一种生物医学分子克隆方法
【专利摘要】本发明公开了一种分子克隆方法。本发明所提供的分子克隆方法采用具有3’-5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶，先将载体和待插入的目的基因扩增出来，然后用限制性内切酶DpnI来破坏甲基化的DNA模板，最后把DpnI的消化产物直接转化到感受态细胞来得到克隆基因的目的。实验证明，本发明所提供的分子克隆方法是非常简单、可靠高效、不需DNA片段纯化回收、无需考虑载体的酶切位点、也不需链接反应的仅以PCR为基础的克隆技术，它可以把任何DNA片段插入到质粒载体内。
【专利说明】一种生物医学分子克隆方法 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于基因工程领域，涉及一种分子克隆方法。 【背景技术】
[0002] 分子克隆是生物医学实验室最常用的方法之一。传统的分子克隆先用PCR扩增基 因片段，然后通过T4DNA连接酶把限制性内切酶消化后的载体和基因 DNA片段连接起来。 尽管这是一个被广泛应用的方法，但它涉及到很多操作步骤，费时费力。也由于操作步骤较 多，使得在基因克隆中一旦出现问题则很难排查问题所在。
[0003] 由于在传统的分子克隆中遇到的种种问题，在过去几十年的时间里，人们试 图研发更简单、高效的克隆方法，这些方法包括：TA克隆、不需连接反应的克隆方法 (ligation-independent cloning method，LIC)和 GATEWAY 重组克隆方法。但是，这些方 法都有自己的局限性。比如，TA克隆是用常规的Taq DNA聚合酶在PCR产物的末端加一个 3' -A接头，然后把PCR产物直接克隆在一个带有互补的具有3' -T接头的TA克隆载体上。 这种方法的缺点是Taq DNA聚合酶的保真度很低，极容易产生一些非目的的突变，而且它还 需要二次克隆，即通过限制性内切酶和连接酶把目的DNA克隆到目的表达载体上。对于早 期的不需连接反应的克隆方法（LIC)，它是利用T4DNA聚合酶上3'-核酸外切酶的活性，在 插入片段末端和载体末端各产生一个相互互补的15bp的5'接头。这种方法需要一些特定 的序列来产生15bp接头。对于GATEWAY重组克隆方法，它是用特定位点的重组技术把供体 载体的目的基因转移到目的载体上，过程繁琐。
[0004] 最近还有一些无需连接反应的分子克隆试剂盒相继问世，如CloneEZ试剂盒 (GenScript USA Inc. , Piscataway，NJ，USA)、一步克隆试剂盒、重叠延伸PCR克隆试剂盒 等。对于CloneEZ克隆试剂盒，它仍然需要对酶切的载体和PCR扩增产物进行纯化，即需要 购买相应的纯化试剂盒及克隆试剂盒。同样，重叠延伸PCR克隆法，它还需要对第一轮PCR 产物(包括载体和插入片段）和第二轮重叠延伸的PCR产物进行纯化，且在第二轮的重叠延 伸PCR时，为了要产生载体和插入片段的连接体，它通常也产生很多杂带。一步快速克隆法 尽管不需要对PCR产物进行纯化，但是它需要两次的连续35个循环的PCR，总共进行70次 循环扩增。第一次35个循环PCR是为了扩增插入片段和线性化载体，第二次35个循环PCR 是为了通过重叠延伸，把载体和插入片段组装成一个单一的线性PCR产物。而且，上述方法 仍然还需要购买相应的纯化试剂盒及克隆试剂盒，费时费力费钱。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种简单快速的分子克隆方法。
[0006] 本发明所提供的分子克隆方法，具体可为如下三种中的任一种：
[0007] 第一种：在出发质粒的位点1处插入目的基因得到重组环形质粒的方法，为如下 (A)或(B):
[0008] (A)当所述目的基因大于120bp且小于3000bp时，所述方法具体可包括如下步 骤：
[0009] (1)引物设计：
[0010] 根据所述出发质粒上所述位点1上游的序列设计用于扩增质粒骨架的反向引物 1，根据所述出发质粒上所述位点1下游的序列设计用于扩增质粒骨架的正向引物1 ;
[0011] 根据待插入的所述目的基因的序列设计用于扩增所述目的基因的正向引物2以 及反向引物2 ;
[0012] 所述反向引物1的5'端和所述正向引物2的5'端有15-17个核苷酸序列反向互 补(具体碱基含量可根据引物中GC含量确定）；所述正向引物1的5'端和所述反向引物2 的5'端有15-17个核苷酸序列反向互补(具体碱基含量可根据引物中GC含量确定）；
[0013] 其中，所述反向引物1和所述正向引物2中反向互补的15-17个核苷酸序列既可 对应所述出发质粒上所述位点1上游的序列，也可对应所述目的基因的5'端的序列。所述 正向引物1和所述反向引物2中反向互补的15-17个核苷酸序列既可对应所述出发质粒上 所述位点1下游的序列，也可对应所述目的基因的3'端的序列。
[0014] (2)PCR 扩增：
[0015] 以所述出发质粒为模板，在具有3'_5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶作用下，用所 述正向引物1和所述反向引物1进行PCR扩增，得到PCR反应产物1 ;
[0016] 以含有所述目的基因的DNA为模板，在具有3' -5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶 作用下，用所述正向引物2和所述反向引物2进行PCR扩增，得到PCR反应产物2 ;
[0017] (3)DpnI消化及转化
[0018] 将所述PCR反应产物1、所述PCR反应产物2和限制性内切酶Dpn I (识别质粒模 板上的甲基化位点，而将其割断）混合，37°C孵育lh?1. 5h (如lh);用孵育后的混合液转 化细菌，培养转化后细菌，获得在所述出发质粒的所述位点1处插入所述目的基因后形成 的重组环形质粒。
