专利名称：生物测试条的制作方法
技术领域：
本发明涉及电化学分析及临床化学领域。更具体地说，本发明涉及一种新的生物测试条及其制备方法。
背景技术：
目前已有的市售生物测试条，例如测试血液葡萄糖水平的血糖测试条，通常是将生物活性酶(如葡萄糖脱氢酶或葡萄糖氧化酶)与碳糊混合，然后采用丝网印刷技术制作出基于碳糊电极(通常称为厚膜电极)的测试条。
然而，这种碳糊电极存在以下一些缺点。首先，电极中的用酶量较高，因此使生物测试条的成本升高。第二，在用丝网印刷方法制得的电极中，电子传递中介体容易流失，从而使得生物测试条的灵敏度、线性响应和抗干扰性变差。第三，这种生物测试条的储存寿命较短，通常需要冷藏保存，这样就给产品的运输和储存带来了许多困难和不便。另外，用丝网印刷技术制作出的电极其尺寸难以保持稳定，因此，产品的合格率较低。
为了克服上述缺点，本领域中仍然需要有一种新的成本低、互换性好、线性好、抗干扰、能长期稳定保存的生物测试条。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的成本低、互换性好、线性好、抗干扰和/或能长期稳定保存的生物测试条。
本发明的另一目的是提供上述生物测试条的制备方法。
本发明第一方面提供了一种生物测试条，它包含基片，该基片上有工作电极和对电极(兼作参比电极)，所述工作电极上有环糊精、电子传递中介体和生物活性酶形成的包络物，其中所述电子传递中介体选自醌、甲基蓝、甲基紫、二茂铁和二茂铁衍生物。
所述生物测试条的基片可以采用任何本领域技术人员已知的常规材料。这些材料是不导电的、在机械上稳定的材料。这些材料包括，但不局限于陶瓷材料、聚酯材料等。该试条可以制成各种合适的形状，较佳地可制成条状或片状。
在本发明中，基片上的工作电极和对电极可用相同的黄金或铂金材料制成。与现有技术不同的是，在本发明中，是采用微电子方法将工作电极和对电极施加到基片上。适用于本发明的微电子方法例如包括气相沉积(例如真空蒸发、溅射涂布和化学气相沉积)、离子溅射沉积、阴极电弧沉积、电镀、化学镀、真空镀膜及光刻等方法。这些方法是微电子领域中将金属施加到基材上所常用的方法。为了获得有一定图案的沉积层/膜，还可采用掩模、光刻、定向离子束和沉积源束等本领域已知的方法。
所述生物活性酶是能与待测化学物质发生反应的酶。因此，酶的类型取决于待测化学物质的类型。在本发明中，较佳的生物活性酶选自葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶和半乳糖氧化酶。这些酶均可市售购得。然而，本领域技术人员也可对本文公开的内容加以改进，以使本发明能采用其它类型的酶或测试其它化学物质。所有这些改动均包括在本发明的范围内。
本发明应用了超分子化学原理，通过环糊精和电子传递中介体形成包络物(inclusive)，然后再与生物活性酶溶液混合，使得所固定的酶能在较恶劣条件(例如高温)下长期保持高生物活性。另外，该方法还能使包合在酶层中的电子转移(迁移)中介体在水溶液中长期稳定而不流失，从而使测试时的外加电位得以较大幅度降低，减少测定时血样中其它物质的干扰。
环糊精是一类环状寡糖分子，它包含吡喃葡萄糖亚基，具有环形圆柱状空间结构。分子中极性(亲水性)羟基朝向结构外，非极性(亲油性)主链碳和醚氧衬在环的内腔中。该空腔能通过非共价方式结合形成包络物来容纳(接受)活性组分。
在本发明中，可采用的环糊精例如是含有6个、7个和8个吡喃葡萄糖分子的环糊精，即分别是α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精。另外，可对环糊精分子的外部羟基取代基可加以改进，以形成有其它所需增强效果的衍生物。这些环糊精衍生物的例子是烷基化衍生物，如2，6-二甲基-β-环糊精；羟基烷基化衍生物，如羟丙基-β-环糊精；支链衍生物如二葡糖基-β-环糊精；磺烷基衍生物，如磺基丁基醚-β-环糊精；和羧甲基化衍生物，如羧甲基-β-环糊精。这些衍生物的使用也在本发明范围内。
本发明中采用的电子传递中介体选自醌、甲基蓝、甲基紫、二茂铁和二茂铁衍生物(如甲基二茂铁、二茂铁羧酸、二茂铁乙醇等)。本发明所用的环糊精和电子传递中介体均可从商业途径获得。
本领域技术人员无需过多实验即可确定环糊精、电子传递中介体和生物活性酶的用量。通常，环糊精的浓度宜为0.05-0.1克/毫升，较佳的为0.06-0.09克/毫升，最佳的为0.08克/毫升。电子传递中介体的用量无需严格控制，可以过量，其浓度通常可以在0.5-2毫克/毫升之间。
