXS/T内的天冬酰胺残基（Weerapana和 Imperiali (2006)Glycobiology (《糖生物学》）16:91R-101R)。已知酶的糖基化可提供增 加的热稳定性（Koseki等人，（2006)Biosci. Biotechnol. Biochem.(《生物科学生物技术和 生物化学》）70:2476-2480)。已知增加的糖基化可增加一些植酸酶在低pH下的蛋白酶稳 定性（W001/90333)以及热稳定性（W02006/028684)。然而，这些参考文献没有公开布丘氏 菌属起源的植酸酶，或没有公布进一步增加的糖基化可在酶处于固体状态时改善饲料制丸 (pelleting)期间对蒸气处理的耐受性。
[0010] 本教导内容提供具有增加的失活可逆性的改善的糖基化的植酸酶。在一些实施例 中，该植酸酶可用于食品或饲料。在一些实施例中，该植酸酶经历制丸工艺以包括在食品或 饲料中。
【发明内容】
[0011] 在一些实施例中，本教导内容提供包含SEQ ID NO: 1的植酸酶多肽和与之具有至 少75%、85%、90%、95%、98%、99%或99.9%同一性的变体，所述植酸酶和变体具有增加 的糖基化和增加的稳定性。
[0012] 在一些实施例中，本教导内容提供包含SEQ ID NO: 1的植酸酶多肽和与之具有至 少75%、85%、90%、95%、98%、99%或99.9%同一性的变体，其中所述植酸酶多肽在去糖 基化缺陷型宿主中产生。
[0013] 在一些实施例中，本教导内容提供包含SEQ ID NO: 1的植酸酶多肽和与之具有至 少75 %、85%、90 %、95%、98 %、99%或99. 9 %同一性的变体，所述植酸酶多肽和变体包含 至少一个额外的糖基化位点，其中所述至少一个额外的糖基化位点通过引入氨基酸改变以 产生N连接糖基化位点基序Asn-Xaa-Ser/Thr来实现，其中Xaa可以是任何氨基酸。
[0014] 在一些实施例中，本教导内容提供在去糖基化缺陷型宿主中产生的植酸酶多肽。
[0015] 在一些实施例中，本教导内容提供与SEQ ID N01、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11任一 者具有至少75%、85%、90%、95%、98%、99%或99.9%同一性的植酸酶多肽。
[0016] 在一些实施例中，本教导内容提供增加制丸的植酸酶多肽的稳定性的方法，包括： 使植酸酶多肽糖基化；用所述植酸酶多肽形成颗粒；将所述颗粒在至少85°C、至少90°C或 至少95°C的温度下制丸，以形成制丸的植酸酶多肽；从而与缺少所述糖基化的对照制丸的 植酸酶多肽相比，增加了制丸的植酸酶多肽的稳定性。
[0017] 在一些实施例中，本教导内容提供制备具有高植酸酶活性的食品或饲料的方法。
[0018] 在一些实施例中，本教导内容提供饲养动物的方法，包括施用包含植酸酶多肽的 饲料组合物。
[0019] 在一些实施例中，本教导内容提供通过本文的方法制备的植酸酶多肽。
[0020] 在一些实施例中，本教导内容提供编码植酸酶多肽的核酸。
[0021 ] 在一些实施例中，本教导内容提供包含核酸序列的载体或宿主细胞。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 本教导内容将参照如下附图进行描述：
[0023] 图1提供了质粒pTrex3g/BP_17的图谱。
[0024] 图2提供了变体植酸酶的分子量比较。
[0025] 图3提供了对从里氏木霉（T. reesei)产生的BP17样品和从内切-N-乙酰氨基葡 萄糖苷酶基因缺失的里氏木霉产生的BP17样品的分析。
[0026] 图4提供了失活可逆性研宄，显示了在pH4. 0下于95°C保持10分钟的不同宿主中 表达的BP17的保留活性百分比。
[0027] 图5提供了在95°C下处理10分钟后，随时间变化的BP_17(从里氏木霉产生）和 BP-17 (从内切-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因缺失的里氏木霉产生）的保留活性百分比。
[0028] 图6提供了在将表3的颗粒制剂在90 °C和95 °C下制丸后所获得的恢复活性 (recovered activity)的图。
[0029] 序列
[0030] SEQ ID NO: I = BP17,与野生型（SEQ ID NO: 4)相比包含12个氨基酸置换的变体 植酸酶，缺少信号序列（SEQ ID NO: 12)。
[0031] SEQ ID N0:2 = BP11，与野生型（SEQ ID N0:4)相比包含11个氨基酸置换的变体 植酸酶，缺少信号序列（SEQ ID NO: 12)。
[0032] SEQ ID N0:3 = BP111，与野生型（SEQ ID N0:4)相比包含21个氨基酸置换的变 体植酸酶，缺少信号序列（SEQ ID NO: 12)。