[0019] 其中，将所述PCR反应产物1、所述PCR反应产物2和限制性内切酶Dpn I混合时， 所述PCR反应产物1和所述PCR反应产物2的体积比可为1 :1 ;所述限制性内切酶Dpn I 的用量要保证足以将被甲基化的模板彻底去除。
[0020] (B)当所述目的基因小于等于120bp时，所述方法具体可包括如下步骤：
[0021] (1)引物设计：
[0022] 根据所述出发质粒上所述位点1上游的序列，以及待插入的所述目的基因的5'端 序列，设计反向引物1，所述反向引物1的5'端为所述目的基因的5'端序列的反向互补序 列，3'端为所述出发质粒上所述位点1上游的序列的反向互补序列；
[0023] 根据所述出发质粒上所述位点1下游的序列，以及待插入的所述目的基因的3'端 序列，设计正向引物1，所述正向引物1的5'端为所述目的基因的3'端序列，3'端为所述 出发质粒上所述位点1下游的序列；
[0024] 所述反向引物1的5'端和所述正向引物1的5'端有15-17个核苷酸序列反向互 补(具体碱基含量可根据引物中GC含量确定）；
[0025] 其中，所述反向引物1和所述正向引物1中反向互补的15-17个核苷酸序列对应 于来自所述目的基因的序列。
[0026] (2)PCR 扩增：
[0027] 以所述出发质粒为模板，在具有3'_5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶作用下，用所 述正向引物1和所述反向引物1进行PCR扩增，得到PCR反应产物1 ;
[0028] (3 ) Dpn I消化及转化
[0029] 向所述PCR反应产物1中加入限制性内切酶Dpn I (所述限制性内切酶Dpn I的 用量要保证足以将被甲基化的模板彻底去除)，37°C孵育lh?1. 5h (如lh);用孵育液转化 细菌，培养转化后细菌，获得在所述出发质粒的所述位点1处插入所述目的基因后形成的 重组环形质粒。
[0030] 第二种：将出发质粒的位点3和位点4之间的片段替换为目的基因得到重组环形 质粒的方法，所述位点3位于所述位点4的上游，该方法为如下（C)或（D):
[0031] (C)当所述目的基因大于120bp且小于3000bp时，所述方法具体可包括如下步骤 (原理图见图1):
[0032] (1)引物设计：
[0033] 根据所述出发质粒上所述位点3上游的序列设计用于扩增质粒骨架的反向引物 3,根据所述出发质粒上所述位点4下游的序列设计用于扩增质粒骨架的正向引物3 ;
[0034] 根据待插入的所述目的基因的序列设计用于扩增目的基因的正向引物4以及反 向引物4 ;
[0035] 所述反向引物3的5'端和所述正向引物4的5'端有15-17个核苷酸序列反向互 补(具体碱基含量可根据引物中GC含量确定）；所述正向引物3的5'端和所述反向引物4 的5'端有15-17个核苷酸序列反向互补(具体碱基含量可根据引物中GC含量确定）；
[0036] 其中，所述反向引物3和所述正向引物4中反向互补的15-17个核苷酸序列既可 对应所述出发质粒上所述位点3上游的序列，也可对应所述目的基因的5'端的序列。所述 正向引物3和所述反向引物4中反向互补的15-17个核苷酸序列既可对应所述出发质粒上 所述位点4下游的序列，也可对应所述目的基因的3'端的序列。
[0037] (2)PCR 扩增：
[0038] 以所述出发质粒为模板，在具有3'_5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶作用下，用所 述正向引物3和所述反向引物3进行PCR扩增，得到PCR反应产物3 ;
[0039] 以含有所述目的基因的DNA为模板，在具有3' -5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶 作用下，用所述正向引物4和所述反向引物4进行PCR扩增，得到PCR反应产物4 ;
[0040] (3 ) Dpn I消化及转化
[0041] 将所述PCR反应产物3、所述PCR反应产物4和限制性内切酶Dpn I混合，37°C孵 育lh?1. 5h (如lh);用孵育后的混合液转化细菌，培养转化后细菌，获得将所述出发质粒 的所述位点3和所述位点4之间的片段替换为所述目的基因后形成的重组环形质粒。
[0042] 其中，将所述PCR反应产物3、所述PCR反应产物4和限制性内切酶Dpn I混合时， 所述PCR反应产物3和所述PCR反应产物4的体积比可为1 :1 ;所述限制性内切酶Dpn I 的用量要保证足以将被甲基化的模板彻底去除。
[0043] (D)当所述目的基因小于等于120bp时，所述方法具体可包括如下步骤(原理图见 图2):
[0044] (1)引物设计：
[0045] 根据所述出发质粒上所述位点3上游的序列，以及待插入的所述目的基因的5'端 序列，设计反向引物3,所述反向引物3的5'端为所述目的基因的5'端序列的反向互补序 列，3'端为所述出发质粒上所述位点3上游的序列的反向互补序列；
[0046] 根据所述出发质粒上所述位点4下游的序列，以及待插入的所述目的基因的3'端 序列，设计正向引物3,所述正向引物3的5'端为所述目的基因的3'端序列，3'端为所述 出发质粒上所述位点4下游的序列；
[0047] 所述反向引物3的5'端和所述正向引物3的5'端有15-17个核苷酸序列反向互 补(具体碱基含量可根据引物中GC含量确定）；
[0048] 其中，所述反向引物3和所述正向引物3中反向互补的15-17个核苷酸序列对应 来自所述目的基因的序列。
[0049] (2)PCR 扩增：
[0050] 以所述出发质粒为模板，在具有3'_5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶作用下，用所 述正向引物3和所述反向引物3进行PCR扩增，得到PCR反应产物3 ;
[0051] (3)DpnI消化及转化
