专利名称：无细胞蛋白质合成用转录模型的设计、结构及使用其合成无细胞麦胚芽蛋白质的稀释批式法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种无细胞蛋白质的合成方法，该方法提供一种从遗传基因合成无细胞蛋白质合成系统用的翻译模型用转录模型的一般设计原理及其结构，以及使用该转录模型可简便、高效率地合成无细胞麦胚芽蛋白质。
后基因组计划的一个中心课题是分析多种多样的蛋白质基因的聚合体的结构与功能的关系。研究中所获得的成果包括在结构生物学和生物化学的基础生物学等的研究中，阐述了在作为其应用医学领域的基因研究中遗传基因翻译结果同病因的关系，而且期待着以至在医药研制、生产的广阔领域中提供一种重要的理论。
作为在生物体外高效率地在细胞内进行蛋白质合成反应的方法，迄今为止，正在积极地研究从从生物体中提取，例如作为细胞内含有蛋白质翻译装置的核糖体成分等的成分，并在该核糖体提取液中加入构成翻译模型、基质的氨基酸、能量源、各种离子、缓冲液，再加入其它有效基因，在试管内合成蛋白质的所谓无细胞蛋白质合成方法等。(特开平6-98790，特开平6-225783，特开平7-194，特开平9-291，特开平7-147992)。
在无细胞蛋白质合成的反应系，即无细胞蛋白质合成系中使用的蛋白质合成用的细胞提取液或生物体组织提取液的配制中，正在使用大肠杆菌、麦胚芽或家兔网状红血球等。由于无细胞蛋白质合成系在合成肽的速度和翻译反应的准确性的两个问题上，保持了与生物体细胞相媲美的性能，而且具有不需要复杂的化学反应工序和繁杂的细胞培养工序的优点，因此研制迄今为止正在实际使用的系统。然而，一般说来从生物体细胞提取的细胞提取液，其蛋白质的合成性极其不稳定，因此蛋白质合成效率低，另外还因为细胞提取液在保存中的质量也显著下降，因此在无细胞蛋白质合成系中获得的合成量因放射性同位体标识等可检测程度的量很少，因此不能作为实际生产蛋白质的生产方法。
作为现有高效率无细胞蛋白质合成方法，可以例举出由Spirin等人研制的连续式无细胞蛋白质合成方法[Spirin，A.，et.al.，(1993)Methods inEnzymology，217，123-142]。他们报告了一种通过将发现编入目的基因的质粒添加在使用从大肠菌、麦胚芽或家兔网状红血球配制的细胞提取液的转录以及翻译共用的无细胞蛋白质的合成系中，从而显示出可更高效率地合成蛋白质。其中，采取一种使用兼有转录以及翻译功能的大肠菌提取液的无细胞蛋白质合成系，在其连续式无细胞蛋白质合成法中，每1ml反应系得到最高达到1mg左右的产品。
但是，使用大肠杆菌的无细胞蛋白质合成系以发现编入目的基因质粒为模型，尤其在将该质粒以环型使用时，虽可发挥蛋白质的高合成能力，但是如果使用直链质粒和聚合酶链式反应(以下简称为PCR)建立的直链转录模型，则由于大肠杆菌提取液中混入的DNA分解酶作用，在2小时左右的短时间内分解为模型DNA，因此每1ml可合成蛋白质的量比现有批式相同等级的反应系将降低数十μg。于是，在现有方法中从大肠杆菌、麦胚芽或家兔网状红血球配制的无细胞蛋白质合成用的细胞提取液或组织提取液中，将混入一组核酸分解酶、翻译阻碍蛋白质基因、蛋白质分解酶等，由于这些分解元素的作用，在蛋白质合成反应中产生翻译反应系失活和惰性化([Ogasawara，T.，et al.，(1999)EMBO J.，18，6522-6531]。所以即使使用任意一种细胞提取液或组织提取液的蛋白质合成系，其合成效率均低、获得的蛋白质量也少。
最近发明者等提供了一种解决这些无细胞蛋白质合成系缺点的方法，即①无细胞蛋白质合成用细胞提取物制剂以及无细胞蛋白质合成法(WO00/68412号公报)；②利用具有通用性以及高效率功能的模型分子及其利用方法(WO01/27260号公报)，成功地进一步提高了无细胞麦胚芽蛋白质合成系中蛋白质合成效率。在各发明者研制的无细胞麦胚芽蛋白质合成系中，不含有核酸分解酶以及阻碍翻译反应的基因组[Madin K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564](WO00/68412号公报)，所以，作为转录模型，可高效率地实施以迄今为止被视为难题的直链DNA的蛋白质合成。
另一方面，通过利用现有的PCR法的模型DNA的结构法，配制上述高效率麦胚芽无细胞蛋白质合成系中使用的转录模型。在这种方法中，作为引物采用了作为识别DNA聚合酶以及结合部位媒介物的催化剂部位的整个领域和有助于翻译放大与mRNA稳定化的结构，此后，使用了一部分直至含有作为目的遗传基因的ORF(翻译框)的物质。通过使用这种引物，试验了从目的基因建立无细胞蛋白质合成用转录模型的结构。因此在采用PCR法的现有转录模型的结构方法中，由于除了作为目的完整长链的转录模型外，还为放大反应中产生的非特异DNA储存了具有启动子的短链DNA批。由于排出这种DNA批相当困难，因此如果以采用上述引物的PCR产物作为转录模型进行RNA合成，则所得到的大半分子就变为非特异性短链DNA的转录产物低分子RNA。在这些RNA分子中还含有翻译初始序列的RNA批，这些批被识别为mRNA的翻译结果，除目的遗传基因的翻译产物外，还出现了大量的低分子翻译产物，从而成为导致目的翻译产物的吸收量和浓度下降的原因。
于是，在整个长度的催化剂设计中含有互补的碱基序列的5′端的引物，并在使用通过利用其所建立的转录模型的现有翻译模型的结构方法中，存在着目的基因的转录效率极低、且翻译模型产生高噪声的很大缺点。
另外即使使用按这种方法建立的转录模型，由于在转录反应与翻译反应中的最佳的镁浓度显著不同，因此认为在使用现有批式麦胚芽无细胞蛋白质合成系的转录以及翻译整体型的高效率合成蛋白质是不可能的。而且作为转录基质残留物的4种核糖核苷三磷酸(4NTPs)和副产物的二氢吡咯酸反应，也是无细胞蛋白质合成系合成效率低的原因。
随着后基因组项目的进行，今天已经搞清许多基因的结构，另外数万种cDNA克隆也产生游离体。作为面向21世纪的基础科学及应用科学中遗传基因的功能与结构的分析、蛋白质分析、药品制造，第一步首先需要简便、高效率地从这些庞大的遗传基因中合成作为遗传基因产物的蛋白质。作为加以实现的主要技术，期待于①保持高翻译模型活性的mRNA的设计；建立②合成mRNA用的转录模型结构技术；以及将之加以应用的简便的③无细胞翻译技术。
本发明的一方面是一种5′端的引物的碱基序列用于由PCR法制作在无细胞蛋白质合成方法中使用的翻译模型分子用的转录模型，是含有在RNA聚合酶的启动子和具有部分互补性的碱基序列(4)；含有序列表的序列表编号2或序列表的序列编号3中记述的碱基序列的碱基序列(5)；含有序列表的序列编号3记述的碱基序列的碱基序列(6)；含有上述(5)或(6)的碱基序列的主要部分的碱基序列(7)；在上述(4)～(7)中的任意一种碱基序列和在核糖核酸控制基因条件下可进行杂交的碱基序列；或与其任意一种互补的碱基序列。
本发明的一方面涉及一种转录模型的建立方法，该方法是在由PCR法制作在无细胞蛋白质合成方法中使用的5′端非翻译序列的翻译模型分子用的转录模型时使用的碱基序列。其特征在于在将由两种不同的碱基序列构成的两种多核苷酸(A)、(B)用作5′端的引物，由PCR建立的转录模型的方法中，该两种PCR用引物的碱基序列是满足仅由任意一种该引物建立的DNA不发生转录的条件，一种该引物，从启动子5′的端至少具有包含启动子功能一部分的碱基序列互补的序列；但至少在该启动子3′端的RNA聚合酶识别部位用一部分不具有互补碱基序列的碱基序列构成的多核苷酸A；一种其它的该引物从该启动子3′的端，在至少含有RNA聚合酶识别部位的一部分的碱基序列中具有互补的碱基序列，但至少在该启动子5′的端的催化剂功能部位上由不具有互补的碱基序列构成的碱基序列的多核苷酸B；本发明的一方面涉及上述转录模型的建立方法，该方法在多核苷酸(B)的碱基序列上还继续插入GA或GAA序列，在其下游赋于mRNA翻译放大的碱基序列；另外使用由在不含有翻译初始密码ATG或目的遗传基因的ORF(翻译框)的一部分，或不含有ORF的ORF上游的碱基序列上连接互补碱基序列的碱基序列构成的多核苷酸。
本发明的一方面涉及上述转录模型的建立方法，其特征在于在多核苷酸的翻译部初始的密码与ORF间编入组氨酸标签和GST(谷胱苷肽S-转换酶)、myb等标签或抗原表位用的碱基序列。
本发明的一方面涉及一种转录模型的建立方法，其特征在于在由PCR法制作无细胞蛋白质合成方法中使用的翻译模型分子用的转录模型的方法中，作为该转录模型5′端的引物，使用由序列表的序列编号2记述的碱基序列构成的多核苷酸；由连接在序列表的序列编号3中记述的碱基序列中作为烟草花斑病毒产生的Ω序列与作为翻译初始密码的ATG碱基序列构成的多核苷酸；以及作为序列表的序列编号5中记述的碱基序列中翻译初始密码的ATG，然后与由连接作为转录目的的遗传基因固有的ORF的5′端碱基序列相连接的碱基序列构成的多核苷酸。作为该转录模型的3′端的引物，采用由序列表的序列编号1中记述的碱基序列构成的多核苷酸。
