专利名称：St13基因5'端启动功能区序列及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA序列，更具体地，本发明涉及的序列包含有调控与其相接的基因的转录的功能。可构件表达载体，用于基因功能研究与开发。
背景技术：
ST13(又名SNC6、HSU17714)是发明人对正常人肠粘膜组织和肠癌组织进行减式杂交时克隆到的一个人类基因。ST13的全长cDNA已得到并进行了序列分析，且登录于GenBank(登录号U17714)。该3145bp长的cDNA编码一个由369个氨基酸残基组成的孕激素受体相关分子伴侣，可以与Hsp70相互作用。发明人已将此基因定位于人染色体22q13。GenBank收录的一个编号为Z98048的PAC克隆序列覆盖了整个ST13基因。据此，发明人分析了ST13的基因组结构，发现ST13共有12个外显子，编码区跨度为32017bp(在Z98048序列中nt71529至nt39512)，作了进一步的研究，推进了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA序列，具有调控与其相接的基因的转录的功能，可构件各种哺乳动物的表达载体，用于基因功能的研究与基因工程的开发。
本发明提供的DNA序列，位于ST13基因5’端启动功能区，该功能区位于1-1814片段，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
本发明提供的DNA序列内含有二个增强转录功能区，分别位于1-471片段、1262-1478片段，含有一个抑制转录功能区，位于471-1262片段，还含有一个基本转录功能区，位于1478-1814片段。
本发明提供的DNA序列的部分或全部，或基于该DNA序列的部分或全部而改造的序列可构建表达载体。
本发明提供的DNA序列内含的二个增强转录功能区的部分或全部序列，或者基于其改造的部分或全部序列可构建表达载体。
本发明提供的DNA序列内含的一个抑制转录功能区的部分或全部序列，或者基于其改造的部分或全部序列可构建表达载体。
本发明提供的DNA序列该DNA序列内含的一个基本转录功能区的部分或全部序列，或者基于其改造的部分或全部序列可构建表达载体。
由本发明所提供的DNA序列及内含的各功能区的DNA序列，以及基于这些序列而改造的部分或全部序列所构建的表达载体，在基因治疗和基因工程生产的药物中的应用。
图1为ST13的基因组结构顺序。
图2为启动功能区DNA序列内增强转录功能区、抑制转录功能区及基本转录功能区。
图3为用ST135’端区域片段构建的荧光素酶报告载体。
图4为ST13基因5’端不同片段转染后荧光素酶活性分析。
具体实施例方式
通过以下实施例对本发明的技术特征作详细描述。
实施例一大肠癌相关基因ST13(SNC6)的基因组结构分析及其5′端区域的克隆一、材料大肠杆菌XL1-Blue，美国Stratagene公司产品。常规保存于含四环素LB平板。所有培养基，限制酶和其它工具酶均购自美国Life Technologies公司。
二、ST13(SNC6)的基因组结构分析及其5′端区域的克隆应用美国国立卫生图书馆基因库(NCBI)的Blast程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，在人类染色体22q13(编号Z98048)的PAC克隆上(408N23)找到ST13(SNC6)的全长cDNA的同源序列。通过对ST13(SNC6)的基因组结构顺序的分析，根据ST13(SNC6)的全长cDNA的序列设计其5′端区域PCR引物如下5’-GGT ACC TTT AGT CAG GCT GGGGAG-3’(上游)，5’-CCT CGA GGT AGG GAG GTG GTG GGC GA-3’(下游)。提取正常人外周血淋巴细胞的基因组DNA作为PCR反应模板，进行扩增。将PCR产物(1894 bp)克隆到pGEM-T-Easy载体(Promega，USA)上，经限制性内切酶KpnI，XhoI，EcoRI，MluI和SacI酶切产生不同大小的片段(见下文)。所有片段均亚克隆至荧光素酶报告载体pGL2-Basic，pGL2-Promoter andpGL2-Enhancer(Promega，USA)上。见SEQ ID NO 1核酸序列。