[0052] 向所述PCR反应产物3中加入限制性内切酶Dpn I (所述限制性内切酶Dpn I的 用量要保证足以将被甲基化的模板彻底去除)，37°C孵育lh?1. 5h (如lh);用孵育液转化 细菌，培养转化后细菌，获得将所述出发质粒的所述位点3和所述位点4之间的片段替换为 所述目的基因后形成的重组环形质粒。
[0053] 第三种：将出发质粒的位点5和位点6之间的片段缺失得到重组环形质粒的方法， 所述位点5位于所述位点6的上游，该方法具体可包括如下步骤：
[0054] (1)引物设计：
[0055] 根据所述出发质粒的位点5上游的序列设计用于扩增质粒骨架的反向引物5,根 据所述出发质粒的位点6下游的序列设计用于扩增质粒骨架的正向引物5 ;
[0056] 所述反向引物5的5'端和所述正向引物5的5'端有15-17个核苷酸序列反向互 补(具体碱基含量可根据引物中GC含量确定）；
[0057] (2)PCR 扩增：
[0058] 以所述出发质粒为模板，在具有3'_5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶作用下，用所 述正向引物5和所述反向引物5进行PCR扩增，得到PCR反应产物5 ;
[0059] (3 ) Dpn I消化及转化
[〇〇6〇] 向所述PCR反应产物5中加入限制性内切酶Dpn I (所述限制性内切酶Dpn I的 用量要保证足以将被甲基化的模板彻底去除)，37°C孵育lh?1. 5h (如lh)，用孵育液转化 细菌，培养转化后细菌，获得将所述出发质粒的所述位点5和所述位点6之间的片段缺失后 所形成的重组环形质粒。
[0061] 在上述第一种和第二种方法中，（B)和（D)的步骤（1)中，所述目的基因的5'端序 列和所述目的基因的3'端序列满足如下条件：将所述目的基因的5'端序列和所述目的基 因的3'端序列进行拼接后得到的序列为所述目的基因的序列。
[〇〇62] 在本发明中，上述三种方法中的所述出发质粒均为被甲基化的环形质粒，具体可 来源于具有甲基化修饰功能的大肠杆菌。
[0063] 在上述第一种和第二种方法中，（A)和（C)中的步骤（2)中，作为模板的所述"含 有所述目的基因的DNA"均可为含有所述目的基因的被甲基化的环形质粒(如源于具有甲基 化修饰功能的大肠杆菌)，也均可为含有所述目的基因的线性DNA。
[0064] 大多数大肠杆菌都具有甲基化修饰功能，如常用的DH5 a、XL1-Blue等。
[0065] 上述三种方法中，所述具有3' -5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶均为高保真DNA 聚合酶。
[0066] 在本发明的一个实施例中，所述高保真DNA聚合酶具体为NEW ENGLAND BI0LABS 公司产品，其产品目录号为M0530S。
[〇〇67] 上述三种方法中，被转化的所述细菌均可为大肠杆菌。在本发明的一个实施例中， 所述被转化的所述细菌具体为大肠杆菌DH5ci。
[0068] 上述三种方法中，所述位点1、所述位点3、所述位点4、所述位点5和所述位点6均 可为所述出发载体上的任意位置。
[〇〇69] 上述三种方法中，所述出发载体的大小为用一对引物即可扩增成功的大小，如 5. 5K以下。
[0070] 上述三种方法中，本发明进行PCR扩增的循环数均具体为18个循环。
[0071] 在本发明中，有两个实施例对应以上第二种方法中的（C)，其中，所述出发质粒为 被甲基化的PGEX-4T-1质粒(序列10);所述目的基因为序列8所示的帕金森病相关基因 a -synuclein或序列8的第1-285位所示的帕金森病相关基因 a -synuclein的3'端缺 失片段；所述"含有所述目的基因的DNA"为被甲基化的pET- a -syn质粒，所述pET- a -syn 质粒为将序列表中序列8所示DNA片段与pET-28a(+)载体相连后得到的重组质粒；用于 扩增质粒骨架的所述正向引物3和所述反向引物3的序列分别为序列表中序列1和序列 2 ;用于扩增所述目的基因的所述正向引物4和所述反向引物4的序列分别为序列表中的 序列3和序列4 (目的基因为序列8)，或序列3和序列5 (目的基因为序列8的第1-285 位)。当所述目的基因为序列8时，最终所得的重组环形质粒为pGEX-4T-a-syn，所述 pGEX-4T-ci -syn为将序列表中序列10的第939-974位替换为序列8后的环形质粒；当所 述目的基因为序列8的第1-285位时，最终所得的重组环形质粒为pGEX-4T- a -syn Λ C，所 述PGEX-4T- a -Syn Λ C为将序列表中序列10的第939-974位替换为序列8的第1-285位 后的环形质粒。
[0072] 在本发明中，另一实施例对应以上第二种方法中的（D)，其中，所述出发质粒为被 甲基化的所述PGEX-4T- a -syn (来源于大肠杆菌DH5 α );所述目的基因为序列9所示的帕 金森病相关基因 β-synuclein的疏水区核苷酸片段；所述正向引物3和所述反向引物3的 序列分别为序列表中序列6和序列7。最终所得的重组环形质粒为将pGEX-4T- a -syn中序 列8所示的帕金森病相关基因 a -synuclein的第181-285位替换为序列表中序列9后形 成的环形质粒。
[0073] 本发明所提供的分子克隆方法是仅以PCR为基础的克隆方法，它可以把任何DNA 片段插入到质粒载体的任意位置，也可以去除质粒载体中的任意片段。该方法非常简单、可 靠高效，通过该方法可以实现不需DNA片段纯化回收、不需考虑载体的酶切位点、也不需连 接反应就可以得到克隆基因的目的，而且依此方法还可以非常容易地构建突变体，包括基 因中片段的替换、片段的去除等目的。 【专利附图】
【附图说明】
