先进的发酵控制的制作方法
【专利摘要】本发明披露了在补料-分批或连续发酵培养基中，控制向发酵培养基增碳的速率的方法，该方法包括：测量转化为二氧化碳的C-摩尔损失；测量经由增碳而添加的C-摩尔数；计算二氧化碳补料系数FQ，为经一个时段，产生的C-摩尔二氧化碳除以添加的C-摩尔碳；以及根据感兴趣的FQ，调节增碳的速率，或者测量耗氧的摩尔数；测量经由增碳而添加的C-摩尔数；计算氧补料系数OQ，为经一个时段，消耗的氧摩尔数除以添加的C-摩尔碳；以及根据感兴趣的OQ，调节增碳的速率，其中所述发酵培养基包含生产感兴趣的化合物的微生物，或者其中所述发酵培养基包含生产感兴趣的微生物的微生物。
【专利说明】先进的发酵控制
【技术领域】
[0001] 本发明涉控制向发酵培养基增碳的速率的方法，其中该发酵培养基包含生产感兴 趣的化合物的微生物，或者该发酵培养基包含生产感兴趣的微生物的微生物。
【背景技术】
[0002] 细菌微生物和真菌微生物是工业微生物学的主力，因为它们用于许多不同治疗剂 (例如青霉素和头孢菌素）、药物蛋白（例如胰岛素）、多糖类（例如透明质酸）、酶（例如 蛋白酶）、以及大宗化学品（例如柠檬酸）的商业化生产。
[0003] 在工业上，使用补料-分批发酵方法特别经常的。补料-分批发酵方法是基于将 生长限制营养底物进料至培养物的方法。生长限制营养底物典型地是碳水化合物。
[0004] 为了控制分批培养方法中的生长，已经使用了不同策略。控制参数（例如DOT(溶 解氧张力）、和pH(pHstat))是正常紧密跟踪的。
[0005] 补料-分批发酵（其中微生物生产感兴趣的化合物或微生物生产感兴趣的微生 物）中的增碳速率是极其关键的工艺参数。已经示出，由于例如溢出代谢和产生副产品，碳 水化合物的过度补料导致多个批次的损失或严重降低的生产力。
[0006] 本发明呈现了用于监测和控制发酵培养基中微生物碳利用效率并且由此避免过 度补料的方法。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明披露了在补料-分批或连续发酵培养基中，控制向发酵培养基增碳的速率 的方法，该方法包括
[0009] 测量转化为二氧化碳的C-摩尔损失；
[0010] 测量经由增碳而添加的C-摩尔数；
[0011] 计算二氧化碳补料系数，FQ，为经一个时段，产生的C-摩尔二氧化碳除以添加的 C-摩尔碳；以及
[0012] 根据感兴趣的FQ，调节增碳的速率，或者
[0013] 测量耗氧的摩尔数；
[0014] 测量经由增碳而添加的C-摩尔数；
[0015] 计算氧补料系数，0Q，为经一个时段，消耗的氧摩尔数除以添加的C-摩尔碳；以及
[0016] 根据感兴趣的0Q，调节增碳的速率，
[0017] 其中所述发酵培养基包含生产感兴趣的化合物的微生物，或者其中所述发酵培养 基包含生产感兴趣的微生物的微生物。
[0018] 附图简要说明
[0019] 通过参考附图进一步说明本发明，其中
[0020] 图1示出了批次X、批次Y和批次Z中归一化的酶浓度，其中批次X是标准发酵 (DOT控制），批次Y是使用FQ控制的发酵，并且批次Z是使用0Q控制的发酵。
[0021] 图2示出了批次X、批次Y和批次Z中归一化的生物质浓度。
[0022] 图3示出了批次X (DOT控制）和批次Y (FQ控制）中的FQ方法值。
[0023] 图4示出了批次X (DOT对照）和批次Z (0Q对照）中的0Q方法值。
[0024] 图5示出了批次X、批次Y和批次Z中营养补料速率。
[0025] 图6示出了批次X的溶解氧，以及批次X的DOT设定点（=20% )。
[0026] 图7示出了根据实例2测量的0Q。0Q设定点是0.3。
[0027] 图8示出了根据实例2,由0Q控制器调节的葡萄糖补料速率。
[0028] 图9示出了根据实例3测量的0Q。0Q设定点从在Oh的0. 45上升至在70h的0. 6。
[0029] 图10示出根据实例3, 0Q控制的乳糖补料速率。
[0030] 图11示出了根据实例3,具有在71 h的指数100的测量的酶浓度。
[0031] 发明的详细披露
[0032] 本领域已知例如芽孢杆属菌补料-分批发酵中的碳水化合物添加速率是极其关 键的工艺参数。已经示出，底物的过度补料导致多个批次的损失或降低的碳利用效率。
[0033] 本发明呈现了用于监测和控制发酵过程中微生物碳利用效率的方法，由此它可能 优化该方法而没有过度补料的风险。具体地，本发明呈现了用于监测和控制有氧并且限制 碳的发酵中微生物碳利用效率的方法，由此它可能优化该方法而没有过度补料的风险。
[0034] 微牛物
[0035] 生产或表达根据本发明的感兴趣的化合物的微生物可以是本领域已知的任何可 在发酵罐中培养的微生物。
[0036] 根据本发明的微生物可以是细菌株系，例如，革兰氏阳性株系，例如芽孢杆菌属 (Bacillus)、梭状芽孢杆菌属（Clostridium)、肠球菌属（Enterococcus)、土芽孢杆菌属 (Geobacillus)、乳酸杆菌属（Lactobacillus)、乳球菌属（Lactococcus)、大洋芽抱杆菌 属（Oceanobacillus)、葡萄球菌属（Staphylococcus)、链球菌属（Streptococcus)或链 霉菌属（Streptomyces)株系，或革兰氏阴性株系，例如弯曲杆菌属（Campylobacter)、埃 希氏菌属（Escherichia)、黄质菌属属（Flavobacterium)、梭杆菌属（Fusobacterium)、螺 杆菌属（Helicobacter)、泥杆菌属（Ilyobacter)、奈瑟氏菌属（Neisseria)、假单胞菌属 (Pseudomonas)、沙门氏菌属（Salmonella)，或脈原体属（Ureaplasma)株系。
[0037] 在一方面，该株系是嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆 菌（Bacillus amyloliquefaciens)、短芽抱杆菌（Bacillus brevis)、环状芽抱杆菌 (Bacillus circulans)、克劳氏芽抱杆菌（Bacillus clausii)、凝结芽抱杆菌（Bacillus coagulans)、坚硬芽抱杆菌（Bacillus firmus)、灿烂芽抱杆菌（Bacillus lautus)、迟 缓芽抱杆菌（Bacillus lentus)、地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)、巨大芽抱 杆菌（Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆 菌（Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)、或苏云金 芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)株系；具体地，该株系是地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)株系。
