烃合成酶基因及其利用的制作方法
【专利摘要】本发明提供具有烷烃等烃合成能力优异的新功能的烃合成酶基因。所述烃合成酶基因编码包含具有序列号1所示的基序序列的氨基酸序列、且具有由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性的蛋白质。
【专利说明】烃合成酶基因及其利用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及具有新特征的烃合成酶基因及该基因的利用。
【背景技术】
[0002] 已知能够合成烷烃等烃的微生物。通过由该具有烃合成能力的微生物确定、分 离参与烃合成的基因，可以期待开发出烃合成能力优异的重组微生物、开发出利用该重组 微生物的烃合成系统等。例如，在专利文献1(W02006/109558)中，公开了通过培养具有烃 生产能力的新微细藻类椭圆微细绿藻（Pseudochoricystis ellipsoidea)、属于微细绿藻 (Pseudochoricystis)属或索囊藻（Choricystis)属并具有经生产能力的微细藻类而从培 养物中提取烃的方法。
[0003] 另外，在专利文献2(日本特开2010-528627号公报）中，公开了在酵母等中插入 有将醛转换为烷烃的基因的重组酵母、以及利用该重组酵母的烷烃的制造方法。进而，在专 利文献3(日本特表2011-520455号公报）中，公开了来源于细长聚球藻（Synechococcus elongatus)的烷烃合成酶基因、醛合成酶基因，并公开了利用它们来制造烷烃、醛的方 法。进而另外，在专利文献4(日本特开平09-322780号公报）中，公开了来源于拟南芥 (Arabidopsis thaliana)的编码参与脂肪醛脱羧酶活性的蛋白质的基因，并公开了利用该 基因而显示改变的表皮蜡组成的转化植物。
[0004] 进而，在非专利文献 1 (Process Biochemistry, 41，（2006)，ρ· 1001-1014)中， 关于微生物中的烃合成途径进行了记载。另外，在非专利文献2(Appl. Microbiol. Biotechnol.，（2005)，66:p. 486-496)中，与专利文献1同样地关于藻类的一种布朗葡萄藻 (Botryococcus braunii)中的经的生物合成进行了记载。并且，在专利文献3(Proc. Natl. Acad. Sci.，（1994)，Vol. 91，p. 10000-10004)中，公开了一种来源于家蝇的、将醛转换为烃 ((Z)-9-二十三烯）的细胞色素 P450基因。
[0005] 然而，在非专利文献1中公开的微生物、在非专利文献3中公开的家蝇由于烷烃 生产量低而无法期待在实用水平中的应用。另外，在非专利文献2、专利文献1中公开的藻 类，烷烃生成反应的速度缓慢，而且在细胞内蓄积烷烃。因此，即使利用在非专利文献2、专 利文献1中公开的藻类，也会存在生产烷烃需要长时间、并且需要从细胞内纯化烷烃的工 序，因而不能以低成本合成烷烃这样的的问题。进而，即使利用了在专利文献4中公开的基 因而制作重组体，也没有能合成烷烃的实例，由于需要未知的基因等其他因子，因此无法实 用。另外，还存在即使将来源于植物的基因用于微生物也很可能无法充分发挥功能这样的 问题。另外，即使利用在专利文献3中公开的来源于蓝藻的烷烃合成酶基因，烷烃合成的生 产性也低，实用性非常低。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献 1 :W02006/109558
[0009] 专利文献2 :日本特开2010-528627号公报
[0010] 专利文献3 :日本特表2011-520455号公报
[0011] 专利文献4 :日本特开平09-322780号公报
[0012] 非专利文献
[0013] 非专利文献 1 :Process Biochemistry, 41，（2006)，ρ· 1001-1014
[0014] 非专利文献 2 :Appl. Microbiol. Biotechnol.，（2005)，66: ρ· 486-496
[0015] 非专利文献 3 :Proc. Natl. Acad. Sci·，（1994)，Vol. 91，ρ· 10000-10004
【发明内容】
[0016] 发明要解决的课题
[0017] 于是，鉴于上述实际情况，本发明的目的在于，提供具有烷烃等烃合成能力优异的 新功能的烃合成酶基因及其利用。
[0018] 用于解决课题的方法
[0019] 为了达到上述目的，本
【发明者】们进行了深入研究，结果发现，具有规定的基序序列 的一组蛋白质的由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性优异，并发现，可以将编码该 蛋白质的基因在烃合成中利用，从而完成了本发明。
[0020] (1)基因，编码包含具有序列号1所示的基序序列的氨基酸序列、且具有由醛化合 物合成碳原子数少一个的烃的活性的蛋白质。
[0021] (2)根据（1)所述的基因，其特征在于，所述蛋白质在所述序列号1所示的基序序 列的C末端侧进一步具有序列号2所不的基序序列。
[0022] (3)根据⑴所述的基因，，其特征在于，所述蛋白质是下述（a)?⑷的任一种：
[0023] (a)包含序列号3?32和65?170中任一偶数号所记载的氨基酸序列的蛋白质，