本发明的一方面是一种由PCR法制作转录模型用的引物组，该引物组含有作为5′端的引物，从启动子5′端，在至少含有引物功能部位一部分的碱基序列上具有互补的序列，但至少在该启动子3′的端的RNA聚合酶识别部位的一部分由不具有互补碱基序列的碱基序列构成的多核苷酸(A)；从启动子的3′端，在至少含有RNA聚合酶识别部位的一部分的碱基序列上具有互补的碱基序列，但在该启动子5′端，由至少不具有互补碱基序列的碱基序列构成的多核苷酸(B)；以及在多核苷酸(B)上可退火的碱基序列上继续连接翻译初始密码ATG、或目的遗传基因的ORF(翻译框)的一部分，或在不含有ORF的ORF上游的碱基序列上将互补的碱基序列构成的多核苷酸(C)；作为3′端的引物，在含有克隆遗传基因的传病媒介的抗药性遗传基因等标记遗传基因的转录终止子序列与在一部分Ori间存在的碱基序列与能形成互补链的碱基序列的多核苷酸。
本发明的一方面是上述的引物组，该引物组由多核苷酸(B)从启动子的3′端，在至少含有RNA聚合酶识别部位一部分的碱基序列上具有互补的碱基序列，但至少该启动子的5′端的启动子功能部位继续在不具有互补碱基序列的碱基序列上插入GA或GAA序列，在其下游进一步将造成mRNA的翻译放大的序列连接，而且由在翻译初始密码ATG、或不含目的遗传基因的ORE的ORE上游(5′端)的碱基序列上连接互补序列的碱基序列构成的多核苷酸。
本发明的一方面是引物组，该引物组是为由PCR制造供建立5′端的引物含有由在序列表的序列编号2中记述的碱基序列构成的多核苷酸；由连接序列表的序列编号3中记述的碱基序列上的烟草花斑病毒的Ω序列与作为翻译初始密码的ATG的碱基序列构成的多核苷酸；以及由连接序列表的序列编号5中记述的碱基序列中，作为翻译初始密码的ATG与然后作为转录目的遗传基因固有的ORE的5′端碱基序列连接的碱基序列构成的多核苷酸；作为3′端的引物含有在无细胞蛋白质合成法中使用的翻译模型分子用的转录模型。
本发明的一方面是一种转录模型，该模型是无细胞蛋白质合成方法中使用的高效率mRNA合成用的转录模型，通过上述任意一种建立方法都可加以制作。
本发明的一方面是转录模型，该模型是无细胞蛋白质合成方法中使用的高效率mRNA合成用的转录模型，使用上述任意一种引物组可通过PCR进行合成。
本发明的一方面是无细胞蛋白质合成方法，该方法作为翻译模型使用由上述任意一种建立方法制作的转录模型或从上述任意一种转录模型转录的mRNA。
本发明的一方面是上述无细胞蛋白质的合成方法，该方法在合成mRNA后通过凝胶过滤进行纯化。
本发明的一方面是无细胞蛋白质合成方法，该方法为转录以及翻译连续型稀释方式，其特征在于由上述任意一种建立方法制作转录模型，由转录用溶液进行转录反应后，添加无细胞蛋白质合成用的反应溶液，在添加后的反应溶液中至少将镁的浓度降低到翻译最佳浓度，同时降低该反应溶液中的转录基质及转录生成物的浓度，进而延长翻译反应的持续时间。
本发明的一方面是无细胞蛋白质的合成方法，该方法是转录及翻译整体型稀释方式，其特征在于由上述任意一种建立方法制作转录模型，在由无细胞蛋白质合成用反应溶液进行转录反应后，添加稀释溶液稀释，至少将该反应溶液中的镁浓度降低到翻译的最佳浓度，同时降低该反应溶液中的转录基质及转录生成物的浓度，进而延长翻译的持续时间。
本发明的一方面是无细胞蛋白质的合成方法，该方法是转录及翻译连续型稀释方式，其特征在于在反应容器中添加cDNA，实施上述任意一种转录模型的建立方法，在该反应容器中制作转录模型，由含有RNA聚合酶与含有4种多核苷酸三磷酸的转录溶液进行转录反应后，再次添加无细胞蛋白质合成反应用溶液，在反应溶液中，至少将镁浓度降低到翻译的最佳浓度进行翻译反应。
本发明的一方面是无细胞蛋白质的合成方法，该方法为转录及翻译整体型稀释方式，其特征在于在反应容器中添加cDNA，实施上述任意一种转录模型的建立方法，在该反应容器中制作转录模型，添加RNA聚合酶和含有4种多核苷酸三磷酸的无细胞蛋白质合成反应溶液进行转录反应后，添加稀释溶液稀释，在该合成溶液中至少将镁的浓度降低至翻译的最佳浓度进行翻译反应。
本发明的一方面是上述任意一种无细胞蛋白质的合成方法，该方法将镁浓度降低至翻译最佳浓度，将镁浓度从约1mM降低到约6mM。
本发明的一方面是上述任意一种无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于转录反应在约30～45℃下实施，而翻译反应在约20～30℃下实施。
本发明的一方面是上述任意一种无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于使用麦胚芽提取物。
(a)表示将作为ORF配入GFP遗传基因的pUC19制作的pEU结构和PCR法建立的转录模型建立用引物。
(b)表示SP6 RNA聚合酶产生的转录产物。
(c)使用这些mRNA的批式麦胚芽无细胞蛋白质中的蛋白质合成作为14C-亮氨酸摄入量指标进行测定的结果。图中所谓Cap是在mRNA的5′端上添加7mGpppG合成的带有Cap的RNA，所谓Circular是将环状多核苷酸作为转录模型建立的mRNA。
图2是表示采用按照对照例1中的现有方法设计的5′端的引物的转录模型的建立方法以及转录产物及其翻译的活性。
(a)是作为转录模型建立用的多核苷酸与PCR用引物的模式图；(b)表示主要PCR产物；(c)是表示从作为PCR产物所得到的转录模型预测为由SP6 RNA聚合酶转录的RNA分子中的模式图；图3是表示采用按照对照例1现有方法设计的5′端的引物由建立的转录模型得到的转录产物的琼脂糖凝胶电泳图。
各电子流是分别配入3种cDNA或GFP遗传基因(如图中所示翻译产物的分子量为25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)的模型多核苷酸制作的转录模型所得到的mRNA，左侧电子流为分子量标记。星状标记表示整个长度的转录产物。
图4是表示使用由对照例1现有方法设计的5′端的引物建立的转录模型所得到的转录产物，实施无细胞蛋白质合成后的翻译产物的自体放射照相术。
各电子流是由分别配入3种cDNA或GFP遗传基因(如图中所示翻译产物的分子量为25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)的模型多核苷酸制作的转录模型所得到的转录产物翻译的翻译产物。左侧的电子流为分子量标记。星状标记表示整个长度的翻译产物。箭头表示低分子产物。
图5是表示使用实施例2中RNA聚合酶启动子分断型标记的转录模型的建立方法及其转录产物以及其翻译活性。
(a)是作为转录模型建立用的模型用的多核苷酸与PCR用引物的模式图；(b)表示主要PCR产物；(c)是表示从作为PCR产物所得到的转录模型预测为由SP6 RNA聚合酶转录的RNA分子中的模式图；图6是使用实施例2中RNA聚合酶启动子分断型引物建立的转录模型所得到的转录产物的琼脂糖凝胶电泳图。
各电子流是由分别在将3种cDNA或GFP遗传基因(如图中所示翻译产物的分子量为25kDa、18kDa、14kDa以及27kDa)插入的模型多核苷酸制作的转录模型得到的mRNA。左侧的电子流为分子量标记。
图7是使用由实施例2中RNA聚合酶启动子分断型引物建立的转录模型所得到的转录产物无细胞蛋白质合成后的翻译产物的自体放射照相术。
各电子流是由分别配入3种cDNA或GFP遗传基因(如图中所示翻译产物的分子量为25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)的模型多核苷酸制作的转录模型所得到的转录产物翻译的翻译产物。左侧的电子流为分子量标记。
图8表示采用由实施例2中RNA聚合酶启动子分断型引物建立的转录模型转录的mRNA透析式麦胚芽无细胞蛋白质合成方法合成蛋白质。
各电子流使用从分别配入3种cDNA或GFP遗传基因(如图中所示翻译产物的分子量为25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)的模型多核苷酸制作的转录模型所得到的转录产物翻译的翻译产物。左侧的电子流为分子量标记。星号表示各转录产物。
图9表示采用实施例3中稀释方式的麦胚芽无细胞蛋白质合成方法合成蛋白质。(a)测定现有的批式( )与稀释法( )中的14C-亮氨酸的蛋白质摄入量的时效变化的结果，因此纵轴的放射能读数用等量的胚芽提取液表示；(b)是所得到的蛋白质的自体放射照相术；
图10表示采用实施例4中转录以及翻译整体型稀释方式麦胚芽无细胞蛋白质合成方法合成的蛋白质。(a)测定现有的批式( )与稀释法( )中的14C-亮氨酸的蛋白质摄入量的时效变化的结果，图中小 、中 、大 表示转录反应阶段中RNA合成基质浓度，分别为1.5mM、2.5mM、3.0mM。( )是现有的批式；( )表示稀释法。
(b)是所得到的蛋白质的自体放射照相术；图11表示由cDNA试验合成蛋白质试验方法的概图。