[0038] 在另一方面，该株系是似马链球菌（Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌（Streptococcus uberis)、或马链球菌马亚种 (Streptococcus equi)株系。
[0039] 在另一方面，该株系是不产色链霉菌（Streptomyces achromogenes)、阿维链霉菌 (Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌 (Streptomyces griseus)或变铅青链霉菌（Streptomyces lividans)株系。
[0040] 该微生物可以是真菌株系。例如，该株系可以是酵母株系，例如假丝酵母 属（Candida)、克鲁维酵母属（Kluyveromyces)、毕赤酵母属（Pichia)、酵母菌属 (Saccharomyces)、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属（Yarrowia) 株系；或丝状真菌株系，例如枝顶孢霉属（Acremonium)、伞菌属（Agaricus)、链格孢 属（Alternaria)、曲霉属（Aspergillus)、短梗霉属（Aureobasidium)、葡萄座腔菌 属（Botryospaeria)、拟錯菌属（Ceriporiopsis)、毛 _ 壳属（Chaetomidium)、金抱 子菌属（Chrysosporium)、麦角菌属（Claviceps)、旋孢腔菌属（Cochliobolus)、鬼伞 属（Coprinopsis)、乳白蚁属（Coptotermes)、棒囊壳属（Corynascus)、隐丛赤壳菌属 (Cryphonectria)、隐球菌属（Cryptococcus)、色二抱属（Diplodia)、黑耳属（Exidia)、 线黑粉酵母属（Filibasidium)、镰刀菌属（Fusarium)、赤霉属（Gibberella)、全鞭毛虫 属（Holomastigotoides)、腐质霉属（Humicola)、耙齿菌属（Irpex)、蘑燕属（Lentinula)、 小腔球菌属（Leptospaeria)、梨抱菌属（Magnaporthe)、黑果菌属（Melanocarpus)、 多孔菌属（Meripilus)、毛霉属（Mucor)、毁丝霉属（Myceliophthora)、新美鞭菌 属（Neocallimastix)、脉抱菌属（Neurospora)、拟青霉属（Paecilomyces)、青霉菌 属（Penicillium)、平革菌属（Phanerochaete)、瘤胃壶菌属（Piromyces)、某真菌属 (Poitrasia)、假黑盘菌属（Pseudoplectania)、假披发虫属（Pseudotrichonympha)、 根毛霉菌属（Rhizomucor)、裂糟菌属（Schizophyllum)、柱顶孢属（Scytalidium)、踝 节菌属（Talaromyces)、嗜热子囊菌属（Thermoascus)、梭孢壳霉属（Thielavia)、弯颈 霉属（Tolypocladium)、木霉属（Trichoderma)、长毛盘菌属（Trichophaea)、轮枝孢属 (Verticillium)、小包脚燕属（Volvariella)或炭角菌属（Xylaria)株系。
[0041] 在另一方面，该株系是解纤维枝顶孢霉（Acremonium cellulolyticus)、 棘抱曲霉（Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori)、臭曲霉 (Aspergillus foetidus)、烟曲霉（Aspergillus fumigatus)、日本曲霉（Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米 曲霉（Aspergillus oryzae)、狭边金孢子菌（Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子 菌(Chrysosporium keratinophilum)、 Chrysosporium lucknowense、 Chrysosporium merdarium、租金抱子菌（Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicumΛ 热带金抱子菌（Chrysosporium tropicum)、带纹金抱子菌（Chrysosporium zonatum)、 杆抱状嫌抱（Fusarium bactridioides)、谷类嫌抱（Fusarium cerealis)、库威嫌 抱（Fusarium crookwellense)、大刀嫌抱（Fusarium culmorum)、禾谷嫌抱（Fusarium graminearum)、禾赤嫌抱（Fusarium graminum)、异抱嫌抱（Fusarium heterosporum)、 合欢木嫌抱（Fusarium negundi)、尖嫌抱（Fusarium oxysporum)、多枝嫌抱（Fusarium reticulatum)、粉红嫌抱（Fusarium roseum)、接骨木嫌抱（Fusarium sambucinum)、肤 色嫌抱（Fusarium sarcochroum)、拟分枝抱嫌抱（Fusarium sporotrichioides)、硫色 嫌抱（Fusarium sulphureum)、圆嫌抱（Fusarium torulosum)、拟丝抱嫌抱（Fusarium trichothecioides)、壤片嫌抱（Fusarium venenatum)、灰腐质霉（Humicola grisea)、特 异腐质霉（Humicola insolens)、疏棉状腐质霉（Humicola lanuginosa)、白耙齿菌（Irpex lacteus)、米黑毛霉（Mucor miehei)、嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila)、粗 糖链抱菌（Neurospora crassa)、绳状青霉菌（Penicillium