[0074] 图1为第二种方法中的（C)所述快速分子克隆方法的原理图。第一步：PCR扩增载 体和目的基因片段；第二步：Dpn I酶消化甲基化的质粒模板；第三步：高保真DNA聚合酶 利用3' -5'核酸外切酶活性使载体和目的基因片段形成粘性末端；第四步：载体和目的基 因片段在各自的末端配对，形成带有缺刻的环形结构；第五步：将这些带有缺刻的环形质 粒转化感受态细胞，修复缺刻并扩增。
[0075] 图2为第二种方法中的（D)所述快速分子克隆方法的原理图。
[0076] 图3为PCR反应结束后，用1%的琼脂凝胶电泳检验PCR产物的正确性。其中，泳 道Μ为DNA分子量标准；泳道1为实施例1和实施例2中载体pGEX-4T-l的扩增产物；泳道 2为实施例1中a -syn全长基因的扩增产物；泳道3为实施例2中a -syn基因缺失3'端 后的序列的扩增产物；泳道4为实施例3中对a -syn基因的中间疏水端进行替换后的扩增 产物。
[0077] 图4为对单克隆进行PCR的鉴定图。其中，泳道Μ为DNA分子量标准；泳道1-4为 实施例1中将a -syn全长基因克隆入载体pGEX-4T-l后的单克隆PCR鉴定图；泳道5-8为 实施例2中将a -syn基因缺失3'端后的序列克隆入载体pGEX-4T-l后的单克隆PCR鉴定 图；泳道9-12为实施例3中将a- syn基因的中间疏水端进行替换后的单克隆PCR鉴定图。 【具体实施方式】
[0078] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0079] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0080] pGEX-4T-l 载体：GE Healthcare 公司产品，其产品目录号为 28-9545-49。
[0081] 高保真DNA聚合酶：New England BioLabs公司产品，其产品目录号为M0530。
[0082] 实施例1、应用本发明分子克隆方法将帕金森病相关基因 a -synuclein ( a -syn) 克隆进入载体PGEX-4T-1
[0083] 本实施例采用本发明所提供的分子克隆方法将PGEX-4T-1质粒(序列10)中的 多克隆位点部分片段(序列10的第939-974位）替换为序列8所示的帕金森病相关基因 a -synuclein ( a -syn),从而得到重组载体 pGEX_4T_ a -syn。
[0084] 出发质粒：被甲基化的pGEX-4T-l载体。
[0085] 目的基因：序列8所示的帕金森病相关基因 a -synuclein ( a -syn)，存在于被甲 基化的pET- a -Syn载体上。pET- a -Syn载体为将序列表中序列8所示的DNA片段插入到 pET-28a(+)载体（Novagen，69864-3)的多克隆位点BamH I和Hind III之间后得到的重组 质粒。
[0086] 一、引物设计
[0087] 引物用 Oligo Analyzerl. 5 (http://www. genelink. com)软件设计。
[0088] 用于扩增PGEX-4T-1载体的正向引物设计在多克隆位点的下游（3'端)，反向引物 设计在多克隆位点的上游（5'端)，具体序列如下 ：
[0089] pGEX4TStopFwd ：5, -TGACTGACGATCTGCCTCGC-3' (序列 1)(序列 10 的第 975-994 位）；
[0090] DGEX4TStartRev :5' -CATCGGGGATCCACGCGGAAC-3' (序列 2)(前三个碱基 CAT 对 应a -syn基因的起始密码子ATG，其后的序列为序列10的第921-938位的反向互补序列）。
[0091] 根据待插入的α-syn基因(序列8)，设计用于扩增d-syn基因的正向引物和反向 引物，而且这些引物还要具有与载体末端互补配对的15-17bp序列。这些引物的具体序列 如下：
[0092] H_a-syn_Fqk5， ：5, ~CGTGGATCCCCG~ATGGATGTATTCATGAAAGGACTTTCAA AGG-3，（序 列3,下划线部分与pGEX4TStartRev序列中的下划线部分反向互补，-后的序列为序列8的 第1-31位）；
[0093] H_a-syn_Fqk3，：5?-GCAGATCGTCAGTCATTAGGCTTCAGGTTCGTAGTCTTGA TACCC-3,（序 列4,下划线部分与pGEX4TStartRev序列中的下划线部分反向互补，其后的序列为序列8的 第394-423位的反向互补序列）。
[〇〇94] 以上各引物均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。
[〇〇95] 二、PCR扩增载体骨架和目的基因片段
[0096] 分别以PGEX-4T-1载体和包含有a -syn全长基因的PET- a -syn载体为模板，用 以扩增载体PGEX-4T-1及a-syn全长基因，两个PCR反应体系均是50 μ 1，具体如下：无核 酸酶的水32.5以1，5\卩111181〇11册811打61'1(^1，2.51111(1阶1384 4 1，1(^]\1正向引物14 1， 10 μ Μ反向引物1 μ 1, DNA模板（10ng) 1 μ 1,高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1。
[0097] PCR 扩增载体 pGEX-4T-l 的反应条件：98 °C 3min ;98 °C lOsec，55 °C 30sec， 72°C 2. 5min，18 个循环；72°C 5min ;4°C保温。
[0098] PCR 扩增 a -Syn 全长基因的反应条件：98 °C 3min ;98 °C lOsec，55 °C 30sec， 72°C 20sec，18 个循环；72°C 5min ;4°C保温。