以下，以麦胚芽无细胞蛋白质合成系以及该合成系中能够得到功能的转录模型的设计方法和建立方法为例说明本发明，本发明的基本原理不仅限定于本专利说明书所表示的方法，而且也可应用在采用由其它微生物和动物细胞的细胞提取物的无细胞蛋白质合成系及其使用的转录模型的设计与建立上。转录模型建立中使用的引物结构发明者等使用已经稳定且可实现高效率的麦胚芽提取液的无细胞蛋白质合成系，研制了高翻译模型活性中所需要的mRNA的5′及3′端非翻译结构，且正在申请专利(WO01/27260号公报)。尤其是搞清了mRNA中赋予长链的3′端非翻译结构，对提高无细胞蛋白质合成反应效率是极其有效的。
(1)3′端的引物的结构由于通过PCR法建立了对于增强翻译模型活性是有效的、且具有尽可能短的3′端非翻译结构的mRNA的转录模型，因此作为标准遗传基因，以配入水母的绿色萤光蛋白质(Green Fluorescent Protein)(GFP)遗传基因的质粒[参照图1的(A)]为模型实施了PCR。
在由PCR法制造了GFP遗传基因的转录模型放大用的5′端的引物中，使用了由5′GCATTTAGGTGACACTATAGAA3′的碱基序列构成的多核苷酸。
3′端的引物使用下述3种引物(参照图1)进行了比较。引物III(序列表的序列编号1)是形成在抗药性标记遗传基因(在图1中为Ampr)的转录终止子序列与DNA转录初始的碱基序列间存在着的碱基序列与互补链的碱基序列，引物I及II是参考序列。
引物I5′GGGAAGATAAACAGTATTTT3′(mRNA1转录用)
引物II5′CCCTCGAGGCGTGGGCCCCA3′(mRNA2转录用)引物III5′AGCGTCAGACCCCGTAGAAA3′(mRNA3转录用)研究结果发现，引物III作为转录模型结构用的3′端的引物是最理想的，可以提供为得到具有高翻译模型活性的mRNA的最佳转录模型。
作为使用PCR法合成构成无细胞蛋白质合成法中使用的翻译模型分子3′端非翻译序列的转录模型的碱基序列，可以例举出由上述序列表的序列编号1中记述的碱基序列构成的引物III作为理想的序列结构。但是不仅限定于此，而且也可以是由在含有克隆遗传基因的传病媒介的抗药性遗传基因等标记遗传基因的转录终止子序列与DNA转录初始碱基序列(Ori)一部分的序列之间存在的碱基序列，例如碱基序列构成的引物由含有各个传病媒介固有的碱基序列与形成互补链的碱基序列，但不是具有特定的碱基序列的物质。例如含有序列表的序列编号1中记述的碱基序列的主要碱基序列；与这些碱基序列在核糖核酸控制基因条件下可形成杂交的碱基序列；而且也可以是由这些互补的碱基序列构成的引物。因此，所谓“在核糖核酸控制基因条件下进行杂交”意味着，例如在6×SSC、0.5％SDS以及50％甲酰胺溶液中升温到42℃后，在0.1×SSC、0.5％SDS溶液中，甚至在68℃清洗条件下依然可以观察到呈阳性的杂交信号。例如通过Molecular CloningALaboratory Manual(戈德尔哈博实验室，1989)等记述的方法，可得到这种碱基序列。
如果使用涉及本发明的上述3′端的引物，则可用PCR法简便得到对增强翻译模型活性有效、且尽可能短的3′端非翻译结构的mRNA的转录模型。由PCR法放大长链DNA，在其反应性质上一般说来往往是比较困难的，但是通过采用本发明则可采用PCR法建立现在被认为是困难的长链非翻译领域中所添加的mRNA的转录模型。
(2)使用由PCR法产生现有方式的5′端的引物转录模型的设计及结构作为标准遗传基因，利用了分别在质粒pUC19克隆白鼠肝脏的3种cDNA(分别将18kDa、25kDa、44kDa的编码蛋白质)与GFP(27kDa的蛋白质)编码的cDNA。
在第一阶段的PCR中，作为5′端的引物使用了具有来源于烟草花斑病毒的Ω碱基序列(5′ACATTCTACAACTACA3′；序列表的序列编号5)的下述引物3。在以下示出的碱基序列中，下划线部分的ATG是ORF的初始密码，X是遗传基因固有的ORF的5′端的碱基序列。因此，作为遗传基因固有的ORF的5′端的碱基序列，使用了从上述各cDNA的5′端连续的19个核苷酸构成的碱基序列，X的数量也可是约13个～30个。
引物35′ACATTCTACAACTACAATGXXXXXXXXXXXXXXXXXXX3′作为PCR用的3′端的引物使用了上述mRNA3转录用引物III(序列表的序列编号1)。
在第2阶段的PCR中，作为5′端的引物，使用了对应于RNA聚合酶的启动子碱基序列的全部范围的下述引物1。
引物15′GCATTTAGGTGACACTATAGAA3′和继该碱基序列后含有Ω序列及遗传基因固有的ORF的5′端碱基序列(XXXXXXXXXXXXXXXXXXX，19碱基)的以下序列(引物2)。因此，作为遗传基因固有的ORF的5′端碱基序列，使用了从上述各cDNA的5′端连续地19个核糖苷酸构成的碱基序列，X的数量也可是约13个～30个。
引物25′GCATTTAGGTGACACTATAGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAATGXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3′PCR用3′端的引物，以上述mRNA3转录用的引物III(序列表的序列编号1)的碱基序列为基础，使用了在启动子上错开3个碱基，设计、制造下述引物IV(序列表的序列编号4)。
引物IV5′GTCAGACCCCGTAGAAAAGA3′(3)在使用了启动子分断型引物的转录模型的设计及结构在低背景的转录模型的设计及结构中，作为5′端的引物，设计、使用了由RNA3聚合酶序列与在各个部分具有互补性的两种不同的碱基序列构成的引物。该引物一方面虽在从启动子的5′端，在至少含有启动子功能一部分的碱基序列上具有互补的序列，但是启动子的3′端的RNA聚合酶识别部位的一部分，至少由不具有互补的碱基序列的碱基序列构成的多核苷酸(A)，例如是①下述的引物；另一方面，从启动子的3′端，在至少含有RNA聚合酶识别部位一部分的碱基序列上具有互补的启动子的5′端，由在启动子功能部位至少不具有互补的碱基序列的碱基序列构成的多核苷酸(B)；例如下述引物②，即上述两种引物是在各启动子碱基序列其它一部分的碱基序列上具有互补碱基序列的启动子的分断型引物。该两种启动子分断型引物具有从使用该两种引物通过PCR建立的DNA发生转录，但仅任意一种该启动子都具有不从所建立的DNA发生转录的特征。这里举例示出的启动子分断型引物①以及②是SP6启动子基础的引物，但涉及本发明的启动子分断型引物不仅仅限于上述种类，而且根据这些碱基序列可做成各种各样的启动子。
引物①5′GCGTAGCATTTAGGTGACACT3′(序列表中的序列编号2)(下划线部分是与SP6启动子的5′端互补序列，但缺少与3′端的互补序列ATA)。
引物②5′GGTGACACTATAGAA(序列表中的序列编号3)，(下划线部是与SP6启动子的3′端互补的序列，但缺少与5′端的互补序列ATTTA)连接Ω序列(71碱基)和而且连接着由克隆的遗传基因产生的ATG。
引物③与上述引物3相同作为标准遗传基因，利用了3种来源于白鼠肝脏的cDNA和分别在pUC19上克隆了编码GFP的cDNA的引物。在第一阶段，作为5′端的引物，继作为来源于Ω序列的5′ACATTCTACAACTACA3′(序列表的序列编号5)后，使用了含有与从目的遗传基因翻译初始密码ATG开始了22碱基的ORF的5′端相互辅助系列的引物(完整长度38碱基)；作为3′端的引物，使用了mRNA3转录用的引物III(序列表的序列编号1)。而且在第二阶段的PCR，作为5′端的引物使用引物①及②；作为3′端的引物，使用上述引物IV(序列表的序列编号4)的(引物的摩尔比①∶②∶IV＝100∶1∶100)。PCR不一定是需要分为2个阶段，即使将整个工程在一个阶段实施，那么本发明的基本技术也不发生任何变化。
在比较使用上述现有方式的5′端的引物建立起来的转录模型，与涉及上述本发明的启动子分断型的5′端的引物建立起来的转录模型时，翻译模型的合成效率以及无细胞蛋白质合成效率，在采用启动子分断型引物的这一方比任一种模型都提高了效率。
如引物①及引物②那样的启动子分断型引物，甚至可使用在转录反应后不发生目的尺寸的mRNA分离，而且对为了由PCR法建立可使用在无细胞蛋白质合成系的、具有5′端非翻译序列的高翻译活性的mRNA的翻译模型是有用的。即在从使用启动子分断型引物，由PCR法得到的转录模型转录的mRNA中，几乎不含有混杂在以使用现有型的引物所得到的mRNA中产生非特异性的短链mRNA。在无细胞蛋白质合成方法中，非特异性短链mRNA以目的蛋白质的强力合成阻碍物发生作用，而构成了使合成量显著降低的原因。但是如果使用涉及本发明的翻译模型，则由于不影响该短链mRNA，因此可更高效率地进行无细胞蛋白质的合成。另外由于使用启动子分断型引物，从用PCR法得到的转录模型转录的mRNA在合成后，可不将目的尺寸的mRNA单独分离，在无细胞蛋白质合成系中使用，因此可简便地进行该mRNA的合成或从该mRNA合成蛋白质。