funiculosum)、产紫青霉菌 (Penicillium purpurogenum)、黄抱原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium)、无色 梭抱壳霉（Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、白毛梭抱壳霉（Thielavia albopilosa)、澳洲梭抱壳霉（Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小抱梭抱 壳霉（Thielavia microspora)、卵抱梭抱壳霉（Thielavia ovispora)、秘鲁梭抱壳霉 (Thielavia peruviana)、毛梭抱壳霉（Thielavia setosa)、瘤抱梭抱壳霉（Thielavia spededonium)、耐热梭抱壳（Thielavia subthermophila)、土生梭抱壳霉（Thielavia terrestris)、哈茨木霉（Trichoderma harzianum)、康宁木霉（Trichoderma koningii)、长 枝木霉（Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉（Trichoderma reesei)、或绿色木霉 (Trichoderma viride)株系。
[0042] 在另一方面，该株系是酵母株系，例如卡氏酵母（Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母（Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母（Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母（Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母（Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母（Saccharomyces oviformis)株系。
[0043] 这些物种的株系可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国 典型培养物保藏中心（ATCC)、德国微生物菌种保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心（Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心 (NRRL)〇
[0044] 牛产感兴趣的微牛物的微牛物
[0045] 发酵产物可以是微生物，例如感兴趣的微生物可以是酵母或细菌株系，具体地，是 酵母菌属株系或芽胞杆菌属株系或芽胞杆菌芽孢。
[0046] 感兴趣的化合物
[0047] 根据本发明，感兴趣的化合物可以是抗生素，例如青霉素或头孢菌素或红霉素，或 大宗化学品，例如柠檬酸。
[0048] 感兴趣的化合物还可以是多糖，例如透明质酸，或治疗性多肽，例如胰岛素，或肽， 或蛋白质，例如酶。
[0049] 根据本发明，优选的肽包含2至100个氨基酸；优选是从10至80个氨基酸；更优 选是从15至60个氨基酸；甚至更优选是从15至40个氨基酸。
[0050] 在一个优选实施例中，感兴趣的化合物是酶，具体地是水解酶（根据Enzyme Nomenclature (酶命名法）；Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry(国际生物化学联合会命名委员会的建议）为EC3 类）。
[0051] 在一个具体的优选实施例中，以下水解酶是优选的：
[0052] 蛋白酶：话合的蛋白酶包括动物、棺物或微牛物来源的那优选微生物来源。包 括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。蛋白酶可以是酸性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或金属蛋 白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶， 特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯 草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(在W0 89/06279中描 述）。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶（例如，猪或牛起源的）以及在W0 89/06270和 TO 94/25583中描述的镰孢霉属蛋白酶。
[0053] 有用的蛋白酶的实例是如 W0 92/19729, W0 98/20115, W0 98/20116 和 W0 98/34946所描述的变体，特别是在一个或多个下述位置发生取代的变体：27、36、57、76、 87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及 274。
[0054] 优选的可商购获得的蛋白酶包括：ALCALASE?、SAVINASE?、PRIMASE?、DURALASE?、 ESPERASE?、RELASE?、以及 KANNASE?(诺维信公司（Novozymes A/S))，MAXATASE?、 MAXACAL?、MAXAPEM?、PROPERASEtm、PURAFECT tm、PURAFECT 0XP?、FN2?、以及 FN3? (杰能科国 际有限公司(Genencor International Inc·))。