三、结果依据PAC克隆408N23(GenBank数据库编号Z98048)对ST13(SNC6)的全长cDNA进行序列分析，发现ST13(SNC6)共有12个外显子，在Z98048序列中覆盖了32017bp(nt71529至nt39512)。参见表1和图1。表1.ST13基因中外显子和内含子的分布长度(bp) 在Z98048中的位置exon184 71529-71345intron 555071344-65795exon58 65794-65737intron 245365736-63284exon76 63283-63208intron 338463207-59824exon71 59823-59753intron 414659752-55607exon67 55606-55540intron 473855539-50802exon85 50801-50717intron 131 50716-50585exon111 50584-50474intron 288850473-47586exon103 47585-47483intron 161147482-45871exon117 45870-45754intron 116445753-44589exon49 44588-44540intron 239644539-42144exon134 42143-42010intron429 42009-41581exon 207241580-39513用PCR法扩增5′端1894bp长度的DNA片段(1至1894)，经KpnI，XhoI，EcoRI，MluI和SacI酶切产生一系列片段。这些不同大小的片段亚克隆到pGL2荧光素酶报告载体上，并可在进一步分析中用于转染。参见图2、图3(其中1，7，13φX174/HaeIII分子量标记；2pGL2-Basic载体；3pGL2-Basic-1894/KpnI+XhoI酶切；4pGL2-Basic-1423/KpnI+XhoI酶切；5pGL2-Basic-632/MluI+XhoI酶切；6pGL2-Basic-416/SacI+XhoI酶切；8pGL2-Enhancer载体；9pGL2-Enhancer-1894/KpnI+XhoI酶切；10pGL2-Enhancer-1423/KpnI+XhoI酶切；11pGL2-Enhancer-632/MluI+XhoI酶切；12pGL2-Enhancer-416/SacI+XhoI酶切；14pGL2-Promoter载体；15pGL2-Promoter-1894/KpnI+XhoI酶切；16pGL2-Promoter-1423/KpnI+XhoI酶切；17pGL2-Promoter-632/MluI+XhoI酶切；18pGL2-Promoter-416/SacI+XhoI酶切)。
实施例二ST13基因5’端启动功能区序列及应用研究一.材料ST13基因5’区域片段亚克隆至荧光素酶报告载体pGL2-Basic，pGL2-Promoter and pGL2-Enhancer(Promega，USA)上(见实施例一)，大肠癌细胞系SW620获自ATCC，胎牛血清、RPMI1640培养液为Life Technologies，Inc.产品，转染试剂SuperFect为美国QIAGEN公司产品，荧光素酶检测系统为美国Promega公司产品，VICTORTM多功能酶标仪为芬兰Wallac Oy公司产品。
二、转染大肠癌细胞系SW620在含10％胎牛血清的RPMI1640(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)中培养。转染前一天以2×105个/孔的细胞密度接种于24孔板。转染当天，在1.5ml eppendorf管中将各种荧光素酶报告载体质粒DNA各2μg溶于RPMI1640(不含血清和抗生素)，终体积60μl，加入5μlSuperFect转染试剂(QIAGEN，美国)，充分混匀。室温放置7分钟，加入350μl RPMI1640(含血清和抗生素)，充分混匀，用PBS洗涤24孔板上SW620细胞一次，加样转染复合物至细胞(每种质粒转染3孔)。37℃、5％CO2条件下培养细胞3小时，每孔中加入500μl含血清和抗生素的RPMI1640，继续培养至收获。