[0033] SEQ ID N0:4 =由以登录号NCMB41248保藏的布丘氏菌属菌株P1-29编码的野生 型植酸酶，缺少信号序列（SEQ ID NO: 12)。
[0034] SEQ ID N0:5 =具有额外的氨基酸置换E121T的BP17。
[0035] SEQ ID NO:6 =具有额外的氨基酸置换P394N的BP17。
[0036] SEQ ID NO:7 =具有额外的氨基酸置换D386N的BP17。
[0037] SEQ ID N0:8 =具有额外的氨基酸置换K202N和N204T的BP17。
[0038] SEQ ID N0:9 =具有额外的氨基酸置换Q151N和P153S的BP17。
[0039] SEQ ID NO: 10 =具有额外的氨基酸置换P373T的BP17。
[0040] SEQ ID NO: 11 =具有额外的氨基酸置换Q76N的BP17。
[0041] SEQ ID NO: 12 =野生型（SEQ ID NO:4)的信号序列。
[0042] SEQ ID NO: 13 =在5'端含有Spel位点以及在3'端含有Ascl位点的布丘氏菌植 酸酶的BP-17变体的DNA序列。
[0043] SEQ ID NO: 14-17 =引物。
[0044] SEQ ID NO:18=实例1中的PCR产物序列，在cbhl启动子与信号序列/BP-17编 码序列之间。
[0045] SEQ ID NO: 19 =实例1中的PCR产物序列，在BP-17编码序列的3'端与cbhl终 止区之间。
[0046] SEQ ID NO:20-29 =引物。
[0047] SEQ ID NO:30-47 =引物。
【具体实施方式】
[0048] 除非另外指明，否则本教导内容的实施将采用分子生物学的常规技术（包括重 组技术）、微生物学的常规技术、细胞生物学的常规技术、生物化学的常规技术和动物饲 料制丸的常规技术，这些常规技术在本领域技术内。这类技术在例如以下的文献中充分 解释：Molecular Cloning:A Laboratory Manual (《分子克隆：实验室手册》），第二版 (Sambrook 等人，1989) :01igonucleotide Synthesis (《寡核苷酸合成》）（M. J. Gait 编 辑，1984 ：Current Protocols in Molecular Biology (《现代分子生物学实验技术》） (F. Μ· Ausubel 等人编辑，1994) :PCR: The Polymerase Chain Reaction (《PCR :聚合酶链反 应》）（Mullis等人编辑，1994) ：Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual (〈〈基 因转移和表达：实验室手册》）（Kriegler，1990)，以及Fairfield, D. 1994.第10章， Pelleting Cost Center.载于：Feed Manufacturing Technology IV(饲料制造技术 IV). (McEllhiney编辑），弗吉尼亚州阿灵顿县的美国饲料行业协会（American Feed Industry Association, Arlington, Va.)，第 110-139 页。
[0049] 除非本文另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本教导内容 所属领域普通技术人员技术通常所理解的相同的含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (《微生物学和分子生物学词典》），第二版，纽约约 翰威立国际出版公司（John Wiley and Sons, New York) (1994),以及 Hale 和 Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology (《哈泊柯林斯生物学词典》)，纽约哈泊永久出版 社（Harper Perennial, NY) (1991)为技术人员提供了许多本发明所用术语的通用词典。与 本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料均可用于本教导内容的实践或 测试。
[0050] 本文提供的数字范围包括限定该范围的数字。
[0051] 除非另外指明，否则分别地，核酸从左至右以5'至3'取向写出；氨基酸序列从左 至右以氨基至羧基取向写出。
[0052]
[0053] 如本文所用，术语"氨基酸序列"与术语"多肽"、"蛋白质"和"肽"是同义词，并且 可互换使用。在此类氨基酸序列表现出活性的情况下，它们可被称为"酶"。使用常规的氨基 酸残基的单字母或三字母代码，其中氨基酸序列以标准的氨基端至羧基端取向（即，N - C) 提供。