[0055] 搬肢蓮：适合的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白 工程化的突变体。有用脂肪酶的实例包括来自腐质霉属（Humicola)(与嗜热丝孢菌 属（Thermomyces)同义），例如来自如EP 258 068和EP 305 216描述的疏棉状腐质霉 (H. lanuginosa)(细毛嗜热霉（T.lanuginosus))或来自如W0 96/13580中描述的特异 腐质霉（H.insolens)的脂肪酶；假单胞菌属（Pseudomonas)脂肪酶，例如来自产碱假 单胞菌（P.alcaligenes)或类产喊假单胞菌（P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋 葱假单胞菌（P. cepacia) (EP 331 376)、施氏假单胞菌（P.stutzeri)(GB 1,372,034)、 萤光假单胞菌（P.fluorescens)、假单胞菌属物种株系SD 705 (Pseudomonas sp. strain SD 705) (W0 95/06720 和 W0 96/27002)、威斯康星假单胞菌（P. wisconsinensis) (TO 96/12012);芽孢杆菌属（Bacillus)脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌（B.subtilis)(达图 瓦（Dartois)等人，1993,生物化学与生物物理学报（Biochemica et Biophysica Acta), 1131:253-360)，嗜热脂肪芽抱杆菌（B.stearothermophilus)(JP 64/744992)或短小芽孢 杆菌（B. pumilus) (W0 91/16422)。
[0056] 脂肪酶变体的其他实例如在 W0 92/05249、W0 94/01541、EP 407 225、EP 260 105,W0 95/3538UW0 96/00292,W0 95/30744,W0 94/25578,W0 95/14783,W0 95/22615, W0 97/04079以及W0 97/07202中描述的那些。
[0057] 优选的可商购获得的脂肪酶包括：LIP0LASE?和LIP0LASE ULTRA?和LIPEX?(诺 维信公司（Novozymes A/S))。
[0058] 淀粉酶：适合的淀粉酶(α -和/或β -淀粉酶）包括来源于细菌或真菌的那些。 包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。淀粉酶包括例如得自芽孢杆菌属（Bacillus)的 α -淀粉酶，例如GB 1，296, 839中更详细描述的地衣芽孢杆菌（B. licheniformis)具体株 系的α-淀粉酶。
[0059] 有用的淀粉酶的实例是描述于 W0 94/02597、W0 94/18314、W0 96/23873、W0 97/43424、以及W0 01/66712中的变体，尤其是在以下一个或多个位置处发生取代的变 体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、 305、391、408、和 444。
[0060] 可商购获得的淀粉酶为 DURAMYL?、TERMAMYL?、FUNGAMYL?、NATALASE?、TERMAMYL LC?、TERMAMYL SC?、LIQUIZYME-X? 以及 BAN?(诺维信公司（Novozymes A/S)) ;RAPIDASE? 和PURASTAR?(来自杰能科国际有限公司）。
[0061] 红盤盡塵：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或 蛋白工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属（Bacillus)、假单胞菌属 (Pseudomonas)、腐质霉属（Humicola)、镰孢霉属（Fusarium)、梭抱壳属（Thielavia)、 顶孢霉属（Acremonium)的纤维素酶，例如从披露于US 4, 435, 307、US 5, 648, 263、US 5,691，178、旧 5,776,757 和恥 89/09259 中的由孤独腐质霉〇11111^(3〇13 1118〇16118)、嗜热 毁丝霉（Myceliphthora thermophila)和尖抱鎌刀菌（Fusarium oxysporum)产生的真菌 纤维素酶。
[0062] 特别适合的纤维素酶是具有颜色保护益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素 酶的实例为在 EP 0 495 257、EP 0 531 372、TO 96/11262、TO 96/29397、TO 98/08940 中描述的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，例如在W0 94/07998、EP 0 531 315、 US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、W0 95/24471、W0 98/12307 以及 PCT/DK 98/00299中描述的那些。
[0063] 可商购获得的纤维素酶包括CELLUZYME?、CAREZYME?、和CAREZYME CORE? (诺 维信公司（Novozymes A/S))、CLAZINASE?和PURADAX HA?(杰能科国际有限公司）、以及 KAC_500(B)?(花王株式会社（Kao Corporation))。
[0064] 支链淀粉酶：支链淀粉酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工 程化的突变体。
[0065] 根据本发明的支链淀粉酶优选是来自火球菌属（Pyrococcus)或芽孢杆菌属 (Bacillus)(例如嗜酸性普鲁兰芽抱杆菌（Bacillus acidopullulyticus))的支链淀 粉酶，例如描述于凯利（Kelly)等人，1994,欧洲微生物学会联合会微生物学快报（FEMS Microbiol. Letters) 115:97-106的支链淀粉酶；或从诺维信公司可得的支链淀粉酶，例如 Promozyme?。
[0066] 支链淀粉酶还可以来自长野芽孢杆菌?acillus naganoencis)或Bacillus deramificans，例如衍生自 Bacillus deramificans (美国专利 5, 736, 375)。
[0067] 氣化还原酶氣化还原酶包括细菌或直菌来源的那包括化学修饰的或蛋白工程 化的突变体。氧化还原酶包括过氧化酶、以及氧化酶，例如漆酶、和过氧化氢酶。
[0068] 其他优选水解酶是碳水化合物水解酶，包括MANNAWAY?。其他优选酶是转移酶、裂 解酶、异构酶、以及连接酶。
[0069] 遞
[0070] 本发明可以按任何规模用于任何补料-分批发酵或连续发酵，其中可能测量气体 组成、气体流量、和碳水化合物流量。
[0071] 因此，本发明可以有用于具有以微规模的培养基的任何发酵，并且直至有用于具 有以工业规模培养基的任何发酵，典型地从1000升至500. 000升。