三、荧光素酶检测转染后48小时收获细胞，用荧光素酶检测系统(Promega，美国)检测荧光素酶活性。操作参照厂家提供的说明用预冷的PBS洗涤细胞两次，每孔加1×裂解液50μl。将细胞裂解液转入1.5ml eppendorf管，13,000rpm离心30秒。收集上清贮存于-70℃。检测时，在96孔板上迅速混匀20μl上清和100μl荧光素酶检测试剂(二者均预温至室温)，在VICTORTM多功能酶标仪(Wallac Oy，芬兰)上读取数据。
四、结果参见表2和图4，所有转染含上述5′端片段重组质粒的SW620细胞均表现出荧光素酶活性。检测结果显示转染了三个含1894bp长度片段的pGL2载体的细胞荧光素酶活性最高，转染了三个含416bp片段的pGL2载体的细胞活性最低，而转染了含632bp片段的pGL2载体的细胞荧光素酶活性高于转染了含1423bp片段的pGL2载体的细胞。这些数据提示ST13表达的基本转录起始因子(启动子)位于1478至1814；两个转录增强因子(增强子)位于1至471和1262至1478；一个转录抑制因子(沉默子)位于471至1262的片段上。表2.不同重组质粒转染的SW620细胞提取物荧光素酶活性
图4中Blank无载体转染对照；ControlpGL2-Control载体转染；B1.9pGL2-Basic-1894载体转染；B1.4pGL2-Basic-1423载体转染；B0.6pGL2-Basic-632载体转染；B0.4pGL2-Basic-416载体转染；P1.9pGL2-Promoter-1894载体转染；P1.4pGL2-Promoter-1423载体转染；P0.6pGL2-Promoter-632载体转染；P0.4pGL2-Promoter-416载体转染；E1.9pGL2-Enhancer-1894载体转染；E1.4pGL2-Enhancer-1423载体转染；E0.6pGL2-Enhancer-632载体转染；E0.4pGL2-Enhancer-416载体转染。
通过利用本发明提供的DNA序列，可以构建各种哺乳动物的表达载体，用于基因功能研究和基因工程的开发。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。SEQ ID NO1GGCTCCTTTA GTCAGGCTGG GGAGAGCCTT TCAAATAAAA GCAAATTCCA GGCCTGGGGCGGTGGCTCAG AGAGGAGGGT GGATCGCTTG AGGCCAGGAG TTCGAGATCA GCTTGGCCAACGTGGCAAAA CCTGGTTTCT ACTACAATTA CAAAAATTAG CCAGGCGTGG TGGCACACGCCTATAATCCC AGCTACCTCG GGAGGCTGAG GCACGAGAAT TGCTTGAACT CAGGAGGCAGAGGTTGCAAA TGAGCAGAGA TTGCCACTGC ACTCCAGTCT GAGCAACAGA ATGAGAGCCTGTCTCAAAAA AAGACTGAAA AATTGCACAT CTTTCTTTTC ACCTAATCCC ACGGAGAGTTGTCTTTCTGC AGCTTTACTA TGAGAACTGA AGAACAAGTT CTGTGCACTG GACAATAACTTTTTATTTTT TATAGTAAGA AGTCGATGTA ATTAACATTC CATTTTAAAT GAATTCAAGTATATCAACAT AAACATATGC CAAGACATAG CTTTGATGTC AAATACCATA CGTTCTGGTTCACACATTGT TCATATATTG ACCCAAAAAA CTGAAATACG ATCCAATGGC AGATCCGCCTGCAAGGAAGG TGATTCAGTT TTCACTGATT AAGCTTTATG TTCATCAGAT TAATTGCTCGCAATAGAGGA CACCCTACAA AAAATTATTC TCCTTATCCT TCGTCTTGTC TTTGCAAACAGGACTTTCAG ACACAGAACG CCCCAGAAGT ATTTCGAAAC AGTTACCTCT CCTAAGAGGAGCTGCTGAAA GAATTTGTTA CTAAACATGC TTCGTGTATA TTCTGGAGCA AGCTCTCACGCCTAACAGAA ACAAGAGCTA CTTGATGTGA GACACTTTGT CACTTAAGTG TGATAATTGCCACAACTTCG GAGTCCGAGT AACTTGGAAG