在本发明的一个较佳实施方案中，所述测试条上还可任选地覆盖上一层抗干扰膜。该抗干扰膜能进一步保持固定化酶层的长期稳定性，并提供抗干扰性能。所述抗干扰膜宜具有以下特征1)具有可控制的孔径；2)具有自粘性；3)具有生物相容性。制备所述抗干扰膜的材料包括，但不局限于，明胶、壳聚糖、醋酸纤维素膜等，其中以壳聚糖为最佳。
本发明另一方面提供了一种制备本发明上述生物测试条的方法，该方法包括下列步骤a)在基片上形成工作电极和对电极；b)混合环糊精、电子传递中介体和生物活性酶形成包络物，其中所述电子传递中介体选自醌、甲基蓝、甲基紫、二茂铁和二茂铁衍生物；c)将步骤b)获得的包络物施加到工作电极表面上；d)使施加的包络物干燥。
环糊精和电子传递中介体以及生物活性酶通常可在加热或不加热的条件下，在合适装置中反应形成包络物。制得的包络物可用任何常规方式或装置施加到工作电极上，其中较佳的是采用微量进样器进行加样。
该试条可在不破坏酶活性的条件和温度下(通常是室温下)干燥。
与现有技术相比，本发明具有下列几个优点首先，包络物的形成使得所固定的酶能在较恶劣条件(例如高温)下长期保持高生物活性，所得产品能在室温、甚至较高温度下长期保存而不丧失酶活性。其次，与丝网印刷方法相比，本发明方法所用的酶量较少，从而降低了生物测试条的生产成本。第三，由于本发明采用包络物来固定电子转移中介体，因此防止了电子转移中介体的流失，从而使测试时的外加电位得以较大幅度降低，减少测定时血样中其它物质的干扰。
本发明采用铂作对电极兼作参比电极，其表面无需氯化。本发明所用的微电子平面加工方法简化了加工工艺，使得产品尺寸保持稳定，成品合格率高于95％，且该微电子方法也适合于本发明的包络物酶固定方法。另外，在生物测试条上覆上一层生物抗干扰膜，尤其是壳聚糖膜，从而能够进一步提高测定的选择性、抗干扰性和生物相容性。本发明生物测试条可用于临床检测、食品检验等各个领域。
图1是平面单圆盘电极的示意图，图中标号(1)表示参比电极(兼作对电极)，(2)表示工作电极。
具体实施例方式
下面将结合实施例来进一步具体描述本发明。然而，应当理解，本发明并不局限于这些具体的实施例。
实施例1葡萄糖测试条的制备1)首先，以4×7cm2陶瓷片为基体，真空溅射钛(50nm)和铂(200nm)。再用剥离刻蚀，制得直径为2毫米的铂盘工作电极，以及围绕工作电极的铂圆弧参比电极(见图1)。
2)称取3.5克环糊精(上海生化试剂公司)，加入50毫升蒸馏水，在60℃水浴中溶解。边搅拌边滴加50毫升二茂铁乙醇(日本东京化成)溶液(1.2克/100毫升)，60℃水浴下搅拌4小时。冷却后离心分离，取出沉淀，用四氰呋喃洗涤三次，再用蒸馏水洗涤三次后真空干燥。
3)医用棉签蘸取分析纯丙酮轻轻擦洗电极表面数次，再用分析纯无水乙醇擦洗电极表面。然后，将该所得电极置于培养皿中晾干备用。
4)将电极与丝网图形精确对齐，印上水性特粘台板胶，然后，将电极与丝网剥离。
5)称取21毫克葡萄糖氧化酶(美国SIGMA公司，10000单位/0.42克)，用蒸馏水溶解并稀释至0.5毫升，使酶含量为1000U/ml。
6)称取上述制得的二茂铁环糊精包络物20毫克以及100毫克化学纯明胶，加入5毫升左右的蒸馏水(约为总体积的30％)，用微火在水浴中加热搅拌使之溶解。
7)取上述配制好的酶溶液10微升和二茂铁溶液100微升，充分搅拌，滴加此混合溶液1.5微升于工作电极表面。使溶液覆盖整个工作电极表面。使测试条在培养皿中室温下干燥2～3天后。
8)将0.22U孔径的微孔醋酸纤维素滤膜覆盖在电极表面上，并用干净的载玻片轻按压紧。用美工刀沿陶瓷片切割线切割滤膜。
如在上述制得的固定酶的电极上覆上壳聚糖作抗干扰膜时，可省去操作步骤4)。
9)将制成的酶电极置于pH＝7的磷酸缓冲液中浸泡2小时，干燥过夜。
实施例2胆固醇测试条的制备重复实施例1的各个步骤，只是在步骤5)中用胆固醇氧化酶(购自美国SIGMA公司)代替葡萄糖氧化酶。结果制得用于测试胆固醇的测试条。
实施例3试条性能试验a)试条互换性以实施例1制得的50个试条为一批，从中随机抽取10个为一组，在6.0毫摩尔/升的葡萄糖溶液中测定响应电流。经统计学处理后得出，四批共17组试条测得的相对偏差小于10％。同时，试条在血清中的相对标准偏差为7％。这些结果表明，蛋白质对试条互换性没有很大影响，本发明制得的试条适于血样分析。
b)试条的线性响应取实施例1的试条在葡萄糖溶液和标准血清样品中测试，结果表明，其在0-16.0毫摩尔/升葡萄糖浓度范围内有很好的线性响应。