[0072] 可以通过本领域中任何已知的方法来发酵微生物。发酵培养基可以是复合培养 基，包括复合的氮源和/或碳源，例如大豆粉、大豆蛋白、大豆蛋白水解物、棉籽粉、玉米浆、 酵母提取物、酪蛋白、酪蛋白水解物、马铃薯蛋白、马铃薯蛋白水解物、糖蜜、等。发酵培养基 可以是化学成分确定的培养基，例如在W0 98/37179中所定义的培养基。
[0073] 可以使用碳限制条件来进行发酵。碳限制条件意为通过碳源的添加来控制微生物 的生长。
[0074] 碳源
[0075] 本发明可以有用于任何碳源，其中可能测量可代谢的碳。
[0076] 碳水化合物或碳源选自下组，该组由以下各项组成：葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、 乳糖、麦芽酮糖、甘露糖、甘油，并且半乳糖是优选的；具体地，碳源选自下组，该组由以下各 项组成：葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油，并且麦芽糖是优选的。
[0077] 二氣化碳补料系数（FQ)
[0078] 将利用效率测量为转化为二氧化碳（C02)的C-摩尔损失和经由碳水化合物补料 添加的C-摩尔数之间的系数（命名为二氧化碳补料系数或FQ)，其中
[0079] 1 C-摩尔=摩尔 X Nc，
[0080] 其中Nc是按分子计的碳原子个数，并且"摩尔"是按摩尔计的物质的量。
[0081] 这意味着1摩尔的葡萄糖等于6C-摩尔的葡萄糖。
[0082] 通过使用在发酵罐上的碳平衡，即时监测二氧化碳补料系数（FQ)。经一个限定的 时间间隔，通过在与气流速率的测量组合的有关进气和排气的气体分析器测量损失的C02。
[0083] 经一个限定的时间间隔，通过与关于由例如折射率（RI)测量的碳水化合物类型 和浓度的数据组合的体积进料速率测量以碳水化合物溶液的形式进料至该罐中的C-摩尔 碳水化合物。
[0084] 适合的时段将典型地在从1秒至20分钟，具体地是从1分钟至15分钟的范围内。
[0085] 在此时段，通过转化为C02的C-摩尔损失除以添加的C-摩尔碳水化合物计算FQ。
[0086] 由过程计算机记录FQ，并且与使用者定义的FQ设定点进行比较，由此计算碳水化 合物进料速率的新设定点并且通过使用例如PI控制器进行自动调节。
[0087] 可以通过运行一系列发酵来定义使用者定义的设定点，并且由此发现最佳FQ。最 佳FQ典型地是在FQ彡0. 2时；具体地，在FQ处于从0. 2至0. 75的范围内时；例如在从0. 2 至0. 7的范围内；例如在从0. 25至0. 75的范围内。
[0088] 可以通过在整个发酵期间使用恒定FQ进行发酵；或者它可以渐变。如果它渐变， 那么它可以典型地从约〇. 5的FQ开始，并且以约0. 7的FQ结束。为了促进足够的生长，FQ 可以典型地从低值开始。
[0089] FQ控制器的实现方式是相当简单明了的，并且可以用本领域目前可用的标准仪器 装备各易地完成。
[0090] 本发明的基本假设是，对于每一类型的发酵存在临界FQ值。低于这一临界FQ值， 则发生过度补料，并且相关的溢出代谢开始。
[0091] 因此本发明的想法是，以这样一种方式即时控制碳水化合物进料速率：将FQ维持 在设定点并且高于临界FQ值（例如0. 5)，并且由此自动避免了过度补料，但是同时促进了 必要生长和产物形成。
[0092] 可能在发酵期间避免过度补料：如果FQ低于预先定义的设定点，则发酵超剂量 (没有足够碳转化为C02--一些留下未代谢或转化为溢出代谢物）。随着实施FQ控制器， 低于目前设定点的FQ将自动导致碳水化合物补料速率下降并且因此避免了过度补料。
[0093] 使补料最大化：如果FQ高于预先定义的设定点，则发酵可以处理更多进料并且补 料速率增加。
[0094] 使每个发酵罐的感兴趣的化合物的产率最大化：存在最佳FQ并且本发明允许在 此参数上进行优化。
[0095] 用FQ控制器运行实验已经示出，可能以不同规模使用本发明。
[0096] FQ控制可以与其他标准控制方案（像DOT控制）组合，来确保好氧条件。如果DOT ILFQ是高的，在这种情况下进料速率将只增加，而如果只有DOTiFQ是低的，进料速率将 下降。
[0097] 氣补料系数（0Q)
[0098] 将利用效率测量为摩尔消耗的02和经由糖进料添加的C-摩尔碳之间的系数（命 名为氧补料系数或0Q)。
[0099] 通过使用在发酵罐上的元素平衡，即时监测氧补料系数（0Q)。经一个限定的时间 间隔，与气流速率的测量组合通过气体分析器、作为进气和排气中的含氧量中的差值而测 量消耗的0。
[0100] 经一个限定的时间间隔，通过与关于由例如折射率（RI)测量的碳水化合物类型 和浓度的数据组合的体积进料速率测量以碳水化合物溶液的形式进料至该罐中的C-摩尔 碳水化合物。
[0101] 适合的时段将典型地在从1秒至20分钟，具体地是从1分钟至15分钟的范围内。
[0102] 在此时段，通过消耗的mol 02除以添加的C-摩尔碳水化合物计算0Q。
[0103] 由过程计算机记录0Q，并且与使用者定义的0Q设定点进行比较，由此计算碳水化 合物进料速率的新设定点并且进行自动调节。
[0104] 可以通过运行一系列发酵定义使用者定义的设定点，并且由此发现最佳0Q。最佳 0Q典型地是在0Q彡0. 2时；具体地，在0Q将处于从0. 2至0. 75的范围内时；例如在从0. 2 至0. 7的范围内；例如在从0. 25至0. 75的范围内。
[0105] 可以通过在整个发酵期间使用恒定0Q进行发酵；或者它可以渐变。如果它渐变， 那么它可以典型地从〇. 45的0Q开始，并且以0. 65的0Q结束。
[0106] 0Q控制器的实现方式是相当简单明了的，并且可以用本领域目前可用的标准仪器 装备各易地完成。
[0107] 本发明的基本假设是，对于每一发酵存在临界0Q值。低于这一临界0Q值，微生物 开始变得超剂量。
[0108] 数据表明，具有低于0. 45的0Q值的批次遭受超剂量。因此本发明的想法是，以这 样一种方式即时控制碳水化合物进料速率：将0Q维持在设定点并且高于临界0Q值（例如 0.45)，并且由此自动避免了过度补料。
[0109] 在发酵期间自动避免过度补料：如果0Q低于预先定义的设定点，则发酵是超剂量 的（在代谢的碳和消耗的氧之间不存在平衡）。随着实施0Q控制器，低于目前设定点的0Q 将自动导致碳水化合物补料速率下降并且将因此避免了过度补料。
[0110] 使补料最大化：如果0Q高于预先定义的设定点，则发酵可以处理更多进料并且补 料速率增加。
[0111] 使每个发酵罐的感兴趣的化合物的产率最大化：存在最佳0Q并且本发明允许在 此参数上进行优化。
[0112] 用0Q控制器运行的实验已经示出，在试点性实验中和在生产中可能达到相同活 性水平。