[0024] (b)包含在序列号3?32和65?170中任一偶数号所记载的氨基酸序列中替换、 缺失、插入或添加了 1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有由醛化合物合成碳原子数少 一个的烃的活性的蛋白质，
[0025] (c)包含与序列号3?32和65?170中任一偶数号所记载的氨基酸序列具有 70%以上的同一性的氨基酸序列、且具有由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性的蛋 白质，
[0026] (d)由与包含序列号3?32和65?170中任一奇数号所记载的碱基序列的互补 链的多核苷酸的至少一部分在严格条件下杂交的多核苷酸编码、且具有由醛化合物合成碳 原子数少一个的烃的活性的蛋白质。
[0027] (4)根据⑶所述的基因，其特征在于，所述序列号3?32和65?170中任一偶 数号是序列号6或12,所述序列号3?32和65?170中任一奇数号是序列号5或11。
[0028] (5)根据（1)所述的基因，其特征在于，来源于克雷伯氏菌属的微生物或来源于大 肠杆菌。
[0029] (6)表达载体，具有上述⑴?（5)的任一项所述的基因。
[0030] (7)转化体，是导入上述⑴?（5)的任一项所述的基因而形成的。
[0031] (8)根据（7)所述的转化体，其特征在于，以大肠杆菌或酵母为宿主。
[0032] (9)蛋白质，由上述⑴?（5)的任一项所述的基因编码。
[0033] (10)烃的制造方法，使由上述⑴?（5)的任一项所述的基因编码的蛋白质、参与 所述蛋白质的由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性的辅酶、与成为所述蛋白质的所 述活性的底物的醛化合物共存，由该醛化合物合成碳原子数少一个的烃。
[0034] (11)根据（10)所述的烃的制造方法，其特征在于，通过将导入上述⑴?（5)的 任一项所述的基因而形成的转化体在包含所述醛化合物的溶液中培养，从而使所述蛋白 质、所述辅酶与所述醛化合物共存。
[0035] (12)根据（10)所述的烃的制造方法，其特征在于，通过将从导入上述⑴?（5) 的任一项所述的基因而形成的转化体提取到的酶液与包含所述醛化合物的溶液混合，从而 使所述蛋白质、所述辅酶与所述醛化合物共存。
[0036] (13)根据（10)所述的烃的制造方法，其特征在于，通过将从导入上述⑴?（5) 的任一项所述的基因而形成的转化体中分离到的所述蛋白质与包含所述醛化合物和所述 辅酶的溶液混合，从而使所述蛋白质、所述辅酶与所述醛化合物共存。
[0037] (14)根据（10)所述的烃的制造方法，其特征在于，所述醛化合物是碳原子数为 11?21的醛化合物。
[0038] (15)根据（10)所述的烃的制造方法，其特征在于，所述辅酶是还原型烟酰胺腺嘌 呤二核苷酸即NADH。
[0039] 本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2012-040141号的说明 书和/或附图中记载的内容。
[0040] 发明的效果
[0041] 根据本发明，能够提供与现有公知的醛脱羧酶基因相比，将醛化合物转换为碳原 子数少一个的烃的活性优异的烃合成酶基因。通过利用本发明的烃合成酶基因，能够以醛 化合物作为底物，高效率且低成本地制造烃。
【专利附图】
【附图说明】
[0042] 图1是显不对于来源于克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.)的10种基因制作成的转 化体的"由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性"的测定结果的特性图。
[0043] 图2是对于载体对照株与gene02导入株的GC/MS分析图。
[0044] 图3是显示对于大肠杆菌（E. coli)W3110株的5种基因制作成的转化体的"由醛 化合物合成碳原子数少一个的烃的活性"的测定结果的特性图。
[0045] 图4是显示利用导入了来源于克雷伯氏菌属的gene02的转化体的破碎液上清、以 各种醛化合物为底物的"由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性"的测定结果的特性 图。
[0046] 图5是对于载体对照株和gene02导入株，以碳原子数为14的醛化合物为底物来 测定碳原子数13的烷烃的GC/MS分析图。
[0047] 图6是显示转化大肠杆菌的破碎液、纯化后的His-tag蛋白质溶液的SDS-PAGE结 果的照片。
[0048] 图7是显示利用纯化后的His-tag蛋白质的体外（in vitro)烧经合成的结果的 GC/MS分析图。
[0049] 图8是显示使用NADH或NADPH作为辅酶时的烷烃合成能力的比较结果的特性图。
[0050] 图9是对于导入了 gene02基因的转化酵母的GC/MS分析图。
[0051] 图10-1是显示对于来源于各种生物种的53种基因制作成的转化体的"由醛化合 物合成碳原子数少一个的烃的活性"的测定结果的特性图。
[0052] 图10-2是显示对于来源于各种生物种的53种基因制作成的转化体的"由醛化合 物合成碳原子数少一个的烃的活性"的测定结果的特性图。
【具体实施方式】
[0053] 以下，利用附图和实施例更详细地说明本发明。