为建立成为上述无细胞蛋白质合成法中使用的翻译模型分子合成用的转录模型的DNA碱基序列的5′端PCR用的引物的碱基序列，可能是包含具有RNA聚合酶的启动子和部分具有互补性的碱基序列；可能是序列表的序列编号2或序列表的序列编号3中记述的碱基序列；可能是含有序列表的序列编号3中记述的碱基序列的碱基序列；可能是含有这些碱基序列的主要部分的碱基序列；可能是这些碱基序列与在核糖核酸控制基因条件下可杂交的碱基序列，或这些互补的碱基序列。
如果采用涉及本发明的上述5′端的引物，则通过PCR法可简便地得到将成为背景的转录产物量控制到最小限度的转录模型。在使用上述端的引物建立转录模型时，也可使用例如由作为上述5′端的PCR用的引物的碱基序列不同的碱基序列构成的两种引物。而且，作为3′端的引物，使用涉及本发明的上述3′端的引物是理想的。
在此，上述两种5′端的引物是满足由仅用任意一种引物所建立的DNA不发生转录的这种条件。一种该引物只是从启动子的5′端在至少含有启动子功能部位一部分的碱基序列上具有互补的序列，但至少在启动子的3′端的RNA聚合酶识别部位的一部分上，由不具有互补碱基序列的碱基序列构成的多核苷酸(A)；由该引物的其它一种从启动子的3′端至少在含有RNA聚合酶识别部位的一部分的碱基序列上具有互补的碱基序列，但至少在启动子的5′端的启动子功能部位由不具有互补碱基序列的碱基序列构成的多核苷酸(B)是理想的。
而且上述多核苷酸(B)在其序列上而且继续插入GA或GAA序列，在其下游赋予mRNA的翻译放大序列；而且也可是在不含有翻译初始密码ATG或目的遗传基因的ORF(翻译框)的一部分或ORF的ORF上游(5′端)的碱基序列上由连接互补的序列的碱基序列构成的多核苷酸。赋予mRNA的翻译放大的碱基序列，而且也可以是由连接在不含有翻译初始密码ATG或目的遗传基因ORF(翻译框)的一部分或ORF的ORF上游(5′端)的碱基序列中互补的序列构成的多核苷酸。赋予mRNA放大的碱基序列，如由烟草花斑病毒的Ω序列和紫花苜蓿花叶病毒的前导序列的碱基序列(AMV)，并将其直接结合的AMV的Ω序列，或由Ω序列的29种碱基Ω序列等，也可是不限于此而赋予翻译增大的碱基序列。
另外作为上述的5′端的引物，可使用含有将在不含有通过添加上述多核苷酸(A)与多核苷酸(B)，在多核苷酸(B)可进行退火的碱基序列之后5′端翻译初始密码ATG或目的遗传基因的ORF的一部分或ORF的ORF上游(5′端)的碱基序列连接的多核苷酸(C)的3种多核苷酸的引物。目的遗传基因ORF(翻译框)的一部分是由该ORF的5′端连续地约13碱基至约30碱基构成的碱基序列。在此多核苷酸(B)从启动子的3′端至少在含有RNA聚合酶识别部位的一部分的碱基序列上具有互补的碱基序列，即至少不具有该启动子的5′端的催化剂功能部位上的互补的碱基序列的碱基序列后插入GA或GAA序列，在其下游还连接赋予mRNA翻译放大的序列；而且也可是由连接在翻译初始密码ATG或不含有目的遗传基因的ORF的一部分或ORF的ORF上游(5′端)的碱基序列连接互补序列的碱基序列构成的多核苷酸。
另外在上述5′端的引物的翻译部分初始密码与ORF间，可配入组氨酸标记谷胱甘肽S-转移酶(GST)或myb等标记或抗原表位合成用的碱基序列。如果使用这样的引物制作成的转录模型，则在最终得到的翻译产物上述标记或抗原表位可以该翻译产物的精制或标记用以添加。
上述两种引物搭配或上述3种引物的搭配，可作为为制作各种遗传基因的转录模型用、或具有通用性的5′端的引物来加以使用。以下将把引物搭配称作引物组。另一方面，加在上述引物组中作为3′端的引物在含有克隆遗传基因的传病媒介的标记基因，例如在含有抗药性遗传基因等转录终止子序列和一部分Ori的序列间存在着的碱基序列可形成互补链的碱基序列构成的多核苷酸搭配的引物组是由于通过PCR制作成各种各样基因及其转录模型，因此可用作具有通用性的有用的基因组。
(转录及翻译整体型稀释方式蛋白质的合成方法及其转录和连续翻译型稀释式蛋白质的合成方法)如果利用由使用涉及本发明的引物所得到的转录模型，则可简便且高效率地合成蛋白质。例如上述原理及方法建立的转录模型的合成mRNA作翻译模型，添加在蛋白质合成中含有足够量的麦胚芽提取液的无细胞蛋白质合成反应溶液中，进行无细胞蛋白质的合成，则与使用现有的转录模型合成的mRNA进行蛋白质的合成相比，可长时间地持续合成反应。在由该转录模型合成mRNA时，可利用众所周知的转录反应。无细胞蛋白质的合成方法也可根据现有方法进行[Madin K.et.al.，(2000)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，97，559-564](WO00/68412号公报)。另外，如果采用凝胶过滤法精制合成mRNA，则可进一步提高蛋白质的合成效率。
另一方面，如果将涉及本发明的引物由PCR法得到的转录模型与已经报告的转录及翻译整体型无细胞蛋白质的合成方法(WO00/68412号公报)配合进行蛋白质的合成，那么将另外用途转录制作成的mRNA添加到无细胞蛋白质合成系中的繁杂性是可以回避的。在使用该转录模型的转录及翻译整体型麦胚芽无细胞蛋白质合成法中，首先将转录反应在适用于转录反应的条件下进行。理想的是将转录反应在约30～45℃，更理想的是在约35～40℃中进行。然后通过在反应溶液中添加适当的稀释液达到适于翻译反应的条件后进行蛋白质的合成。翻译反应的温度选择为按照目的蛋白质的适合该翻译的温度，理想的是约20～30℃。而且稀释溶液如果是适用于添加翻译反应所需要的能量源及氨基酸等的翻译反应的缓冲时，该反应溶液中的镁浓度至少要降低到翻译的适当温度，最理想的是应降到约1mM～6mM而添加适当的容量。通过添加稀释溶液可同时降低该反应溶液中含有的转录基质及转录生成物的浓度，其结果可使蛋白质合成反应的持续时间延长，进而提高合成效率。
具体说来，例如转录翻译整体型稀释方式无细胞蛋白质合成方法，首先配制含有容量为48％的下述最终浓度的麦胚芽提取液(浓度200A260units/ml)的下列浓度的组成[1,000units/ml核糖核酸酶阻碍物(RNAsin)、30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸钾、16mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、0.5mg/ml肌酸激酶、2.5mM腺苷三磷酸(ATP)、2.5mM鸟苷三磷酸(GTP)、2.5UTP、2.5CTP、1500单元/ml的SP6 RNA聚合酶、16Mm肌磷酸、1.48mM精脒、20种L型氨基酸(各0.3mM)、25μg/ml的转录模型的DNA]构成的反应溶液，在30℃进行3小时的转录反应，然后用稀释反应液。稀释溶液由30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸钾、0.4mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、0.94mM的ATP、0.25Mm的GTP、16mM肌磷酸、0.380mM精脒、20种L型氨基酸(各0.3mM)构成。通过这种稀释主要成分变成如下的浓度，即麦胚芽提取液的原液浓度8％(原液浓度200A260nmunits/ml)、30Mm HEPS-KOH(pH7.6)、95mM醋酸钾、3mM醋酸镁、1.2mMATP等。另外，由于未查清GTP、UTP、CTP在反应中的消耗量，因此尤其不能计算稀释后的各浓度。
在上述转录和翻译整体型稀释方式的无细胞蛋白质合成方法中，将作为翻译反应中需要的细胞提取物的麦胚芽提取物最初添加在反应溶液中，因此在该转录反应中也存在该提取物。该提取物无需从最初添加，而在合成后添加稀释溶液时，为了使最终浓度能达到适合于翻译反应浓度，稀释溶液和同时或在稀释溶液中混合的也可添加在无细胞蛋白质合成系中。这种方法在这里被称作转录以及连续式翻译稀释方式无细胞蛋白质合成法。
转录以及翻译整体型或转录以及连续翻译型的稀释式无细胞蛋白质合成法不含有繁杂的操作，因此简便，而且可直接用PCR法建立转录模型，在无细胞系可高效率地合成蛋白质。而且，如果将目的遗传基因产物以组氨酸标记和谷胱甘肽S-转移酶溶合的蛋白质的形式合成，由于使用与其相对应的配位体的固化物可以高效率地精制遗传基因产物。
例如如图11所示，使用具有可在所有遗传基因上通用的涉及上述本发明通用性的引物组(5′端的3种或3′端的1种)，通过转录以及翻译整体型或转录以及连续翻译型的稀释方式合成无细胞蛋白质法可简便、且高效率地进行合成。
首先在反应容器中加cDNA，这时作为反应容器，使用市场销售的多穴槽浓度滴定盘，例如96穴槽浓度滴定盘等，在每个穴槽内分别加不同蛋白质进行翻译的cDNA，一次性全成多种蛋白质。于是在多穴槽浓度滴定盘的各个穴槽中，加不同种的cDNA，可用作cDNA实验。CDNA实验也可使用市场销售的产品。对上述cDNA实验添加上述引物组进行PCR，其结果形成转录模型。
然后在实施转录及翻译整体型稀释方式的蛋白质合成法时，在各容器中加入RNA聚合酶、4NTPs、麦胚芽提取物等的无细胞蛋白质合成用反应溶液(例如参考下述的实施例5)，将温度保持在约30℃～45℃，更理想的是在约35℃～40℃进行所要求时间的转录反应。然后添加稀释溶液，将镁浓度降低到翻译反应最佳浓度后，将温度保持在约20℃～30℃进行翻译反应，其结果可得到作为翻译产物的蛋白质。