[0113] 0Q控制可以与其他标准控制方案（像DOT控制）组合。如果DOTiOQ是高的，在 这种情况下进料速率将只增加，而如果只有D0T10Q是低的，进料速率将下降。
[0114] 正常并不将FQ控制和0Q控制进行组合。根据感兴趣的发酵--将进行试验，并 且将选择给出最佳结果的控制。
[0115] 感兴趣的化合物的回收
[0116] 本发明的另一方面涉及发酵液的下游处理。在发酵过程结束之后，可以使用针对 感兴趣的化合物研发的标准技术将感兴趣的化合物从发酵液中回收。
[0117] 有待应用的相关下游处理技术取决于感兴趣的化合物的性质。
[0118] 用于将感兴趣的化合物从发酵液中回收的过程将典型地（但不局限于）涉及以下 步骤中的一些或全部：
[0119] 1)发酵液的预处理（例如絮凝）
[0120] 2)将细胞和其他固体物料从发酵液中除去（初级分离）
[0121] 3)过滤
[0122] 4)浓缩
[0123] 5)稳定化并且标准化。
[0124] 除了以上列举的单元操作之外，还可以应用许多其他回收程序，例如pH-调节、温 度的变化、结晶、用活性炭处理包括感兴趣的化合物的溶液、使用层析、以及使用不同的吸 附剂。
[0125] 在以下实例中进一步阐明本发明，该实例不以任何方式限制所要求保护的本发明 的范围。
[0126] 实例 1
[0127] 实施用FQ和0Q控制的表汰支链淀粉酶的地衣芽孢杆菌的分枇补料发酵，用来增 加讨稈鲁棒件和酶牛产
[0128] 材料与方法
[0129] 株系和生长条件
[0130] 在所有实验中使用表达支链淀粉酶（嗜酸性普鲁兰芽抱杆菌（Bacillus acidopullulyticus)支链淀粉酶--在W0 09/075682中描述的支链淀粉酶3)的地衣芽孢 杆菌株系。
[0131] 为了储存，在37°C在LB培养基中增殖培养物，并且添加甘油至15% (w/v)的终浓 度。
[0132] 将悬浮液分装进1ml的冷冻管，并且维持在低于_70°C。
[0133] 为了接种，将0. 1ml的冻融的冷冻管悬浮液涂布在具有以下组合物的SSB4培养基 斜面上：大豆蛋白胨 SE50MK 10g/l、蔗糖 10g/l、K2HP04 2g/l、Na2HP04 · 2H20 5g/l、维生 素（盐酸硫胺素11，4mg/l、核黄素0, 95mg/l、烟酰胺7, 8mg/l、泛酸興9, 5mg/l、批卩多醒-HC1 1，9mg/l、D-生物素 0, 38mg/l、叶酸 2. 9mg/l)、痕量金属（MnS04、H20 9. 8mg/l、FeS04 ·7Η20 39, 3mg/l、CuS04 · 5Η20 3, 9mg/l、ZnS04 · 7Η20 8, 2mg/l)、琼脂 25g/l。使用去离子水，并 且用NaOH调节pH至pH 7· 3至7· 4,此后将培养基灭菌。
[0134] 在37°C，使细胞在琼脂上生长24h，并且然后在灭菌去离子水中重新悬浮，并且用 于接种具有201的标称体积的种子发酵罐。
[0135] 在种子发酵罐中，与以下组合物一起使用151的复杂生长培养基（灭菌后）：大豆 粗粉11〇〖/1，似2即04,2!120 58/1。使用饮用水来制备培养基。在接种前，用氨水或!13?04 将pH调节至7. 0。在发酵期间，通气控制在1. 5vvm，温度控制在37°C，反压控制在latm，并 且搅拌控制在lOOOrpm。当总摄氧达到2. 6mol的任意值时，停止种子培养。用10% (w/v) 的每个种子培养物接种主发酵罐。
[0136] 发酵条件
[0137] 从种子发酵罐接种三个发酵批次（批次X、批次Y和批次Z)，其中起始体积是8 1。
[0138] 发酵培养基包含（在接种前并且在灭菌后）：MgS04 · 7H20 4g/l、K2HP04 7g/l、 Na2HP04*2H20 7g/l、（NH4)2S04 4g/l、K2S04 5g/l、柠檬酸 0.78g/l、维生素（D-生物素 1.25mg/l)、痕量金属（MnS04、H20 39.2mg/l;FeS04、7H20 157mg/l;CuS04、5H20 15.6mg/ l;ZnS04、7H20 32,8mg/l)、除泡剂（SB2121)1.25ml/l、蔗糖 10g/l(仅在批次X 中）。使用 饮用水来制备培养基。在接种前，用氨水或H3P04将pH调节至6.0。在培养期间，温度控制 在37°C，最小pH维持在6. 0 (氨水），最大pH控制在7. 0 (H3P04)，搅拌设置在800rpm (Oh)， 并且斜升至l〇〇〇rpm(lh)，通气控制在1. 5vvm并且反压控制在latm。
[0139] 将650 g/1蔗糖溶液用作补料培养基，用饮用水制备并且灭菌。
[0140] 如以下所述进行三个分批补料发酵过程：
[0141] 批次X :初始批次阶段随后是用溶解氧（DOT)控制的营养补料的补料批次（PI控 制）。在以初始糖的减少为标志的二氧化碳释放率下降之后开始补料。DOT控制的设定点 被设定至20% (参见图6)。
[0142] 批次Y:从发酵开始，用FQ控制的（PI控制）营养补料的补料批次。控制器的设 定点遵循预先定义的谱（参见图3)。
[0143] 批次Z:从发酵开始，用0Q控制的（PI控制）营养补料的补料批次。控制器的设 定点遵循预先定义的谱（参见图4)。
[0144] 在所有三个批次中，培养基组分和培养基浓度是相同的，除了向批次X添加蔗糖 作为初始碳源，因为这是该类型的过程普遍接受的标准实践。这并不要求新工艺类型Y&Z， 并且因此在接种后直接开始补料。
[0145] 贯穿这些发酵过程，每天提取用于干重测量的一式三份样品和用于酶活 性分析和在线pH的单一样品。活性分析的CV小于3. 2 %。在分布式控制系统 DeltaV( ?艾默生电气公司（Emerson Electric Company))中运行所有控制回路，并且 在相同系统中针对所有参数即时进行数据采集。类似地，在DeltaV( ?艾默生电气公司 (Emerson Electric Company))中实施FQ、0Q和DOT营养补料控制器。用质谱仪即时进行 针对C02和02的排气测量。
[0146] 结果
[0147] 与使用本领域已知的标准发酵营养补料方法的批次（批次X)相比，使用FQ控制 (批次Y)和0Q控制（批次Z)的批次达到了显著更高的酶滴度。在发酵过程末尾，批次Y 具有高于批次X中的最高水平20 %的酶滴度。类似地，批次Z达到60 %，高于批次X的最 高水平（参见图1)。
[0148] 此外，由FQ(批次Y)和0Q(批次Z)控制的发酵过程有助于远远更高的生物质水 平。在发酵过程末尾，与批次X中获得的最高遂平相比，批次Y和批次Z二者都具有20 %更 高的生物质水平（参见图2)。