[0054] 本发明的烃合成基因，是编码包含具有序列号1所示的基序序列的氨基酸序列、 且具有"由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性（以下将本活性称为烃合成活性）"的 蛋白质的基因。烃合成活性，是能够由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的酶活性，可以换 句话说成从醛化合物中去除羰基的酶活性。此时，烃合成活性中也可以包含作为副生成物 而生成一氧化碳、二氧化碳、碳酸、甲酸以及水等的反应。
[0055] 在此，序列号1所示的基序序列是被称为醛脱氢酶的谷氨酸活性部位（描述： Aldehyde dehydrogenases glutamic acid active site)的序列。在序列号 1 所不的氨基 酸序列中，第1个Xaa是氨基酸的单字母符号为L、I、V、M、F、G或A的任一种。另外，在序 列号1所示的氨基酸序列中，第3个Xaa是氨基酸的单字母符号为L、I、M、S、T、A或C的任 一种。进而，在序列号1所示的氨基酸序列中，第4个Xaa是氨基酸的单字母符号为G或S 的任一种。进而另外，在序列号1所示的氨基酸序列中，第6个Xaa是氨基酸的单字母符号 为K、N、L或Μ的任一种。进而另外，在序列号1所示的氨基酸序列中，第7个Xaa是氨基 酸的单字母符号为S、A、D或N的任一种。进而另外，在序列号1所示的氨基酸序列中，第8 个Xaa是氨基酸的单字母符号为T、A、P、F或V的任一种。
[0056] 特别是本发明的烃合成基因优选为编码包含在序列号1所示的基序序列的C末 端侧进一步具有序列号2所示的基序序列的氨基酸序列、且具有烃合成活性的蛋白质的基 因。在此，序列号2所示的基序序列，对应于下述氨基酸序列：在对于由作为本发明的烃合 成基因的来源于克雷伯氏菌属微生物的基因所编码的多种蛋白质，将它们的氨基酸序列进 行多重比对分析时，高度保守的区域的氨基酸序列。在序列号2所示的氨基酸序列中，第1 个Xaa是氨基酸的单字母符号为P、A或F的任一种。另外，在序列号2所示的氨基酸序列 中，第2个Xaa是氨基酸的单字母符号为F、H或V的任一种。进而，在序列号2所示的氨基 酸序列中，第3个Xaa是氨基酸的单字母符号为G或A的任一种。在序列号2所示的氨基 酸序列中，第5个Xaa可以是任意氨基酸。进而另外，在序列号2所示的氨基酸序列中，第 6个Xaa是氨基酸的单字母符号为K、G或R的任一种。进而另外，在序列号2所示的氨基 酸序列中，第7个Xaa可以是任意氨基酸。进而另外，在序列号2所示的氨基酸序列中，第 10个Xaa可以是任意氨基酸。进而另外，在序列号2所示的氨基酸序列中，第11个Xaa是 氨基酸的单字母符号是G或Η的任一种。进而另外，在序列号2所示的氨基酸序列中，第12 个Xaa是氨基酸的单字母符号为R、Κ或G的任一种。进而另外，在序列号2所示的氨基酸 序列中，第13个Xaa是氨基酸的单字母符号为F、D、P或A的任一种。
[0057] 进而，作为本发明的烃合成基因，可以是来源于任何生物的基因，例如，可以 从革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌、植物、动物中确定、分离本发明的烃合成基 因。例如，作为革兰氏阴性细菌，可以举出大肠杆菌（Escherichia coli)、恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)。作为革兰氏阳性细菌，可以举出枯草杆菌（Bacillus subtilis)、 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)。另外，作为真菌，可以举出酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、热带假丝酵 母（Candida tropicalis)、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii)、毕赤酵母（Pichia pastoris)、米曲霉（Aspergillus oryzae)。进而，作为植物，可以举出玉米（Zea mays)、 拟南芥（Arabidopsis thaliana)。进而另外，作为动物，可以举出黑腹果蝇（Drosophila melanogaster)、褐鼠 （Rattus norvegicus)、人（Homo sapiens)。可以从各种生物中分离 本发明的烃合成基因而适当使用。
[0058] 更具体而言，上述的编码具有序列号1所示的基序序列的蛋白质的醛脱氢酶基 因，可以由NCBI(美国国家生物技术信息中心，National Center for Biotechnology Information)这样的收纳基因信息的数据库中检索。检索的基因可以通过ACCESSION号如 下特定。
[0059] 即，作为来源于大肠杆菌（Escherichia coli)K_12W3110的基因，可以将 BAE77705、BAA35791、BAA14869、BAA14992、BAA15032、BAA16524、BAE77705、BAA15538 和 BAA15073确定为本发明的经合成基因。另外，作为来源于恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)_Fl 的基因，可以将 YP_001268218、YP_001265586、YP_001267408、YP_001267629、 ΥΡ_001266090, ΥΡ_001270490, ΥΡ_001268439, ΥΡ_001267367, ΥΡ_001267724, ΥΡ_001269548、 ΥΡ_001268395、 ΥΡ_001265936、 ΥΡ_001270470、 ΥΡ_001266779 和 ΥΡ_001270298确定为本发明的烃合成基因。