[0099] 反应结束后，分别取5 μ 1两PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳验证扩增所得的载 体和插入片段正确性，在100V下电泳30min.，最后用凝胶成像仪检测。
[0100] 电泳结果如图3所示，可以看出，泳道1所示载体PGEX-4T-1的扩增产物大小约为 5kbp，与预期结果一致；泳道2所示a -syn全长基因的扩增产物大小约为420bp，与预期结 果一致。
[0101] 三、Dpnl消化处理甲基化的DNA模板
[0102] 剩下PCR反应产物不需要进行纯化，只需各加入1 μ L限制性内切酶Dpn I (足以 将甲基化的DNA模板完全去除)，混匀，然后将载体混合物及a -syn全长基因混合物按体积 比1 :1的比例混合，37°C孵育1小时，以便去除作为模板的被甲基化的PGEX-4T-1载体和 pET-a -syn 载体。
[0103] 四、转化到感受态细胞
[0104] 将经限制性内切酶Dpn I孵育消化后的产物直接转化到感受态大肠杆菌DH5 a， 具体程序如下：
[0105] (1)取限制性内切酶Dpn I消化处理后的混合物2yL，加入50yL的感受态大肠 杆菌DH5 a中，于冰上放置30min ;
[0106] (2)在 Eppendorf Thermomixer42°C孵育 45sec ;
[0107] (3)冰上放置 2min;
[0108] (4)加入 350 μ L 的 S0C 培养基，在 Eppendorf Thermomixer37°C下转速为 350rpm 培育lh ;
[0109] (5)将整个混合液导入含有100 μ g/ml氨卞霉素的LB平皿内，37°C下孵育过夜；
[0110] (6 )挑选单克隆四个，接种到含有100 μ g/ml氨卞霉素的LB培养液中，37°C孵育过 夜，转速为200rpm。
[0111] (7)提取并纯化质粒，采用引物H_a_syn_Fqk5'和H_a_syn_Fqk3'针对a-syn全 长基因进行PCR鉴定，而后对PCR初步鉴定正确的质粒进一步用用测序的方法（由北京睿博 兴科生物技术有限公司测序）证实其序列的正确与否。
[0112] PCR鉴定结果如图4所示，可以看出，泳道1-4所示的四个克隆所得质粒均扩增出 大小约为420bp的目的条带，与预期结果一致。进一步，对四个克隆的测序结果显示，四个 克隆完全正确(所得质粒的序列为将序列10的第939-974位替换为序列8后得到的序列)， 所得质粒命名为pGEX_4T_ a -syn。所以总体上来说，这种PCR快速克隆的方法是1?效可靠 的。
[0113] 实施例2、应用本发明分子克隆方法将帕金森病相关基因 a -synuclein ( a -syn) 缺失3'端后克隆进入载体pGEX-4T-l，构建一个片段缺失的突变体
[0114] 本实施例采用本发明所提供的分子克隆方法将PGEX-4T-1质粒(序列10中的多克 隆位点部分片段(序列10的第939-974位)替换为序列8的第1-285位所示的帕金森病相关 基因 a -synuclein( a -syn)缺失3'端后的序列，从而得到重组载体pGEX-4T_ a -syn Λ C。
[0115] 出发质粒：被甲基化的PGEX-4T-1载体。
[0116] 目的基因：序列8的第1-285位所示的帕金森病相关基因 a -Synuclein( a -syn) 缺失3'端后的序列，存在于被甲基化的ρΕΤ-α -syn载体上。ρΕΤ-α -syn载体为将序列表 中序列8所示的DNA片段插入到pET-28a(+)载体（Novagen，69864-3)的多克隆位点BamH I和Hind III之间后得到的重组质粒。
[0117] 一、引物设计
[0118] 引物用 Oligo Analyzerl. 5 (http://www. genelink. com)软件设计。
[0119] 用于扩增PGEX-4T-1载体的正向引物设计在多克隆位点的下游（3'端)，反向引物 设计在多克隆位点的上游（5'端)，具体序列如下 ：
[0120] pGEX4TStopFwd ：5, -TGACTGACGATCTGCCTCGC-3' (序列 1)(序列 10 的第 975-994 位）；
[0121] DGEX4TStartRev :5' -CATCGGGGATCCACGCGGAAC-3' (序列 2)(前三个碱基 CAT 对 应a -syn基因的起始密码子ATG，其后的序列为序列10的第921-938位的反向互补序列）。
[0122] 根据待插入的a-syn基因缺失3'端后的序列（序列8的第1-285位)，设计用于 扩增a-syn基因缺失3'端后的序列的正向引物和反向引物，而且这些引物还要具有与载 体末端互补配对的15_17bp序列。这些引物的具体序列如下：
[0123] H_a-syn_Fqk5' ：5, ~CGTGGATCCCCG~ATGGATGTATTCATGAAAGGACTTTCAA AGG-3，（序 列3,下划线部分与pGEX4TStartRev序列中的下划线部分反向互补，-后的序列为序列8的 第1-31位）；
[0124] H_a-syn_DelCqk3，:5，-GCAGATCGTCAGTCAGACAA AGCCAGTGGC TGCTG-3，（序列 5， 下划线部分与pGEX4TStartRev序列中的下划线部分反向互补，其后的序列为序列8的第 266-285位的反向互补序列）。
[0125] 以上各引物均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。
[0126] 二、PCR扩增载体和目的基因片段
[0127] 分别以pGEX-4T-l载体和包含有a -syn全长基因序列的ρΕΤ-α -syn载体为模 板，用以扩增载体PGEX-4T-1及α-syn基因缺失3'端后的序列，两个PCR反应体系均是 5(^1，具体如下 ：无核酸酶的水32.5 4 1，5父？11118丨〇11册81^€61'1(^1，2.51111(1阶1384 4 1， ΙΟμΜ正向引物ΙμΙ,ΙΟμΜ反向引物Ιμ?，DNA模板（10ng) 1 μ 1，高保真DNA聚合酶 0· 5 μ 1。