[0054] 术语"核酸"涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可为单 链或双链的，而且可为化学修饰物。术语"核酸"与"多核苷酸"可互换使用。由于遗传密 码具有简并性，故可以使用不止一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法 涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作说明，否则核酸序列是以5'至3'取向 给出。
[0055] 所谓"同源物"，应当意指对象氨基酸序列和对象核苷酸序列具有指定程度的同一 性的实体。同源序列被认为包括与对象序列具有至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性的氨基酸序 列，该同一性使用常规的序列比对工具Clustal V采用默认参数测量。通常，同源物将包括 与对象氨基酸序列相同的活性位点残基，但可包括任何数目的保守氨基酸置换。示例性的 保守氨基酸置换在如下保守氨基酸置换表中列出。
[0056] 保守氨基酸詈换
[0057]
【权利要求】
1. 一种包含SEQ ID N0:1的植酸酶多肽和与之具有至少75%、85%、90%、95%、98%、 99%或99. 9%同一性的变体，所述植酸酶多肽和变体具有增加的糖基化和增加的稳定性。
2. -种包含SEQ ID N0:1的植酸酶多肽和与之具有至少75%、85%、90%、95%、98%、 99 %或99. 9%同一性的变体，其中所述植酸酶多肽在去糖基化缺陷型宿主中产生。
3. -种包含SEQ ID N0:1的植酸酶多肽和与之具有至少75%、85%、90%、95%、98%、 99 %或99. 9 %同一性的变体，所述植酸酶多肽和变体包含至少一个额外的糖基化位点， 其中所述至少一个额外的糖基化位点通过引入氨基酸改变以产生N连接糖基化位点基序 Asn-Xaa-Ser/Thr来实现，其中Xaa可以是任何氨基酸。
4. 一种植酸酶多肽，所述植酸酶多肽在去糖基化缺陷型宿主中产生。
5. -种植酸酶多肽，所述植酸酶多肽与SEQ ID勵1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11任一者 具有至少75%、85%、90%、95%、98%、99%或99.9%同一性。
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的植酸酶多肽，参照SEQ ID NO: 1的位置编号，所述 植酸酶多肽包含如下置换中的一者或多者：E121T、P394N、D386N、K202N*N204T、Q151N* P153S、P373T、Q76N。
7. 根据权利要求1-6中任一项所述的植酸酶多肽，其中所述多肽具有SEQ N05、6、7、8、 9、10或11的氨基酸序列。
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的植酸酶多肽，所述植酸酶多肽具有1个或更多个、 2个或更多个、3个或更多个或者4个或更多个增添的糖基化位点。
9. 根据权利要求1-8中任一项所述的植酸酶多肽，其中所述稳定性包括与缺少增加的 糖基化的对照植酸酶相比暴露于升高的温度后的增加的失活可逆性，其中所述升高的温度 是至少80°C、至少85°C、至少90°C或至少95°C。
10. 根据权利要求9所述的植酸酶，其中所述失活可逆性比缺少增加的糖基化的对 照植酸酶高至少 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、 15%、16%、17%、18%、19% 或 20%。
11. 根据权利要求9或10所述的植酸酶，其中在加工成食品或饲料丸粒后发生所述失 活可逆性。
12. 根据权利要求1-11中任一项所述的植酸酶多肽，其中所述稳定性包括与缺少所述 增加的糖基化的对照植酸酶相比暴露于至少80°C、至少85°C、至少90°C或至少95°C的升高 的温度后的增加的恢复活性。
13. 根据权利要求12所述的植酸酶，其中与缺少增加的糖基化的对照植酸酶相比所 述增加的恢复活性是至少 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、 200%、250%、300% 或 350%。
14. 根据权利要求1-11中任一项所述的植酸酶多肽，其中所述稳定性包括与在至少 80°C、至少85°C、至少90°C或至少95 °C的升高的温度下暴露之前的植酸酶相比，暴露于所 述升高的温度后的恢复活性。
15. 根据权利要求14所述的植酸酶，其中与在所述升高的温度下暴露之前的所述植酸 酶相比，所述恢复活性是至少40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、85 %或90 %。