[0060] 另夕卜，作为来源于枯草杆菌（Bacillus subtilis) 168株的基因，可以将 NP_388129、NP_389813、NP_390984、NP_388203、NP_388616、NP_391658、NP_391762、 NP_391865和NP_391675确定为本发明的烃合成基因。作为来源于谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)ATCC13032 的基因，可以将 NP_599351、NP_599725、 NP_601988、NP_599302、NP_601867和NP_601908确定为本发明的烃合成基因。作为来源于 罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)DSM20016的基因，可以将YP_001270647确定为本 发明的烃合成基因。
[0061] 进而，作为来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的基因，可以将 NP_010996、NP_011904、NP_015264、NP_013828、NP_009560、NP_015019、NP_013893、 NP_013892和NP_011902确定为本发明的烃合成基因。作为来源于热带假丝酵母（Candida tropicalis)MYA-3404 的基因，可以将XP_002548035、XP_002545751、XP_002547036、 XP_002547030、XP_002550712、XP_002547024、XP_002550173、XP_002546610 和 XP_002550289确定为本发明的经合成基因。作为来源于汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii)CBS767 的基因，可以将 XP_460395、XP_457244、XP_457404、XP_457750、 XP_461954、XP_462433、XP_461708和XP_462528确定为本发明的烃合成基因。作为来 源于毕赤酵母（Pichia pastoris)GS115 的基因，可以将 XP_002489360、XP_002493450、 XP_002491418、XP_002493229、XP_002490175、XP_002491360 和 XP_002491779 确定为本 发明的经合成基因。作为来源于粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)的基因，可 以将NP_593172、NP_593499、NP_594582确定为本发明的烃合成基因。作为来源于米曲霉 (Aspergillus oryzae)RIB40 的基因，可以将XP_001822148、XP_001821214、XP_001826612、 XP_001817160, XP_001817372, XP_001727 192, XP_00182664U XP_00182750U XP_001825957, XP_001822309, XP_001727308, XP_001818713, XP_001819060, XP_001823047、XP_001817717和XP_001821011确定为本发明的烃合成基因。
[0062] 进而另夕卜，作为来源于玉米（Zea mays)的基因，可以将NP_001150417、 ΝΡ_001105047, ΝΡ_001147173, NP_001169123, NP_00110578U NP_001157807, NP_001157804、 NP_001105891、 NP_001105046、 NP_001105576、 NP_001105589、 NP_001168661、NP_001149126和NP_001148092确定为本发明的烃合成基因。作为来源于 拟南芥（Arabidopsis thaliana)的基因，可以将 NP_564204、NP_001185399、NP_178062、 NP_001189589、NP_566749、NP_190383、NP_187321、NP_190400、NP_001077676 和 NP_175812 确定为本发明的烃合成基因。
[0063] 进而另外，作为来源于黑腹果蝇（Drosophila melanogaster)的基因，可以将 NP_733183、NP_609285、NP_001014665、NP_649099、NP_001189159、NP_610285 和 NP_610107 确定为本发明的经合成基因。作为来源于褐鼠 （Rattus norvegicus)的基因，可以将 NP_001006999、XP_001067816、XP_001068348、XP_001068253、NP_113919、XP_001062926、 NP_071609、 NP_071852、 NP_058968、 NP_001011975、 NP_115792、 NP_001178017、 NP_001178707、NP_446348、NP_071992、XP_001059375、XP_001061872 和 NP_001128170 确 定为本发明的经合成基因。作为来源于人（Homo sapiens)的基因，可以将NP_036322、 ΝΡ_001193826、ΝΡ_001029345、ΝΡ_000684、ΝΡ_000680、ΝΡ_000683、ΝΡ_000681、ΝΡ_001071、 NP_000687、NP_001180409、NP_001173、NP_000682、NP_000373、NP_001154976、NP_000685 和NP_000686确定为本发明的烃合成基因。