在转录模型制作结束后实施连续翻译型稀释方式的蛋白质合成法时，在各容器中加入含有RNA聚合酶、4NTPs的转录用溶液(例如参照下述实施例4)将温度保持在约30℃～45℃，更理想的是保持在约35℃～40℃进行所要求时间的转录反应，将温度保持在约20℃～30℃进行翻译反应。
然后添加含有麦胚芽提取物等的无细胞蛋白质合成用反应溶液，在预先以添加上述无细胞蛋白质合成用反应溶液的其它反应容器中，例如在多穴槽浓度滴定盘中以该反应后的溶液作底层，在该无细胞蛋白质合成用反应溶液成为上层，静静地叠层放置，也可进行无细胞蛋白质的合成反应。在这种方法中，在上层和下层间形成的界面上，2层溶液中含有的物质发生扩散，逐渐将上层与下层相互混合，因此可缓缓地连续地进行翻译反应，因此可在长时间内进行蛋白质的合成。
以上通过本发明利用迄今为止被视为困难的PCR法的简便、高效率的无细胞蛋白质的合成，通过利用麦胚芽高效率无细胞蛋白质合成系，以及涉及本发明的mRNA转录模型建立方法以及转录及翻译整体型稀释方式无细胞蛋白质合成方法或转录以及连续翻译型无细胞蛋白质合成法首次成为可能。另外，使用包括启动子的部位翻译放大结构以及ORF的一部分的现有单链引物建立的无细胞蛋白质合成模型用DNA，则由于除目的遗传基因翻译产物以外，产生大量的低分子翻译产物，因此翻译效率降低，但是通过本发明可消除这一缺点。通过采用上述启动子分断型引物的PCR法建立无细胞蛋白质合成用转录模型的原理，不仅仅局限于使用麦胚芽提取物的无细胞蛋白质的合成系，而且也可作为使用大肠菌等其它细胞提取物的无细胞蛋白质的合成系中的模型设计原理。
若根据本发明，则在克隆为任意传病媒介的遗传基因中，如果准备在该基因中具有互补序列的5′端和3′端固有的引物，则通过使用可在所有基因上具有可通用使用的通用性上述各引物组对被克隆的任意基因都可简便、高效率地进行无细胞蛋白质的合成。因此本发明在于提供一种基础的重要技术，该技术将面对在基因组项目即将结束的同时所形成的庞大数量的遗传基因的功能解析与结构解析为基础的遗传基因产物(蛋白质)的生产。
作为PCR的模型使用了以示于图1(A)中的麦胚芽无细胞蛋白质合成系用的质粒而研制的pEU(WO01/27260号公报)中通过通常方法克隆水母的GFP遗传基因的物质。这种质粒的结构是在5′端上游上序列SP6 RNA聚合酶的引物序列，然后是作为翻译初始反应系序列的烟草花斑病毒(TMV)的Ω序列，然后连接GFP遗传基因，在3′端下游插入转录初始点(Ori)，然后在其下游作为标准遗传基因插入抗氨苄青霉素遗传基因(Ampr)[图1(A)]。
被使用的5′端的引物是含有SP6启动子的引物(5′GCATTTAGGTGACACTATAGAA3′)，3′端的引物I、II或III(序列表的序列编号1)[图1(a)]，其序列如下。这些引物是委托AMASIRM FALMASIR公司制造的。
引物I5′GGGAAGATAAACAGTATTTF3′(mRNA1转录用)引物II5′CCCTCGAGGCGTGGCCCCA3′(mRNA2转录用)引物III5′AGCGTCAGACCCCGTAGAAA3′(mRNA3转录用)作为编入上述水母GFP遗传基因的pEU，供模型用的上述引物在以下条件下进行了PCR。
PCR用反应溶液1× ExTaq缓冲剂200μM dNTP(脱氧核糖核苷酸)10nM 引物(5′GCATTTAGGTGACACTATAGAA3′)10nM 引物I、或II或III0.025U ExTaq DNA聚合酶50pg/μl 模型质粒DNAPCR的反应条件98℃下1分钟↓
(98℃下10秒钟→60℃下30秒钟→72℃下5分钟)作为30循环↓72℃下4分钟↓4℃然后将上述得到的PCR产物作为转录模型，使用SP6 RNA聚合酶使按下述配制的转录溶液在37℃下反应2小时得到作为转录产物的mRNA。
转录用溶液(mRNA溶液)(μl) 最终浓度PCR产物2.50.4μl/μl5×缓冲剂 5 1×25mM NTPs 3 3mM111U/μl RNase阻碍物 1 4.4U/μl50U/μl SP6RNA聚合酶 0.75 1.5U/μl离子交换水(Milli Q)12.75合计 25另外，将这里使用的5×缓冲剂的组成示出下表。
5×缓冲剂 (1×最终浓度)400mM HEPES-KOH pH7.6 80mM80mM醋酸镁 16mM10mM精脒 2mM50mM二硫苏糖醇 10mM
图1(b)中示出具有由上述设计建立的转录模型转录的不同碱基数的3′端非翻译序列mRNA分子的模式图。mRNA1是使用引物I建立的结构，mRNA2是使用引物II建立的结构，mRNA3是使用引物III(序列表的序列编号1)建立的结构。
图中的Cap是在mRNA的5′端上添加7mGpppG合成的带有Cap的GFPmRNA，为了使用mRNA2的引物II建立的561碱基的3′端非翻译序列。而且，该图中Circular是以环状质粒为转录模型而建立的GFPmRNA。主要包括1900碱基或5900碱基构成的两种长链的3′端非翻译序列。这些序列根据WO01/27260号公报已经公布的方法制作并分别对照实验用于无细胞蛋白质的合成反应。
使用补片式麦胚芽无细胞蛋白质合成系，在3小时的翻译反应后研究了使用上述建立的转录模型所得到的mRNA的转录模型活性。该翻译反应是根据Madin等人的方法[Madin K.et.al.(2000)，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，97，559-564]以及WO00/68412号公报中记述的方法实施的。而且蛋白质的合成以14C-亮氨酸的摄入量的测定为指标进行测定，纵轴的放射能读数用胚芽提取液量表示。其结果如图1(c)所示，由使用引物III(序列表的序列编号1)建立的模型转录的mRNA3(5′端为Ω序列，在3′端具有1896碱基的非翻译序列GFPmRNA)高效率的翻译效率，其效率与具有由带有Cap的mRNA和周期序列(Circular)质粒转录的长链的3′端非翻译序列的mRNA媲美。
即没有查清在构成为添加在麦胚芽无细胞蛋白质合成系中使用的mRNA上3′端非翻译序列用的转录模型的DNA碱基序列的结构中，以在克隆例如像引物III(序列表的序列编号1)的碱基序列那样的遗传基因的终止子的抗氨苄青霉素遗传基因的转录终止子序列和Ori间存在的碱基序列和能形成互补链的碱基序列作为引物来设计而使用的方法是有效的。
对照例1转录模型结构用引物的设计与转录模型的PCR结构(采用现有方法的转录模型的建立法)为了通过PCR法得到具有5′及3′mRNA转录模型，因而设计并建立了PCR中使用的引物。所谓mRNA的5′端非翻译结构，如已在WO01/27260号公报中公布的那样，来源于紫花苜蓿花叶病毒(AMV)的碱基序列、烟草花斑病毒(TMV)的Ω序列以及使其直接结合的AMV-Ω序列，而且将剪短的Ω序列29碱基Ω序列添加到mRNA中，对提高无细胞蛋白质合成的反应效率是极其有效的。在此选用这些5′端非翻译结构中的TMVΩ序列作为5′端非翻译序列。作为3′端非翻译序列使用了上述实施例1中示出的1896碱基构成的序列(参照图1)。
首先研究了使用作为转录模型的5′端序列结构法通用的3种引物的现有的PCR法(图2)。在图2(a)中，有关这里所尝试的PCR法的概况示出了配入目的蛋白质翻译的遗传基因的质粒结构、5′端序列结构用3种引物(引物1、2、3)与3′端序列结构用的引物III的模式图。将引物1、2、3的碱基序列表示如下，在引物3的碱基序列中X表示目的遗传基因固有的ORF的5′端的碱基序列。引物III与实施例1中使用的引物相同。这些引物是与实施例1相同的方法制作的。引物15′GCATTTAGGTGACACTATAGAA 3′引物25′GCATTTAGGTGACACTATAGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAATGXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3′引物35′ACATTCTACAACTACAATGXXXXXXXXXXXXXXXXXXX3′作为转录模型结构用的模型使用插入在pUC19上由cDNA试验选出的基因的质粒。在质粒中，分别与实施例1相同的方法插入白鼠肝脏的3种cDNA以及GFP遗传基因(翻译产物的分子量为25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)。与实施例1相同进行使用上述引物的PCR，将所得到的PCR产物作为转录模型，与实施例1相同的方法在试验上进行2小时的转录反应得到了转录产物。
在图2(b)中表示现有PCR法得到的主要放大产物与非特异性产生的短链DNA的副产物，而且在(c)中示出将该副产物以原状态转录模型使用的合成转录产物的模式图。在图2(c)中，(1)中表示的mRNA是完整长度的mRNA，可给予完整长度的翻译产物；(2)中示出的mRNA给予低分子翻译产物；(3中示出的mRNA由于缺少Ω序列，因此而没有翻译模型活性。如果从转录反应中的生物化学特性考虑，那么所合成的RNA分子大多数可以预想为是DNA链长短的PCR产物所产生的。