[0149] 贯穿发酵过程，通过营养补料速率的自动操纵的FQ和0Q的控制是非常准确的，并 且由此这些过程值紧密符合预先限定的设定点曲线（参见图3和图4)。
[0150] 在该过程末尾，在批次Y中是约45h以后，并且在批次Z中是约40h以后，发生FQ 和0Q中的突然下降。这一下降标志着发酵批次突然减小了它们的代谢速率并且因此处于 过度补料的风险中。然而，FQ和0Q控制器调节了补料速率并且自动将其减小至更低的水 平，适合新的培养条件（参见图5)。
[0151] 因此，维持发酵过程的控制并且在一些起伏现象后，FQ和0Q参数返回至设定点谱 (分别参见图3和图4)。
[0152] 在运行标准实践方法的发酵批次（批次X)中，由营养补料速率准确控制DOT水 平，直至进入发酵25h。
[0153] 在此时，发生与过度补料关联的代谢问题，并且DOT突然上升。这类似于在批次Y 和批次Z中所见。与批次Y和批次Z相比，在批次X中，这一问题大致发生得早20h。因为 标准实践方法使用DOT控制的补料速率，所以DOT上升的响应是针对控制器来增加补料速 率（图5)。这持续下去，直至补料速率达到进料泵的最大能力，并且针对该过程的其余部 分，DOT高于过程设定点。因此，对不同控制策略的生理条件的响应是基本上不同的：在过 度补料后，FQ和0Q控制器自动减小补料速率，并且随FQ和0Q返回它们对应的设定点维持 过程控制（分别是图3和图4)，而DOT控制增加补料速率并且达到其中可以不再控制该过 程的状态（参见图6)。
[0154]
[0155] 将标准发酵方法（批次X)用作用于评估两个控制策略的比较；在批次Y和Z中分 别是FQ和0Q。
[0156] 从结果可以清楚地看到，使用这些新控制策略有助于更具鲁棒性的发酵过程，其 中贯穿该发酵可以维持过程控制。其次，在由FQ和0Q控制来控制的批次中，生理变化被大 大延迟，与批次X相比，发生约晚了 20h。最后，与运行本领域已知的标准方法的过程相比， FQ和0Q控制的批次达到了显著更高的末尾滴度和生物质水平。
[0157] 实例 2
[0158] 具有0Q控吿l|的葡萄糖丰卜料谏.率的酉良酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的分批 补料发酵
[0159] 材料与方法
[0160] 株系和生长条件
[0161 ] 在本实验中，使用具有商品名I Red 的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0162] 储存：在塑料包封（envelope)中，将粒状的干酵母维持在5°C。
[0163] 选择单菌落：将颗粒涂布在Yro琼脂上，并且在3〇°c孵育3天。Yro琼脂包含：酵 母提取物l〇g/L，细菌蛋白胨20g/L，右旋糖30g/L，琼脂20g/L。
[0164] 在Yro琼脂上增殖：从Yro琼脂挑选单菌落并且溶解在M9缓冲剂中。然后在新的 YPD琼脂(0 = Π Ο?)上涂布包含细胞的缓冲液,并且在30°C孵育3天。使用100ml0. 1 % 吐温溶液从β = 11 cm YPD琼脂上刮掉所有细胞,来获得100 ml接种物，然后将其转移至 种子发酵罐。
[0165] 种子发酵条件
[0166] 用50ml的接种物接种具有20升标称体积并且包含10升的无菌生长培养基的种 子发酵罐。
[0167] 在接种前种子生长培养基包含：葡萄糖27. 3g/L、细菌蛋白胨（Bacto Peptone) 20g/L、细菌培养用酵母提取物（Bacto Yeast extract) 1(^/1^112304(965^)21111/ L、MgS04*7H20 9g/L、K2HP04 14.3g/L、KH2P04 8g/L、（NH4)2S041.3g/L、痕量金属 (ZnS04 · 7H20 37mg/L、CuS04 · 5H20 18mg/L、FeS04 · 7H20 177mg/L、MnS04 · 1H20 107mg/ L)、H3P040.6g/L、Dowfax 63nl0 lml/L、维生素溶液（肌醇 1.96g/L、氯化胆碱 0.98g/ L、氯化硫胺素（Thiaminchlorid)0.196g/L、批卩多醇（B6维生素）0.196g/L、烟酰胺（烟 碱）0· 196g/L、d-Ca-泛酸盐 0· 147g/L、D-生物素 0.0098g/L、叶酸 0.0098g/L·)。在灭菌之 前，用H3P04将pH调节至5. 5。在种子混合物的灭菌后，将维生素溶液和葡萄糖溶液（66% w/w)灭菌过滤至该批次中。使用饮用水来制备培养基。在接种前，用氨气（NH3)将pH调节 至 5. 5。
[0168] 在种子发酵期间，将通气维持在1. 2VVM，温度控制在32°C，反压控制在1. 3巴，并 且搅拌从〇小时的600RPM上升至在6小时的900RPM，并且至终维持在900RPM。在24h后 停止种子，并且将约l〇〇ml转移至每个主发酵罐中。
[0169] 主发酵条件
[0170] 用来自种子发酵罐的l〇〇ml接种具有20升标称体积和5升起始体积的主发酵罐。 在接种前，发酵培养基包含：与种子相同，除了 5. 3g/L的低葡萄糖浓度。
[0171] 在培养期间，温度控制在32°C，搅拌从0小时的600RPM上升至在6小时的900RPM， 并且至终维持在900RPM，通气控制在12L/min并且反压控制在1. 3巴。将660g/l葡萄糖溶 液用作补料培养基，用饮用水制备并且灭菌。用NH3将最小pH维持在5. 5,并且DOT从不低 于200臟!^(约40%饱和）。从发酵开始，葡萄糖补料为0〇控制（?1控制），其中0〇设定点 为 0· 3。
[0172] 在控制系统Procos II中运行所有控制回路，并且在相同系统中针对所有参数即 时进行数据采集。类似地，在Procos II中实施0Q营养补料控制器。用光声气体分析仪即 时进行针对C02和02的排气测量。
[0173] 结果
[0174] 发酵具有从0-4小时的批次阶段，其中消耗掉来自主混合物的过剩葡萄糖（5. 3g/ L)。在这一初始阶段（来自其中的培养物是葡萄糖受限的）后，0Q控制器将0Q控制在设 定点0. 3。存在高于朝向终点的的0Q设定点的微小增加（0. 05)，可以通过0Q控制器中的 PI参数的太保守调谐来对此进行解释（参见图7)。尽管如此，根据酵母培养物的天然指数 增长，增加了葡萄糖补料速率（参见图8)。
[0175] 结论
[0176] 已经不出，在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵期间，0Q控制器可以根 据需要和限制自动调节葡萄糖补料速率，并且由此优化生长速率而没有溢出代谢的风险。
[0177] 实例 3