16. 根据权利要求12-15中任一项所述的植酸酶多肽，其中在加工成食品或饲料丸粒 后发生所述增加的恢复活性。
17. 根据权利要求1-16中任一项所述的植酸酶多肽，其中所述宿主细胞是真菌细胞。
18. 根据权利要求17所述的植酸酶多肽，其中所述真菌细胞是丝状真菌细胞。
19. 根据权利要求18所述的植酸酶多肽，其中所述丝状真菌细胞是曲霉属物种 (Aspergillus spp)、镜抱菌属物种（Fusariumspp)、毁丝霉属物种（Myceliophthoraspp) 或木霉属物种（Trichodermaspp)。
20. 根据权利要求19所述的植酸酶多肽，其中所述曲霉是黑曲霉（A.niger)、米 曲霉（A. oryzae)、构巢曲霉（A. nidulans)、塔宾曲霉（A. tubingensis)或泡盛曲霉 (A. awamori) 〇
21. 根据权利要求19所述的植酸酶多肽，其中所述木霉是里氏木霉（T. reesei)。
22. 根据前述权利要求中任一项所述的植酸酶多肽，其中所述植酸酶包含在颗粒中，任 选地其中所述颗粒是多层型颗粒，任选其中所述颗粒包含在丸粒中，并且任选其中所述丸 粒包含在动物饲料中。
23. -种增加制丸的植酸酶多肽的稳定性的方法，所述方法包括： 使植酸酶多肽糖基化； 用所述植酸酶多肽形成颗粒； 在至少85°C、至少90°C或至少95°C的温度下将所述颗粒制丸，以形成制丸的植酸酶多 肽；以及 与缺少所述糖基化的对照制丸的植酸酶多肽相比，增加了所述制丸的植酸酶多肽的稳 定性。
24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述糖基化包括： (i)在其中已缺失了所述内切氨基葡萄糖苷酶基因的宿主中表达编码所述植酸酶多肽 的核苷酸序列。
25. 根据权利要求23所述的方法，其中所述糖基化包括： 给所述植酸酶多肽引入氨基酸突变以产生N-连接糖基化位点基序Asn-Xaa-Ser/Thr， 其中Xaa可以是任何氨基酸。
26. 根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述稳定性包括与缺少增加的糖 基化的对照植酸酶相比，暴露于至少80°C、至少85°C、至少90°C或至少95°C的升高的温度 后增加的失活可逆性。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述失活可逆性比缺少增加的糖基化的对照植 酸酶高至少 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、 16%、17%、18%、19% 或 20%。
28. 根据权利要求26-27任一项所述的方法，其中在加工成食品或饲料丸粒后发生所 述失活可逆性。
29. 根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述稳定性包括与缺少所述增加 的糖基化的对照植酸酶相比，暴露于至少80°C、至少85°C、至少90°C或至少95°C的升高的 温度后的增加的恢复活性。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中与缺少增加的糖基化的对照植酸酶相比所述增 加的恢复活性是至少 20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %、150 %、200 %、 250%、300%或 350%。
31. 根据权利要求29-30中任一项所述的方法，其中在加工成食品或饲料丸粒后发生 所述增加的恢复活性。
32. 根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述植酸酶多肽是权利要求1-20 中的任一项。
33. -种植酸酶多肽，所述植酸酶多肽通过根据权利要求23-31中的任一项所述的方 法制备。
34. -种制备具有高的植酸酶活性的食品或饲料的方法，所述方法包括在制造过程中 将根据权利要求1-22中任一项所述的植酸酶多肽或通过根据权利要求23-31中的任一项 所述的方法制备的植酸酶多肽添加至食品或饲料成分。
35. -种饲养动物的方法，所述方法包括施用包含根据权利要求1-22中任一项所述的 植酸酶多肽或通过根据权利要求23-31中的任一项所述的方法制备的植酸酶多肽的饲料 组合物。
36. -种核酸，所述核酸编码根据权利要求1-22中任一项所述的植酸酶多肽。
37. -种载体或宿主细胞，所述载体或宿主细胞包含根据权利要求36所述的核酸序 列。
【文档编号】C12N9/14GK104487571SQ201380008462
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2013年2月1日 优先权日:2012年2月7日
【发明者】M·S·格伯特, S-K·李, M·奥尔蒂斯-马尔多纳多, M·华德 申请人:丹尼斯科美国公司