图3表示采用常规方法进行上述转录产物的聚丙烯酰胺电泳图。各电子流表示使用由分别插入3种cDNA或GFP遗传基因(翻译产物的分子量为25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)基因的模型质粒制作的转录模型所得到的转录产物，即mRNA。而且星状标记表示完整长度的转录产物。从图3可知，ORF越大的遗传基因其转录效率越低，而且使用这种方法转录的大部分产物是低分子RNA，所以由PCR法产生的非特异性短链DNA分子中含有启动子。这种现象很好的与上述图2(b)及(c)的预测完全吻合。
然后，从上述的各种复制产物中不能分离目的尺寸的mRNA，通过在将转录产物脱氯后添加麦胚芽无细胞蛋白质合成系中进行3小时反应，得到翻译产物并按常规方法将其赋予自体放射照相术进行检测[Endo，Y.et al.，(1992)J.Biotech.，25，221-230][Madin K.et.al.(2000)，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，97，559-564]。翻译反应是根据上述[Madin K.et al(2000)，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，97，559-564]及WO00/68412号公报记述的方法实施，其结果示于图4，如图4中星状标记所示，发现少量的翻译产物分别对应于该mRNA量。在转录产物中，转录产物量多的18kDa蛋白质(参照图3)的合成量虽高，但大半翻译产物是分离成在图4箭头所示出的SDS-聚丙烯酰胺的低分子领域的低分子。这是在低分子转录产物中保持作为5′端的翻译初始增强结构的Ω序列和ORF的5′端的一部分，但是缺少ORF的3′端的mRNA含量高的部分。由于这些mRNA批具有与翻译初始基因很强的亲和性，因此与目的蛋白质的强力合成阻碍物发生作用而成为明显降低合成量的原因。
实施例2高效率转录模型结构用引物的设计与采用PCR的高效率转录模型的结构(着眼于RNA聚合酶启动子的的转录模型结构法)
在根据对照例1中示出的现有方法的引物设计方法中，在反应后不将目的尺寸的mRNA单独分离，不能得到为采用PCR法将具有在无细胞蛋白质合成系中可使用的5′端非翻译序列的具有高翻译活性的mRNA转录模型的有效引物。因此，充分灵活运用RNA聚合酶性质的机制，即根据RNA聚合酶识别由完整的碱基序列构成的启动子不能识别不完整的碱基序列构成的结构的这一事实，通过设计、制造这种有效的引物，而且实施了采用该引物的转录模型的建立方法(图5)。
在图5(a)中，配入以采用这里所试验的PCR方法中使用的目的蛋白质进行翻译的遗传基因的质粒结构，表示5′端序列结构用的3种引物(引物①、②及③)和3′端序列结构用的引物3的模式图。以下示出各引物的碱基序列。这些引物使用与实施例1相同的方法制作。这里设计的引物①是具有至少含有从引物的5′端的启动子功能一部分的碱基序列上具有互补的序列是至少在该启动子的3′端的RNA聚合酶识别部位的至少一部分上不含有互补的碱基序列的结构；引物②具有从该启动子的3′端在至少含有RNA聚合酶识别部位一部分的碱基序列上具有互补的碱基序列是在该引物的5′端至少在启动子的功能部位上不具有互补的碱基序列的结构，即引物引物①及②是启动子分断型的引物。引物③与上述引物3相同，引物III与实施例1中使用的引物相同。而且由于在第二阶段进行PCR，所以作为3′端非翻译结构序列用引物，还可使用通过合成引物IV(序列表的序列编号4)。引物IV以上述引物III(序列表的序列编号1)的碱基序列为基础，在例子中偏离3碱基而设立的结构，因此在下述碱基序列中示出，而且在下述引物序列中X表示质粒中编入的遗传基因固有的ORF的5′端的序列。
引物①5′GCGTAGCATTTAGGTGACACT3′引物III5′AGCGTCAGACCCCGTAGAAA3′引物IV5′GTCAGACCCCGTAGAAAAGA3′引物③5′ACATTCTACAACTACAATGXXXXXXXXXXXXXXXXXX3′引物②5′GGTGACACTATAGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAATG3′图5(b)示出了使用这种引物放大的主要PCR产物的模式图。图5(b)中的(2)及(3)示出的DNA由于采用RNA聚合酶的识别极其低，所以预测出在事实上不能进行RNA合成。而且可以期待采用通过这种方法设计的引物所建立的转录模型将变成如图5(c)。
通过使用这些引物进行了转录模型的建立。首先，作为转录模型结构用的模型，使用了在pUC19中配入由cDNA试验选择的遗传基因的对照例1相同的质粒。由第二阶段的PCR法在下述条件下使用上述引物制作了转录模型。在PCR法中作为聚合酶使用了宝公司制造的ExTaq DNA聚合酶。
第一阶段PCR用混合物(最终浓度)1× ExTaq缓冲剂200μM dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)10nM 引物③10nM 引物III0.025U ExTaq DNA聚合酶50pg/μl 模型质粒DNA第二阶段PCR用混合物(最终浓度)
1×ExTaq缓冲剂200μMdNTP100nM 引物①100nM 引物IV1nM 引物②0.025UExTaq DNA聚合酶0.05μl 第一阶段的PCR产物PCR的反应条件(使用与第一阶段及第二阶段的PCR相同的条件。)98℃下1分钟↓(98℃下10秒钟→60℃下30秒钟→72℃下5分钟)作为30循环↓72℃下4分钟↓4℃然后将上述得到的PCR产物作为转录模型，使用SP6 RNA聚合酶使按下述配制的转录溶液在37℃下反应2小时得到作为转录产物的mRNA。
转录用溶液(mRNA溶液)(μl) 最终浓度PCR产物10 0.4μl/μl
5×缓冲剂 5 1×25mMNTPs 3 3mM111U/μlRnase阻碍物1 4.4U/μl50U/μlSP6RNA聚合酶0.751.5U/μl离子交换水(MilliQ) 5.25合计 25另外，表中使用的5×缓冲剂的组成是与实施例1中使用的缓冲剂相同。
图6示出了采用所得到的转录产物的聚丙烯酰胺电泳图的分析结果。没有发现低分子转录产物的存在，而发现了合成具有各遗传基因的转录产物而预测的移动度的RNA。
将这些mRNA标样进行脱氯作为翻译模型通过添加在间歇式麦胚芽无细胞蛋白质合成系中进行蛋白质合成。合成反应根据[Madin K.et.al.(2000)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，559-564]以及WO00/68412号公报记述的方法实施。图7中示出在26℃下进行3小时蛋白质合成反应后的自体放射照相术进行分析的结果。
若比较图4和图7，发现转录模型存在着明显的差别，即使用涉及本发明方法中的设计及所建立的转录模型时比现有建立的转录模型未发现低分子翻译产物的合成，而发现了任意蛋白质均可进行高效率地合成。
另一方面，通过使用上述的设计及其所建立的引物使用由PCR得到的转录模型，按昭WO00/68412号公报记述的透析膜的透析法进行24小时的无细胞蛋白质的合成。将各反应液的1μl通过SDS凝胶电泳将蛋白质涂成考马氏亮蓝色彩，其结果示于图8，图中的星状标记表示由各遗传基因合成的蛋白质带。由各染色带图案发现可高效率地合成任意一种蛋白质。通过测定带的染色强度可以发现每1ml反应溶液，其25kDa蛋白质的合成量为0.5mg、18kDa蛋白质的合成量为3.2mg、44kDa蛋白质的合成量为1.2mg、27kDa蛋白质的合成量为1.3mg。
实施例3(使用由PCR法建立的转录模型的稀释方式麦胚芽无细胞蛋白质合成法)利用实施例2的透析膜的连续式无细胞蛋白质合成法，虽具有高效率，但操作十分繁杂。因此，作为更简便的方法，在合成含有低浓度胚芽提取液的无细胞蛋白质合成用反应溶液中实施了现有的间歇式无细胞蛋白质的合成反应。