[0128] PCR 扩增载体 pGEX-4T-l 的反应条件：98 °C 3min ;98 °C lOsec，55 °C 30sec， 72°C 2. 5min，18 个循环；72°C 5min ;4°C保温。
[0129] ?〇?扩增〇-5^11基因缺失3'端后的序列的反应条件：981：31^11 ;981：1086(3， 55°C 30sec，72°C 20sec，18 个循环；72°C 5min ;4°C保温。
[0130] 反应结束后，分别取5 μ 1两PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳验证扩增所得的载 体和插入片段正确性，在100V下电泳30min.，最后用凝胶成像仪检测。
[0131] 电泳结果如图3所示，可以看出，泳道1所示载体pGEX-4T-l的扩增产物大小约为 5kbp，与预期结果一致；泳道3所示a-syn基因缺失3'端后的序列的扩增产物大小约为 300bp，与预期结果一致。
[0132] 三、Dpnl消化处理甲基化的DNA模板
[0133] 剩下PCR反应产物不需要进行纯化，只需各加入1 μ L限制性内切酶Dpn I (足 以将甲基化的DNA模板完全去除)，混匀，然后将载体混合物及a-syn基因缺失3'端后的 序列混合物按体积比1 :1的比例混合，37°C孵育1小时，以便去除作为模板的被甲基化的 pGEX_4T_l 载体和 pET- a -syn 载体。
[0134] 四、转化到感受态细胞
[0135] 将经限制性内切酶Dpn I孵育消化后的产物直接转化到感受态大肠杆菌DH5 a， 具体程序如下：
[0136] (1)取限制性内切酶Dpn I消化处理后的混合物2yL，加入50yL的感受态大肠 杆菌DH5 a中，于冰上放置30min ;
[0137] (2)在 Eppendorf Thermomixer42°C孵育 45sec ;
[0138] (3)冰上放置 2min;
[0139] (4)加入 350 μ L 的 S0C 培养基，在 Eppendorf Thermomixer37°C下转速为 350rpm 培育lh ;
[0140] (5)将整个混合液导入含有100 μ g/ml氨卞霉素的LB平皿内，37°C下孵育过夜；
[0141] (6 )挑选单克隆四个，接种到含有100 μ g/ml氨卞霉素的LB培养液中，37°C孵育过 夜，转速为200rpm。
[0142] (7)提取并纯化质粒，采用引物 H_a_syn_Fqk5' 和 H_a_syn_DelCqk3' 针对 a-syn 基因缺失3'端后的序列(序列8的第1-285位)进行PCR鉴定，而后对PCR初步鉴定正确的 质粒进一步用测序的方法（由北京睿博兴科生物技术有限公司测序）证实其序列的正确与 否。
[0143] PCR鉴定结果如图4所示，可以看出，泳道5-8所示的四个克隆所得质粒均扩 增出大小约为285bp的目的条带，与预期结果一致。进一步，对四个克隆的测序结果显 示，四个克隆完全正确，所得质粒的序列为将序列10的第939-974位替换为序列8的 第1-285位后得到的序列，没有发现碱基插入、缺失等方面的突变。将所得质粒命名为 PGEX-4T-a -syn Δ C〇
[0144] 实施例3、应用本发明分子克隆方法将帕金森病相关基因 α -synuclein ( α -syn) 的中间端疏水区域替换成β-synuclein (β-syn)对应的部分，构建一个基因片段替换的 突变体
[0145] 本实施例采用本发明所提供的分子克隆方法将pGEX-4T_a -syn质粒中的帕金森 病相关基因 ct -synuclein ( a -syn)的中间端疏水区域(序列8的第181-285位)替换成帕 金森病相关基因 β -synuclein ( β -syn)的中间端疏水区域(序列9)，从而得到重组载体。
[0146] 出发质粒：被甲基化的pGEX-4T_ a -syn载体，来源于实施例1中从大肠杆菌 DH5 α中提取并纯化的pGEX-4T_ a -syn质粒。pGEX-4T_ a -syn质粒的序列为将序列10的 第939-974位替换为序列8后得到的序列。
[0147] 目的基因：序列9所示的帕金森病相关基因 β-synuclein ( β-syn)的中间端疏 水区域的序列。
[0148] 一、引物设计
[0149] 由于要替换的DNA序列（序列9)是一个小于120bp的小片段，所以要替换的片段 (序列9)可以直接包含在用于扩增载体的引物中，进行一个PCR直接完成替换的目的。
[0150] 根据PGEX-4T- a -syn载体上待替换的a -syn的中间端疏水区域的上游的序列， 以及待插入的β-syn的中间端疏水区域的5'端序列，设计反向引物，所述反向引物的5'端 为β -syn的中间端疏水区域的5'端序列的反向互补序列，3'端为pGEX-4T_ a -syn载体上 待替换的a-syn的中间端疏水区域的上游的序列的反向互补序列。根据pGEX-4T-a-syn 载体上待替换的a -syn的中间端疏水区域的下游的序列，以及待插入的β -syn的中间端 疏水区域的3'端序列，设计正向引物，所述正向引物的5'端为β-syn的中间端疏水区域 的3'端序列，3'端为pGEX-4T-a -syn载体上待替换的a -syn的中间端疏水区域的下游 的序列。同时，所述反向引物的5'端和所述正向引物的5'端有16个核苷酸序列反向互补 (如下AsynMSwap_Fwd和AsynMSwap_Rev中下划线部分序列）。
[0151] 具体的引物序列如下：