[0178] 具有0Q控吿l|的，I,糖丰卜料谏.率的里氏木霉（Trichoderma reesei)的分批丰卜料发酵
[0179] 材料与方法
[0180] 株系和生长条件
[0181] 在本实验中，使用产生纤维素酶的非GM0里氏木霉（Trichoderma reesei)。
[0182] 储存：将小瓶储存在_80°C。
[0183] 在PDA琼脂上增殖：在具有固化的琼脂斜面的50ml Μ管中，在30°C，在10-16日 期间产生孢子。通过用注射器和l〇ml转移缓冲剂（M9缓冲剂）刮掉孢子来收获孢子。然 后将3ml获得的悬浮液无菌转移至种子发酵罐中。
[0184] 种子发酵条件
[0185] 用3ml的接种物接种具有20升标称体积并且包含10kg的无菌生长培养基的种子 发酵罐。种子发酵由70h的批次阶段组成。
[0186] 在接种前种子生长培养基包含：
[0187] 蔗糖 50g/L、玉米浆粉 6. 25g/L、KH2P04 4g/L、（NH4)2S04 6. 35g/L、MgS04, 7H20 2g/L、CaC12 0.53g/L、消泡油（Dowfax 63nl0)1.5g/L、FeS04,7H20 0.0025g/L、MnS04,H20 0.00168/1、21^04,7!120 0.00148/1。在灭菌前，生长培养基的？!1为4.88。灭菌后，用順3 将pH调节至5. 0。
[0188] 在批次阶段，pH下降并且在70h pH已经下降至4.2,这是转移信号。用8L/min的 通气维持D0T，反压为0. 5巴并且搅拌为600-750rpm。温度为25°C。将1. 2kg的种子培养 物转移至主发酵罐。
[0189] 主发酵条件
[0190] 用1. 2kg的种子培养物接种具有20升标称体积并且包含10kg的无菌生长培养基 的主发酵罐。
[0191] 在接种前，主发酵培养基包含：
[0192] 玉米浆粉 6. 25g/L、KH2P04 4g/L、（NH4)2S04 6. 35g/L、MgS04, 7H20 2g/L、CaC12 0.53g/L、消泡油（Dowfax 63nl0)1.5g/L、FeS04,7H20 0.0025g/L、MnS04,H20 0.0016g/L、 21^04,7!120 0.00148/1。在灭菌前，生长培养基的？!1为5.08。灭菌后，用!13?04将？!1调节 至 4. 5。
[0193] 在发酵期间，温度控制在25°C，搅拌为950-1100RPM，通气0, 8-1，2vvm，并且反压 为1. 3巴。将20% w/w乳糖溶液用作补料培养基。用NH3气体将pH调节在4. 5。DOT从 不低于60mmHg的最小设定点。就在接种后开始乳糖补料，并且它是0Q控制的，其中上升的 0Q设定点为在〇h的0. 45和在70h的0. 6。由具有对应于152ml/h的最大补料速率的1. 5 的固定rpm的蠕动泵添加乳糖补料。因为由0Q调节器命令，通过在60秒的给定周期时间 内自动调节冲量时间达到平均补料速率。以每3小时1. 5ml的冲量，将消泡油（P2000)抢 先地添加至该发酵罐。
[0194] 在控制系统Procos II中运行所有控制回路，并且在相同系统中针对所有参数即 时进行数据采集。用光声气体分析仪即时进行针对co2和0 2的排气测量。
[0195] 结果
[0196] 由0Q控制器成功地调节主发酵，该0Q控制器从Oh至70h增加乳糖补料速率（参 见图9和图10)。直至4h，0Q略低于设定点斜线，但是此后它维持在设定点斜线。纤维素 酶测量证实，在该过程期间产生酶--具有在71h的指数100(参见图11)。
[0197] 结论
[0198] 已经示出，在里氏木霉（Trichoderma reesei)发酵期间，0Q控制器可以根据需要 和限制自动调节乳糖补料速率，并且由此维持具体的代谢状态。
【权利要求】
1. 在补料-分批或连续发酵培养基中，控制向发酵培养基增碳的速率的一种方法，该 方法包括 测量转化为二氧化碳的c-摩尔损失； 测量经由增碳而添加的C-摩尔数； 计算二氧化碳补料系数FQ，为经一个时段，产生的C-摩尔二氧化碳除以添加的C-摩尔 碳；以及 根据感兴趣的FQ，调节增碳的速率，或者 测量耗氧的摩尔数； 测量经由增碳而添加的C-摩尔数； 计算氧补料系数0Q，为经一个时段，消耗的氧摩尔数除以添加的C-摩尔碳；以及 根据感兴趣的0Q，调节增碳的速率， 其中所述发酵培养基包含生产感兴趣的化合物的微生物，或者其中所述发酵培养基包 含生产感兴趣的微生物的微生物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中该微生物是一种细菌或一种真菌。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中该细菌是一种芽孢杆菌属株系。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中该感兴趣的化合物是一种蛋白质或一种肽。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中该蛋白质是一种酶。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中该感兴趣的化合物是一种多糖。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中该多糖是一种透明质酸。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中该碳源选自下组，该组由以下各项组成：葡萄糖、 蔗糖、乳糖、甘油和麦芽糖。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中该FQ是在从0. 25至0. 75的范围中。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中该OQ是在从〇. 25至0. 75的范围中。
11. 根据权利要求1所述的方法，其中该时间段是从1秒至20分钟。
12. 根据权利要求1所述的方法，其中该生产感兴趣的微生物的微生物是一种酵母。
13. 根据权利要求1所述的方法，其中回收该感兴趣的化合物。
14. 根据权利要求2所述的方法，其中该真菌是一种曲霉属株系或一种木霉属株系。
【文档编号】C12P1/00GK104093846SQ201380008010
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2013年2月21日 优先权日:2012年2月22日
【发明者】F·K·里萨加德, J·安德松 申请人:诺维信公司