在这种方法中，使用了由现有已知的间歇式无细胞蛋白质合成系中使用的组成的反应溶液[Madin K.et.al.(2000)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，559-564]。首先作为反应溶液，应配制由含有容量为48％容量的麦胚芽提取液(200A260umunits/ml)的下列最终组成1000units/ml核糖核酸酶阻碍物(RNAsin)、30mMHEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸钾、2.65mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、0.5mg/ml核糖核酸酶、1.2mMATP、0.25mMGTP、16mM肌酸磷酸、0.380mM精脒以及20种L型氨基酸(各0.3mM)600μg/ml的GFP翻译的mRNA构成的反应溶液。该mRNA是从由PCR用实施例2记述的方法相同，通过使用上述实施例2中记述的启动子分断型引物转录的mRNA，在5′端具有Ω序列而不具有CAP结构，担当着1896碱基的3′端的非翻译序列。在26℃将上述反应溶液在15分钟前保温(藻青蛋白)后通过添加5倍量的稀释溶液[30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸钾、2.65mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、1.2mMATP、0.25mMGTP、16mM肌磷酸、0.380mM精脒、20种L型氨基酸(各0.3mM)，加以稀释(稀释方式)。
另外，在以氨基酸的摄入量为指标测定蛋白质合成时，使用在稀释溶液中每1ml添加4μCi14C-亮氨酸的溶液。在稀释后重新在26℃下初始蛋白质的合成反应。将其结果示于图9(a)中。纵轴的放射能读数是由单位等量的麦芽提取液量表示。14C-亮氨酸的摄入量，即蛋白质合成反应在现有的间歇方式( )中，在1个小时内停止反应；但在涉及本发明的稀释方式( )中合成反应持续9小时，但与现有的间歇方式相比可合成约8倍量的蛋白质。而且将所得到的蛋白质添加在自体放射照相术中，将其结果示于图9(b)中。图中左侧电子流是表示分子量标记，箭头是表示作为合成反应物的GTP。即使在自体放射照相术中可以查清在稀释方式中合成反应可以持续9小时。另一方面，以完整长度的蛋白质从其移动度合成产物，可储存在反应溶液中。
这里所表示的稀释方式的无细胞蛋白质合成法不包括复杂的操作，即使使用在PCR中建立的转录模型，也可高效率地合成无细胞蛋白质。
实施例4(使用由PCR法建立的转录模型的转录以及连续翻译型稀释方式麦胚芽无细胞蛋白质合成法)
实施例3中的稀释方式麦胚芽无细胞蛋白质合成方法，具有高的翻译效率，但也存在着必须将其它转录的mRNA添加在无细胞蛋白质合成系中的这种操作的繁杂性。因此，实施了一种将现有转录系及翻译系和稀释方式同时搭配的新的转录及连续翻译型稀释方式无细胞蛋白质的合成法。首先配制了下述示出的转录反应用溶液。这里使用的PCR产物是使用在上述实施例2中记述的启动子的分断型引物以及Ampr与Ori间具有互补性的3′侧引物，通过与实施例2相同的方法建立的转录模型中，作为遗传基因插入GFP结构。在37℃下通过将该转录用溶液保温3小时后，合成了mRNA。
转录用溶液(mRNA溶液)(μl) 最终浓度PCR产物 10 0.4μl/μl5×缓冲剂5 1×25mMNTPs 3 3mM111U/μlRnase阻碍物 1 4.4U/μl50U/μlSP6 RNA聚合酶 0.75 1.5U/μl离子交换水(MilliQ) 5.25合计 25另一方面，通过仅改变上述转录溶液组成中的NTPs的最终浓度配制组成为2.5mM或1.5mM的溶液，并分别进行转录反应。而且，这里使用的5×缓冲剂的组成是与实施例1中使用的组成相同。
所得到的mRNA溶液由于镁离子、ATP、GTP浓度比翻译反应的最佳浓度高，所以仅仅通过添加无细胞蛋白质合成反应用麦胚芽提取液，通过这种状态连续，在同一系内不能进行翻译反应。为此，在所得到的mRNA溶液25μl中添加了下述无细胞蛋白质合成用反应溶液。由此镁离子的浓度可稀释到翻译反应的最佳浓度，即达到3.19mM为止，可合成蛋白质。
反应溶液(μl)最终浓度麦胚芽提取物 128％1000mMHEPES-KOH pH7.8 2 30mM4000mM醋酸钾 3.5 100mM1000mM醋酸镁 0 3.19mM10mM精脒 1 0.4mM50mM二硫苏糖醇1.5 2.5mM2.5mM氨基酸混合物 16.6 0.3mM100mMATP 1.3 1.2mM20mMGTP 0 0.33mM500mM肌酸磷酸 4.8 16mM111U/μlRnase阻碍物 0 0.74U/μl15μg/μltRNA 2 0.2μg/μl40μg/μl肌酸激酶 1.5 0.4μg/μl100μCi/ml14C-亮氨酸 3 4μCi/ml离子交换水(Milli Q) 75.8
而且通过该稀释操作，使阻碍翻译反应的的转录基质的残余成分核糖核苷三磷酸以及副产物的焦磷酸降低到1/6。在该操作后，反应温度设定为作为翻译温度的26℃，继续保温。将其结果示于图10。
在图10(a)中，示出了由氨基酸摄入量测定出的GFP的合成结果。NTPS浓度在使用2.5mM(中 )或3mM(大 )的转录溶液时，显示出合成反应可持续9小时，比间歇式( )可合成约8倍量的蛋白质。该合成效率与实施例3中示出的mRNA添加型稀释方式无细胞蛋白质合成系( )的程度相同。
另一方面还示出了图10(b)所得到的蛋白质的自体放射照相术，从该图中也发现了在转录及连续翻译型稀释方式中，加上合成反应可持续9小时，由其移动度合成产物作为整个长度的蛋白质，正储存在反应液中。在转录反应中使用的核糖核苷酸浓度在2.5mM(中 )时，所合成的蛋白质量呈最大值，在SDS-凝胶电泳后，可得到考马氏亮蓝染色法染色的蛋白质图案，在测定GFP染色带的强度时，每1ml反应液的GFP的合成量为0.82mg。
如上所述，使用启动子分断型引物以及Ampr和Ori具有互补性的3′侧的引物，通过采用与实施例2相同的方法建立的转录模型，可实施转录及连续翻译稀释方式麦胚芽无细胞蛋白质的合成法，进而可效率更好、更简便地蛋白质合成。
实施例5(使用由PCR法建立的转录模型的转录及翻译整体型稀释方式麦胚芽无细胞蛋白质合成法)
首先，配制由含有48％容量的麦胚芽提取液(浓度200A260nmunits/ml)按下述最终组成[1000 units/mlRNA核糖核酸酶阻碍物(RNAsin)、30mMHEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸钾、16mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、0.5mg/ml肌酸激酶、2.5mMATP、2.5mMGTP、2.5mMUTP、2.5mMCTP、1500单元/ml的SP6RNA聚合酶、16mM肌酸磷酸1.48mM精脒、20种L型氨基酸(各0.3mM)、25μg/mlDNA]构成的反应溶液。这里所用的DNA是使用上述实施例2中记述的启动子分断型引物以及AMPr与Ori间具有互补性的3′端的引物，并按实施例2记述的方法建立的转录模型，作为遗传基因是插入GFP的结构。通过将上述反应溶液在30℃下培养3小时，转录mRNA。
该合成溶液中的镁离子的浓度以及ATP与GTP的浓度显著高于翻译最佳浓度的浓度值，因此，虽可进行转录反应，但不能进行正常的蛋白质合成反应。为了使蛋白质合成反应开始，通过在mRNA合成后添加上述反应溶液5倍容量的稀释溶液[30mM HEPES-KOH(pH7.6)95mM醋酸钾、0.4mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、0.94mMATP、0.25mMGTP、16mM肌酸磷酸、0.380mM精脒，20种L型氨基酸(各0.3mM)构成，在以氨基酸的摄入量为指标测量蛋白质合成时，对本溶液含有4μCi的14C-亮氨酸]，使镁离子的浓度直至降低到翻译反应的最佳浓度(3.19mM)。通过这种方法发现，可以进行与实施例4相同的蛋白质的合成。
转录及反应整体型或转录及连续翻译型稀释方式无细胞蛋白质的合成法不含有繁杂的操作，是极其简便的，另一方面，通过直接采用由PCR法建立的转录模型，可在蛋白质的无细胞系进行高效率地合成。
发明效果由于本发明可建立具有通用性、高翻译模型活性，且可进行结构简单的无细胞蛋白质合成用的转录模型的设计及其结构，而且还可使用该转录模型的极其简便的无细胞蛋白质合成法。即建立了①保持高翻译模型活性的mRNA的设计；②具有以PCR技术为基础进行高翻译效率的mRNA转录用的通用性，而可从遗传基因的角度建立可控制转录本底的转录型用引物的设计；③可建立采用已建立的无细胞蛋白质合成用转录模型的简便的无细胞蛋白质合成技术。
若根据本发明，即使在克隆为任意传病媒介的遗传基因中准备与具有对该遗传基因互补的序列的5′端与3′端的两种固有引物，则通过采用对全部遗传基因可共同使用的通用性的引物(5′端的3种与3′端的1种)，对于所克隆的任意的遗传基因均可简便高效率地合成无细胞蛋白质。这里所说明的发明成果由于具有不需要向现有的连续式无细胞蛋白质合成方法那样复杂的装置和繁杂的操作等特点，所以可提供面对随着基因组项目的结束而所带来庞大数量的遗传基因的功能解析与结构解析的遗传基因产物(蛋白质)的生产所需要的最基本的重要技术。尤其是面对多被测体用全自动无细胞蛋白质合成机械人的研制等对无细胞蛋白质合成系统的自动化是个十分重要的技术。因此，本发明从包含结构生物化学与生理化学的基础生物学出发，在以至对作为应用的医药研制及生产等广大领域内将做出相当大的贡献。