[0152] AsvnMSwap Fwd ：5? -GTGTTCTCTGGGGCAGGGAACATCGCAGCAGCCACAG GAC TGGTG-AAAAA GGACCAGTTG GGCAAGAATG AAGAAGGAG-3'（序列 6)(-前的序列为序列 9 的第 28-72位；-后的序列为序列8的第286-319位）；
[0153] AsynMSwap_Rev ：5, -CTGCCCCAGAGAACACAGCTCCTCCCAGATGTGAGGC CTG TTC-TTTGGTC TTCTCAGCCA CTGTTGC-3'（序列7)(-前的序列为序列9的第25-67位的反 向互补序列；-后的序列为序列8的第157-180位的反向互补序列)。
[0154] 二、PCR 扩增
[0155] 以包含有a-syn全长基因的载体pGEX-4T_a-syn为模板，采用步骤一设计的的 引物对进行PCR扩增。反应体系为50μ 1，具体如下：无核酸酶的水32. 5μ l，5XPhusion HF Bufferl0yl，2.5mM (1阶1^4 4 1，1(^]\1正向引物14 1，1(^]\1反向引物14 1，0嫩模板 (lOng) 1 μ 1，高保真 DNA 聚合酶 0· 5 μ 1。
[0156] 反应条件：98°C 3min ;98°C 10sec，55°C 30sec，72°C 2. 5min，18 个循环；72°C 5min ; 4 C保温。
[0157] 反应结束后，分别取5 μ 1PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物的正确 性，在100V下电泳30min.，最后用凝胶成像仪检测。
[0158] 电泳结果如图3的泳道4所示，可以看出，扩增产物大小约为5. 4kbp，与预期结果 一致。
[0159] 三、DpnI消化处理甲基化的DNA模板
[0160] 剩下PCR反应产物不需要进行纯化，只需各加入1 μ L限制性内切酶Dpn I (足以 将甲基化的DNA模板完全去除)，混匀，37°C孵育1小时，以便去除作为模板的被甲基化的 pGEX_4T_ a -syn 载体。
[0161] 四、转化到感受态细胞
[0162] 将经限制性内切酶Dpn I孵育消化后的产物直接转化到感受态大肠杆菌DH5 α， 具体程序如下：
[0163] (1)取限制性内切酶Dpn I消化处理后的混合物2yL，加入50yL的感受态大肠 杆菌DH5 α中，于冰上放置30min ;
[0164] (2)在 Eppendorf Thermomixer42°C孵育 45sec ;
[0165] (3)冰上放置 2min;
[0166] (4)加入 350 μ L 的 S0C 培养基，在 Eppendorf Thermomixer37°C下转速为 350rpm 培育lh ;
[0167] (5)将整个混合液导入含有100 μ g/ml氨卞霉素的LB平皿内，37°C下孵育过夜；
[0168] (6)挑选单克隆四个，接种到含有100μ g/ml氨卞霉素的LB培养液中，37°C孵育过 夜，转速为200rpm。
[0169] (7)提取并纯化质粒，采用引物H_a_syn_Fqk5'和!1_3-8711_?91^3'针对中间疏水端 进行替换后的a -syn基因序列进行PCR鉴定,而后对PCR初步鉴定正确的质粒进一步用用 测序的方法（由北京睿博兴科生物技术有限公司测序）证实其序列的正确与否。
[0170] PCR鉴定的结果如图4所示，可以看出，泳道9-12所示的四个克隆所得质粒中有三 个均扩增出大小约为390bp的目的条带，与预期结果一致。进一步，对这三个克隆的测序结 果显示，这三个克隆完全正确，所得质粒为将pGEX-4T_a -syn中序列8所示的帕金森病相 关基因 a-synuclein的第181-285位替换为序列表中序列9后形成的环形质粒。所以总 体上来说，这种PCR快速克隆的方法是高效可靠的。
[0001]
【权利要求】
1. 分子克隆方法，为在出发质粒的位点1处插入目的基因得到重组环形质粒，其特征 在于：所述方法为如下（A)或（B): (A) 所述目的基因大于120bp且小于3000bp，所述方法包括如下步骤： (1) 引物设计： 根据所述出发质粒上所述位点1上游的序列设计用于扩增质粒骨架的反向引物1，根 据所述出发质粒上所述位点1下游的序列设计用于扩增质粒骨架的正向引物1 ; 根据待插入的所述目的基因的序列设计用于扩增所述目的基因的正向引物2以及反 向引物2 ; 所述反向引物1的5'端和所述正向引物2的5'端有15-17个核苷酸序列反向互补； 所述正向引物1的5'端和所述反向引物2的5'端有15-17个核苷酸序列反向互补； (2) PCR 扩增： 以所述出发质粒为模板，在具有3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶作用下，用所述正 向引物1和所述反向引物1进行PCR扩增，得到PCR反应产物1 ; 以含有所述目的基因的DNA为模板，在具有3' -5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶作用 下，用所述正向引物2和所述反向引物2进行PCR扩增，得到PCR反应产物2 ; (3) Dpn I消化及转化 将所述PCR反应产物1、所述PCR反应产物2和限制性内切酶Dpn I混合，37°C孵育 lh?1. 5h ;用孵育后的混合液转化细菌，培养转化后细菌，获得在所述出发质粒的所述位 点1处插入所述目的基因后形成的重组环形质粒； (B) 所述目的基因小于等于120bp，所述方法包括如下步骤： (1) 引物设计： 根据所述出发质粒上所述位点1上游的序列，以及待插入的所述目的基因的5'端序 列，设计反向引物1，所述反向引物1的5'端为所述目的基因的5'端序列的反向互补序列， 3'端为所述出发质粒上所述位点1上游的序列的反向互补序列； 根据所述出发质粒上所述位点1下游的序列，以及待插入的所述目的基因的3'端序 列，设计正向引物1，所述正向引物1的5'端为所述目的基因的3'端序列，3'端为所述出 发质粒上所述位点1下游的序列； 所述反向引物1的5'端和所述正向引物1的5'端有15-17个核苷酸序列反向互补； (2) PCR 扩增： 以所述出发质粒为模板，在具有3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶作用下，用所述正 向引物1和所述反向引物1进行PCR扩增，得到PCR反应产物1 ; (3) Dpn I消化及转化 向所述PCR反应产物1中加入限制性内切酶Dpn I，37°C孵育lh?1. 5h ;用孵育液转 化细菌，培养转化后细菌，获得在所述出发质粒的所述位点1处插入所述目的基因后形成 的重组环形质粒。