ACAGCCCCTC TGGGGGATGG CACACTTTTCTCTCTGCAGT CATTTCGGCT TCACAAAATA CCTCAACGGT AGAGAACACA CTGGGCCCACCCCTTTCCAG GAGCAGCCGG TATAGAAGAA ATCCGCGGAG CACAGAGGGT TGGGGAGCGGAGGCCCCACC AGGAGAAGGG TCAGCCGAAC CAGGGATCGC CTGAGACCAA CTTGGGTCCCTCCAGGGGAC ACCATGGGAG GAGACCGTGG GAGAAGAGTC TAACCTGAGA GGCCGCGGACGTTTGCTACA GCGGGAACCA GCTTGGGGGC TGAGAGCAGC CAAGGCATTA CGGCCTAACTCACGCGTCGG GAAGAGAAAG AGGGTAACGA CGGGGAACGC AACCGCCTGC AGGGCCGCGTCGCCAGGAAA CCGGGCCAGC CGCACCTCCC CTTCCGGCGG AGGCGGCTCG CGGGCCTTCCTTGCGCGGCG GCGCAGGTTG TGACGTCATG CCCCGAGCTG GGACCGACCC TCCGGCTCCACGCCCTTTTT TTTTTTTTTT TTTAGGTCCC GGGCGTTGAG CTCTACTCAG TGCACGCAGCCACACAATAT GCTCTTGGAC GTCGCCCCCT GGAGGGGATG TTATCTCCCG CCTCCTTGAAGTCGCCCATT TCTGGGGTTG CCCCATCCAG GGAGCTGGTT CCTAGTTAAG AATATGAGAATGTATGCGCA GGGAGGCAGG CAACAGCACG AACAGCCACG CTTCTAGAAG ATTCTAGGGAGCGCGCAGGA GCAGCGCAGA GGGAGTAGGA ATGAGCAGGC GGAGGACCCG AGGTCACGAGACCGTTGGGT GGGAGGAGCC AGCGGCCGGG GAGGTTCTAG TCTGTTCTGT CTTGCGGCAGCCGCCCCCTT CTGCGCGGTC ACGCCGAGCC AGCGCCTGGG CCTGGAACCG GGCCGTAGCCCCCCCAGTTT CGCCCACCAC CTCCCTACCA TGGA
权利要求
1.一种DNA序列，位于ST13基因5’端启动功能区，其特征是该功能区位于1-1814片段，具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的DNA序列，其特征是该DNA序列含有二个增强转录功能区，分别位于1-471片段、1262-1478片段，含有一个抑制转录功能区，位于471-1262片段，还含有一个基本转录功能区，位于1478-1814片段。
3.根据权利要求1所述的DNA序列，其特征是基于该DNA序列的部分或全部构建的表达载体。
4.根据权利要求1所述的DNA序列，其特征是基于该DNA序列的部分或全部而改造的序列构建的表达载体。
5.根据权利要求2所述的DNA序列，其特征是它内含的二个增强转录功能区的部分或全部序列，或者基于其改造的部分或全部序列构建的表达载体。
6.根据权利要求2所述的DNA序列，其特征是基于它内含的一个抑制转录功能区的部分或全部序列，或者基于其改造的部分或全部序列构建的表达载体。
7.根据权利要求2所述的DNA序列，其特征是它内含的一个基本转录功能区的部分或全部序列，或者基于其改造的部分或全部序列构建的表达载体。
8.根据权利要求1-2所述的DNA序列，其特征是由这些功能区所构建的表达载体在基因治疗和基因工程生产药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种DNA序列，该序列位于ST13基因5’端启动功能区。本发明提供的DNA序列内含有二个增强转录功能区，一个抑制转录功能区和一个基本转录功能区，具有调控与其相接的基因的转录的功能。可构件表达载体，用于基因功能研究与基因工程开发。
文档编号C12N15/11GK1434120SQ0211062
公开日2003年8月6日 申请日期2002年1月21日 优先权日2002年1月21日
发明者郑树, 曹江, 叶景佳, 耿礼义, 方永明 申请人:浙江大学医学院附属第二医院