序列表样本序列表的序列编号1供建立PCR用引物所设计的多核苷酸序列表的序列编号2供建立PCR用引物所设计的多核苷酸序列表的序列编号3供建立PCR用引物所设计的多核苷酸序列表的序列编号4供建立PCR用引物所设计的多核苷酸序列表的序列编号5为建立PCR用引物，根据烟草花斑病毒的Ω序列病毒所设计的多核苷酸序列表 图权利要求
1.一种碱基序列，该碱基序列是通过PCR法制作无细胞蛋白质合成法中使用的3′端非翻译序列的翻译模型分子用的转录模型所使用的3′端的引物的碱基序列；碱基序列1含有能形成在含有将遗传基因克隆的传病媒介的抗药性遗传基因等标记遗传基因的转录终止子序列和一部分Ori的序列间，存在的碱基序列和互补链的碱基序列；碱基序列2在序列表的序列编号1中记述；碱基序列3含有在序列表的序列编号1中记述的主要部分；上述碱基序列1～3中的任意一种和在核糖核酸控制基因条件下可进行杂交或具有这些互补链。
2.一种碱基序列或与此等任意一种互补的碱基序列，该碱基序列是在通过PCR法制作供制造具有无细胞蛋白质合成法中的翻译模型分子的转录模型时使用的5′端的引物的碱基序列；碱基序列4含有具有在RNA聚合酶的启动子的序列与部分互补的碱基序列；碱基序列5序列表的序列编号2或序列表的序列编号3中记述；碱基序列6含有序列表的序列编号3中记述的碱基序列；碱基序列7含有上述碱基序列5或6中的主要部分；在上述碱基序列4～7中的任意一项的碱基序列与在核糖核酸控制基因条件下可进行杂交。
3.一种转录模型的建立方法，该方法是在通过PCR法制作供制造无细胞蛋白质合成法中使用的翻译模型分子的转录模型时使用的5′端的引物的碱基序列。其特征在于在使用由两种不同的碱基序列构成的两种多核苷酸(A)、(B)用作5′端的引物、由PCR建立转录模型的方法中，该两种PCR用引物的碱基序列应满足仅由该引物的任意一种建立的DNA不发生转录的条件，该一种引物从5′端在至少含有启动子功能部位一部分的碱基序列上具有互补的序列，但至少在该启动子的3′端的RNA聚合酶识别部分，有一部分不含有互补的碱基序列构成的多核苷酸(A)；该其它一种引物的从该启动子的3′端在至少含有RNA聚合酶识别部位一部分的序列上具有互补的碱基序列，但该启动子的5′端，由在启动子的功能部位上至少不具有碱基序列互补的的碱基序列构成的多核苷酸(B)。
4.根据权利要求3记述的转录模型建立方法，该方法使用在多核苷酸(B)的碱基序列上，而且相继插入GA或GAA序列，将mRNA的翻译放大赋于其下游的碱基序列；而且，由将翻译初始密码ATG或目的遗传基因的ORF(翻译框)的一部分或在不含有ORF的ORF的上游的碱基序列上，由碱基序列连接互补的的碱基序列构成的多核苷酸。
5.根据权利要求4记述的转录模型的建立方法，其特征在于在多核苷酸的翻译部分的初始密码与ORF间，编入组氨酸标记和GST(谷胱苷肽S-转换酶)、myb等标记或抗原表位合成用的碱基序列。
6.一种转录与翻译整体型稀释方式的无细胞蛋白质合成方法，该方法在用PCR法制作供制造中使用的翻译模型分子的转录模型中，作为该转录模型的5′端的引物，使用由序列表的序列编号2中记述的碱基序列构成的多核苷酸；由连接在序列表的序列编号3中记述的碱基序列上的烟草花斑病毒的Ω序列，和作为翻译初始密码NTG的碱基序列构成的多核苷酸；以及由连接序列表的序列编号5中记述的碱基序列上作为翻译初始密码的ATG，和其后作为转录目的的遗传基因固有的ORF的5′端碱基序列的碱基序列构成的多核苷酸；作为该转录模型的3′端的引物，使用由序列表的序列编号1中记述的碱基序列构成的多核苷酸。
7.一种引物组，该引物组是供采用PCR法制作转录模型用的引物组，作为5′端的引物，含有多核苷酸(A)由从启动子的5′端，在至少含有启动子功能部位一部分的碱基序列上具有互补的序列，在该启动子的3′端的RNA聚合酶识别部位的一部分的碱基序列至少不具有互补的碱基序列构成；多核苷酸(B)由从该启动子的3′端，在至少含有RNA聚合酶识别部位一部分的碱基序列上具有互补的碱基序列，但在至少该启动子的5′端的启动子功能部位由不具有互补碱基序列的碱基序列构成；多核苷酸(C)在多核苷酸(B)上，继可以进行退火的碱基序列，不含有翻译初始密码ATG或目的遗传基因的ORF(翻译框)的一部分，或不含有ORF的ORF的上游的碱基序列上连接的互补碱基序列；作为3′端的引物，含有在含有将遗传基因克隆的传病媒介的抗药性遗传基因等标记遗传基因的转录终止子序列和一部分Ori间存在的、可形成碱基序列和互补链的碱基序列的多核苷酸。
8.根据权利要求7所述的引物组，即多核苷酸(B)从启动子的3′端，在至少含有RNA聚合酶识别部位一部分的碱基序列上具有互补的碱基序列，继该启动子的5′端的启动子功能部位，在至少不具有互补的碱基序列的碱基序列后插入GA或GAA序列，在其下游另连接赋予mRNA翻译放大的序列；而且由在不含有翻译初始密码ATG或目的遗传基因的ORF的ORF上游的碱基序列上，连接互补的序列的碱基序列构成的多核苷酸。
9.一种引物组，由PCR法制作为建立无细胞蛋白质合成方法中使用的翻译模型分子用的转录模型，作为5′端的引物，含有该引物组由序列表的序列编号2中记述的碱基序列构成的多核苷酸；由连接在序列表的序列编号3中记述的碱基序列上，作为由烟草花斑病毒的Ω序列和作为翻译初始密码ATG的碱基序列构成的多核苷酸；以及继序列表的序列编号5中记述的碱基序列中，作为翻译初始密码的ATG及其后连接作为转录目的的传基因固有的ORF的5′端碱基序列构成的多核苷酸；作为3′端的引物，含有由序列表的序列编号1记述的碱基序列构成的多核苷酸。
10.权利要求3至权利要求6中任意一项记述的建立方法制作的转录模型，该模型是无细胞蛋白质合成法中使用的高效率mRNA合成用的转录模型。
11.使用权利要求7至权利要求9任意一项中记述的引物组，由PCR合成的转录模型是无细胞蛋白质合成法中使用的高效率mRNA合成用的转录模型。
12.由权利要求3至权利要求6中任意一项记述的建立方法制作的转录模型的权利要求10至权利要求11中记述的转录模型，将所转录的mRNA用作翻译模型的无细胞蛋白质合成法。
13.根据权利要求项12中记述的无细胞蛋白质合成方法，是在合成mRNA后由凝胶过滤进行精制。
14.一种转录及连续翻译型稀释方式的无细胞蛋白质的合成法，其特征在于该方法是采用权利要求3至权利要求6中的任意一项记述的建立方法制作转录模型，并通过转录溶液进行转录反应后，添加无细胞蛋白质合成用反应溶液，在添加后的反应溶液中，至少将镁的浓度降低到翻译的最佳浓度；同时降低该反应溶液中的转录基质及转录副产物的浓度以延长翻译反应的持续时间。
15.一种转录及翻译整体型稀释方式的无细胞蛋白质合成法，其特征在于该方法采用权利要求3至权利要求6中任意一项记述的建立方法制作转录模型，在通过无细胞蛋白质合成用反应溶液进行转录反应后，添加稀释溶液加以稀释，在该反应溶液中，至少将镁的浓度降低到翻译最佳浓度；同时降低该反应溶液中的转录基质及转录生成物的浓度，延长反应的持续时间。
16.一种转录及连续翻译整体型稀释方式的无细胞蛋白质合成法，其特征在于在反应容器中添加cDNA，通过实施权利要求3至权利要求6中的任意一项记述的转录模型的建立方法，在该反应容器中制作转录模型，由含有RNA聚合酶和4种多核苷酸三磷酸的转录用溶液进行转录反应后，进一步添加无细胞蛋白质合成溶液，将反应溶液中的镁浓度至少降低到翻译最佳浓度，进行翻译反应。
17.一种转录及翻译整体型稀释方式的无细胞蛋白质合成法，其特征在于在反应容器中添加cDNA，通过实施权利要求3至权利要求6中的任意一项记述的转录模型的建立方法，在该反应容器中制作转录模型，添加含有RNA聚合酶和4种多核苷酸三磷酸的无细胞蛋白质合成反应用溶液进行转录反应后，添加稀释溶液进行稀释，将该合成溶液中的镁浓度至少降低到翻译最佳浓度，进行翻译反应。
18.权利要求14至权利要求17中任意一项记述的无细胞蛋白质的合成方法，该方法将镁浓度降低到翻译最佳浓度，将镁浓度由约1mM降低到约6mM。
19.权利要求14至权利要求18中任意一项记述的无细胞蛋白质的合成方法，该方法在30℃～45℃中实施转录反应，且翻译反应在20℃～30℃下实施。
20.权利要求12至权利要求19中任意一项记述的无细胞蛋白质的合成方法，该方法采用麦胚芽提取物。
全文摘要
本发明的目的旨在提供一种多核苷酸，并提供一种该多核苷酸的转录模型的建立方法等。为设计、建立有通用性、模型活性高、且结构简单的无细胞蛋白质合成用的转录模型用的3’侧PCR引物，在传病媒介抗药性遗传基因等标记遗传基因的转录终止子序列和Ori间形成碱基序列和互补链的各个传病媒介固有的碱基序列构成的多核苷酸；5’侧PCR引物，是两种满足仅使用一种引物不产生从所建立的DNA进行转录条件的引物，在从启动子至少含有启动子功能一部位的碱基序列上具有互补序列的多核苷酸；和从启动子的3’端至少含有RNA聚合酶识别部位的碱基序列上具有互补序列的多核苷酸。
文档编号C12P21/02GK1449444SQ01814809
公开日2003年10月15日 申请日期2001年8月28日 优先权日2000年8月30日
发明者远藤弥重太, 泽崎达也, 小笠原富夫 申请人:远藤弥重太