c)寿命试验从实施例1不同批中选取若干试条样本，将试条与恒电位仪相联，测定电位为0.65V vs Pt。先将试条插在磷酸盐缓冲液中，当电流降至0.25μA时，取出拭干，再将试条插在6.0毫摩尔/升葡萄糖溶液中，记录1.5分钟的响应电流，并记下室温，取出试条用水冲洗后，拭干，室温保存。过若干日进行第二次测试，将所用数据均校正到20℃时的数据。将第一次测得电流值与最后一次测得电流值相比较，计算出剩余酶活性的百分数作为试条寿命的表征。寿命试验的结果见表1a和表1b，表中数据以μA为单位，括号内的数值为校正到20℃时的电流值。
表1a试条使用寿命试验
表1b试条使用寿命试验
结果表明，试条在室温下保存半年(曾经历38℃高温数天)后，试条酶活性为原酶活性的85～99％，这表明试条能在室温下、甚至是高温日(36℃-40℃)下长期保存而不丧失酶活。
d)抗干扰试验a.葡萄糖溶液试验取维生素C(Vc)和尿酸作为血液中有代表性的干扰物质，Vc和尿酸加在6毫摩尔/升葡萄糖中的浓度接近血液中的最高正常值(Vc＝0.08毫摩尔/升，尿酸＝0.3毫摩尔/升)。随机从实施例1制得的试条中抽取样本，将样本试条与恒电位仪相联，取0.65VvsPt为测试电位，滴一滴磷酸盐缓冲液于试条上，当电流降至0.25μA时，断开恒电位仪，拭干，再滴上一滴6.00毫摩尔/升葡萄糖溶液，测定1.5分钟的响应电流。另取试条分别用含维生素C(或尿酸)的6.00毫摩尔/升葡萄糖溶液代替6.00毫摩尔/升葡萄糖溶液，分别测量1.5分钟时的响应电流，两者之差即为试条对维生素C(或尿酸)的响应电流。多组测量，计算响应电流增加的平均百分数。
b.血清试验血清试验方法基本上如上所述，但用标准血清和含维生素C(或尿酸)的标准血清代替6.0毫摩尔/升的葡萄糖溶液和含维生素C(或尿酸)的6.0毫摩尔/升葡萄糖溶液。
测试结果表明，维生素C或尿酸的加入几乎不会给实际血样测定带来结果偏差。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
权利要求
1.一种生物测试条，它包含基片，该基片上有工作电极和对电极，其特征在于，所述工作电极上有环糊精、电子传递中介体和生物活性酶形成的包络物，其中所述电子传递中介体选自醌、甲基蓝、甲基紫、二茂铁和二茂铁衍生物。
2.根据权利要求1所述的生物测试条，其特征在于，所述生物活性酶选自葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶和半乳糖氧化酶。
3.根据权利要求1所述的生物测试条，其特征在于，所述基片上的工作电极和对电极用选自化学气相沉积、离子溅射沉积、阴极电弧沉积、电镀、化学镀、真空镀膜及光刻的方法制成。
4.根据权利要求1所述的生物测试条，其特征在于，所述测试条上还覆盖了一层抗干扰膜。
5.根据权利要求4所述的生物测试条，其特征在于，所述抗干扰膜选自明胶、壳聚糖、醋酸纤维素膜。
6.根据权利要求5所述的生物测试条，其特征在于，所述抗干扰膜是壳聚糖膜。
7.一种制备权利要求1所述的生物测试条的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤a)在基片上制成工作电极和对电极；b)混合环糊精、电子传递中介体和生物活性酶，形成包络物，其中所述电子传递中介体选自醌、甲基蓝、甲基紫、二茂铁和二茂铁衍生物；c)将步骤b)获得的包络物施加到工作电极表面上；d)使施加的包络物干燥。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤d)后将抗干扰膜覆盖在所得测试条上。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗干扰膜选自选自明胶、壳聚糖、醋酸纤维素膜。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤a)中采用选自化学气相沉积、离子溅射沉积、阴极电弧沉积、电镀、化学镀、真空镀膜及光刻的方法形成工作电极和对电极。
全文摘要
本发明提供了一种生物测试条，该测试条具有一个基片，该基片上有工作电极和对电极，所述工作电极上有环糊精、电子传递中介体和生物活性酶形成的包络物，其中所述电子传递中介体选自醌、甲基蓝、甲基紫、二茂铁和二茂铁衍生物。该试条的生产成本低、互换性好、抗干扰、能在室温甚至高温下长期稳定保存。本发明还提供了制备该试条的方法。
文档编号C12Q1/32GK1461810SQ0211061
公开日2003年12月17日 申请日期2002年1月23日 优先权日2002年1月23日
发明者王荣, 吴霞琴, 章宗穰, 朱建中, 张国雄 申请人:上海师范大学