[0064] 另一方面，对于上述的编码具有序列号1所示的基序序列的蛋白质的基因，可以 将没有在NCBI这样的数据库中注册的基因组序列未知的生物的基因组序列弄清楚，基于 基因组序列信息来特定。更具体而言，可以按照常规方法对克雷伯氏菌属（Klebsiella sp. )NBRC100048株的基因组序列进行分析，基于该基因组序列信息来特定编码具有序列号 1所不的基序序列的蛋白质的基因。
[0065] 作为本发明的烃合成基因的来源于克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.)的基因，可以 特定10种基因。将这10种基因方便地命名为geneOl?genelO。将这些geneOl?10中 的编码区的碱基序列以及由其编码的氨基酸序列总结于下述表1。
[0066] 表 1
【权利要求】
1. 基因，编码包含具有序列号1所示的基序序列的氨基酸序列、且具有由醛化合物合 成碳原子数少一个的烃的活性的蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述蛋白质在所述序列号1所示的基序序 列的C末端侧进一步具有序列号2所不的基序序列。
3. 根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述蛋白质是下述（a)?（d)的任一种： (a) 包含序列号3?32和65?170中任一偶数号所记载的氨基酸序列的蛋白质， (b) 包含在序列号3?32和65?170中任一偶数号所记载的氨基酸序列中替换、缺失、 插入或添加了 1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有由醛化合物合成碳原子数少一个的 烃的活性的蛋白质， (c) 包含与序列号3?32和65?170中任一偶数号所记载的氨基酸序列具有70%以 上的同一性的氨基酸序列、且具有由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性的蛋白质， (d) 由与包含序列号3?32和65?170中任一奇数号所记载的碱基序列的互补链的 多核苷酸的至少一部分在严格条件下杂交的多核苷酸编码、且具有由醛化合物合成碳原子 数少一个的烃的活性的蛋白质。
4. 根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述序列号3?32和65?170中任一偶 数号是序列号6或12,所述序列号3?32和65?170中任一奇数号是序列号5或11。
5. 根据权利要求1所述的基因，其特征在于，来源于克雷伯氏菌属的微生物或来源于 大肠杆菌。
6. 表达载体，具有权利要求1?5的任一项所述的基因。
7. 转化体，是导入权利要求1?5的任一项所述的基因而形成的。
8. 根据权利要求7所述的转化体，其特征在于，以大肠杆菌或酵母为宿主。
9. 蛋白质，由权利要求1?5的任一项所述的基因编码。
10. 烃的制造方法，使由权利要求1?5的任一项所述的基因编码的蛋白质、参与所述 蛋白质的由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性的辅酶、与成为所述蛋白质的所述活 性的底物的醛化合物共存，由该醛化合物合成碳原子数少一个的烃。
11. 根据权利要求10所述的烃的制造方法，其特征在于，通过将导入权利要求1?5 的任一项所述的基因而形成的转化体在包含所述醛化合物的溶液中培养，从而使所述蛋白 质、所述辅酶与所述醛化合物共存。
12. 根据权利要求10所述的烃的制造方法，其特征在于，通过将从导入权利要求1?5 的任一项所述的基因而形成的转化体提取到的酶液与包含所述醛化合物的溶液混合，从而 使所述蛋白质、所述辅酶与所述醛化合物共存。
13. 根据权利要求10所述的烃的制造方法，其特征在于，通过将从导入权利要求1? 5的任一项所述的基因而形成的转化体中分离到的所述蛋白质与包含所述醛化合物和所述 辅酶的溶液混合，从而使所述蛋白质、所述辅酶与所述醛化合物共存。
14. 根据权利要求10所述的烃的制造方法，其特征在于，所述醛化合物是碳原子数为 11?21的醛化合物。
15. 根据权利要求10所述的烃的制造方法，其特征在于，所述辅酶是还原型烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸即NADH。
【文档编号】C12N1/21GK104093836SQ201380008257
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2013年2月26日 优先权日:2012年2月27日
【发明者】村松正善, 伊藤正和 申请人:丰田自动车株式会社