2. 分子克隆方法，为将出发质粒的位点3和位点4之间的片段替换为目的基因得到重 组环形质粒，所述位点3位于所述位点4的上游，其特征在于：所述方法为如下（C)或（D): (C) 所述目的基因大于120bp且小于3000bp，所述方法包括如下步骤： (1)引物设计： 根据所述出发质粒上所述位点3上游的序列设计用于扩增质粒骨架的反向引物3,根 据所述出发质粒上所述位点4下游的序列设计用于扩增质粒骨架的正向引物3 ; 根据待插入的所述目的基因的序列设计用于扩增所述目的基因的正向引物4以及反 向引物4 ; 所述反向引物3的5'端和所述正向引物4的5'端有15-17个核苷酸序列反向互补； 所述正向引物3的5'端和所述反向引物4的5'端有15-17个核苷酸序列反向互补； (2) PCR 扩增： 以所述出发质粒为模板，在具有3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶作用下，用所述正 向引物3和所述反向引物3进行PCR扩增，得到PCR反应产物3 ; 以含有所述目的基因的DNA为模板，在具有3' -5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶作用 下，用所述正向引物4和所述反向引物4进行PCR扩增，得到PCR反应产物4 ; (3) Dpn I消化及转化 将所述PCR反应产物3、所述PCR反应产物4和限制性内切酶Dpn I混合，37°C孵育 lh?1. 5h ;用孵育后的混合液转化细菌，培养转化后细菌，获得将所述出发质粒的所述位 点3和所述位点4之间的片段替换为所述目的基因后形成的重组环形质粒； (D)所述目的基因小于等于120bp，所述方法包括如下步骤： (1) 引物设计： 根据所述出发质粒上所述位点3上游的序列，以及待插入的所述目的基因的5'端序 列，设计反向引物3,所述反向引物3的5'端为所述目的基因的5'端序列的反向互补序列， 3'端为所述出发质粒上所述位点3上游的序列的反向互补序列； 根据所述出发质粒上所述位点4下游的序列，以及待插入的所述目的基因的3'端序 列，设计正向引物3,所述正向引物3的5'端为所述目的基因的3'端序列，3'端为所述出 发质粒上所述位点4下游的序列； 所述反向引物3的5'端和所述正向引物3的5'端有15-17个核苷酸序列反向互补； (2) PCR 扩增： 以所述出发质粒为模板，在具有3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶作用下，用所述正 向引物3和所述反向引物3进行PCR扩增，得到PCR反应产物3 ; (3) Dpn I消化及转化 向所述PCR反应产物3中加入限制性内切酶Dpn I，37°C孵育lh?1. 5h ;用孵育液转 化细菌，培养转化后细菌，获得将所述出发质粒的所述位点3和所述位点4之间的片段替换 为所述目的基因后形成的重组环形质粒。
3.分子克隆方法，为将出发质粒的位点5和位点6之间的片段缺失得到重组环形质粒， 所述位点5位于所述位点6的上游，其特征在于：所述方法包括如下步骤： (1) 引物设计： 根据所述出发质粒的位点5上游的序列设计用于扩增质粒骨架的反向引物5,根据所 述出发质粒的位点6下游的序列设计用于扩增质粒骨架的正向引物5 ; 所述反向引物5的5'端和所述正向引物5的5'端有15-17个核苷酸序列反向互补； (2) PCR 扩增： 以所述出发质粒为模板，在具有3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶作用下，用所述正 向引物5和所述反向引物5进行PCR扩增，得到PCR反应产物5 ; (3)Dpn I消化及转化 向所述PCR反应产物5中加入限制性内切酶Dpn I，37°C孵育lh?1. 5h，用孵育液转 化细菌，培养转化后细菌，获得将所述出发质粒的所述位点5和所述位点6之间的片段缺失 后所形成的重组环形质粒。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述出发质粒为被甲基化的环 形质粒。
5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：权利要求1或2的步骤（2)中， 作为模板的含有所述目的基因的DNA为如下（a)或（b): (a) 含有所述目的基因的被甲基化的环形质粒； (b) 含有所述目的基因的线性DNA。
6. 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述具有3' -5'核酸外切酶活 性的DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶。
7. 根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：被转化的所述细菌为大肠杆菌。
【文档编号】C12N15/70GK104109685SQ201310706163
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】张建亮, 薛奋勤, 闫红霞, 赵君君, 杨慧 申请人:首都医科大学