专利名称：基因组分析方法
技术领域：
本发明涉及鉴别人类基因组发生的变异的方法，及将这些变异与疾病和药物反应的遗传基础相关联的方法。具体地说，本发明涉及鉴别个体SNPs、确定SNP单倍型区块和模式，和进一步利用SNP单倍型区块和模式来分析疾病和药物反应的遗传基础。本发明的方法适用于全基因组的分析。
相关申请的交叉参考本申请要求以下申请的优先权2001年3月30日提交的美国临时专利申请系列号60/280,530，2001年8月17日提交的美国临时专利申请系列号60/313,264，2001年10月5日提交的美国临时专利申请系列号60/327,006，名称均为“鉴别人类SNP单倍型、信息型SNPs及其应用”，和11/26/01提交的美国临时专利申请系列号60/332,550，名称为“基因组分析方法”，所有这些公开文件特别引入此处作为参考。
背景技术：
构成人染色体的DNA提供了指导人体合成所有蛋白质的指令。这些蛋白质执行生命的重要功能。编码蛋白质的DNA序列的变异使其编码的蛋白质发生变异或突变，从而影响细胞的正常功能。尽管环境在疾病中常常起着重要的作用，但是个体DNA的变异或突变直接与几乎人类的所有疾病相关，包括传染病、癌症和自身免疫紊乱。而且，遗传学知识，尤其是人类遗传学，已经引导人们认识到许多疾病是由几种基因或其产物间复杂的相互作用，或者一个基因内任何数量的基因突变引起的。例如I型和II型糖尿病与多种基因相关，每型都有其各自的突变模式。相比之下，囊性纤维化可由单一基因内300个以上不同突变之一引起。
而且，当涉及药物反应——药物遗传学领域时，人类遗传学知识使得人们对个体间变异的理解有限。半个多世纪前，药物副作用与两个药物代谢酶——血浆胆碱酯酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的氨基酸变异有关。从此，将35个以上药物代谢酶的序列多态性(变异)、25种药物靶和5种药物转运蛋白与药物功效或安全性的折衷水平联系起来，进行仔细的遗传分析(Evans andRelling，Science 296487-91(1999))。在临床上，这样的信息正用于预防药物毒性；例如，根据硫嘌呤甲基转移酶基因的遗传学差异对患者进行常规筛选，该酶降低使6-巯嘌呤或咪唑硫嘌呤的代谢。然而迄今有效的药物遗传学标记组只能充分解释观察到的药物毒性中的一小部分。甚至比毒性问题更常见的可能是这种情况，对一些个体证明安全和/或有效的药物，对其他个体的药物功效不充分或产生了预料不到的副作用。
除了理解人类遗传组成变异的影响的重要性外，理解其它非人类生物体——尤其是病原体的遗传学组成的变异，对于理解它们对人类的影响以及与人类间的相互作用非常重要。例如，病原菌或病毒的毒力因子的表达大大影响与这些生物体发生联系的人类的感染比例和严重性。另外，详细理解实验动物如小鼠、大鼠等的遗传学组成也非常有价值。例如，理解用于估计治疗的模型系统的动物遗传学组成的变异对于理解采用这些系统所获得的实验结果和用于人类的预值是很重要的。
由于任何两个人的遗传学组成的相似度是99.9％，他们基因组的大部分DNA序列都相同。然而，个体间的DNA序列存在变异。例如，DNA多碱基段的缺失，DNA片段的插入，非编码区重复DNA元件的数量变异和基因组内单一含氮碱基位点的改变，即所谓的“单核苷酸多态性”(SNPs)。人类DNA序列变异占观察到的个体间差异的一大部分，包括对疾病的易感性。
尽管多数SNPs是罕见的，已经估计有5300万个频率均在10-50％的常见SNPs，它们占人群间DNA序列差异的绝大部分。在人类基因组中，每600个碱基对就存在着这样的SNPs(Kruglyak and Nickerson，Nature Genet.27235，2001)。在亲密的自然近亲中形成的这种SNPs区块的等位基因(变异)常常相互关联，从而降低了遗传变异性，并限定了有限数量的“SNP单倍型”，每一个该SNP单倍型都反应了它由单一的远古祖先染色体继承而来(Fullerton，et al.，Am.J.Hum.Genet.67881，2000)。
人类基因组中局部单倍型结构的复杂性--和体单倍型延伸的距离—很少被确定。调查不同人群的基因组不同片段的研究经验揭示了局部单倍型结构的巨大变异性。这些研究表明突变、重组、选择、人群历史和随机事件以不可预知模式对单倍型结构改变起着相应的贡献，结果导致一些单倍型延伸仅几千碱基(kb)，而另一些单倍型延伸超过100kb(A.G.Clark，et al.，Am.J.Hum.Genet.，63595，1998)。
这些发现表明由常见SNPs定义的人基因组单倍型结构的任何全面描述，将需要对人类基因组中大量独立拷贝中的整套SNPs进行深入的经验学分析。这种全基因组分析将提供一个细致的基因图谱并探明特殊连锁区域。然而，对合理大小人群的每个个体的超过3,000,000SNPs进行分型的实践和所需费用使人们在本发明前无法将这种努力付诸实践。在多种申请中，本发明允许用SNP单倍型进行全基因组关联分析。
发明内容
本发明涉及鉴定人类基因组所发生的变异以及将这些变异与疾病抵抗力，疾病易感性或药物反应等表型的遗传基础相关联的方法。“疾病”包括但不局限于生物体中需要改变的任何条件、性状或特征。例如，这些条件可以是物理的、生理的或心理的，并且可以有症状或没有症状。该方法提供了变异的鉴定，SNPs的鉴定，SNP单倍型区块的确定、SNP单倍型模式的确定，以及更进一步，每一种模式的信息型SNPs的鉴定，信息型SNPs可压缩遗传资料。
因此，本发明的一个方面提供了用于资料分析的选择SNP单倍型模式的方法。这样的选择是通过以下步骤完成的从大量个体中分离出基本等同(同源的)的核酸链；确定每条核酸链上SNP的位置；鉴定核酸链中连锁的SNP位点，在此处连锁SNP位点形成SNP单倍型区块；鉴定分离的SNP单倍型区块；鉴定出现在每个SNP单倍型区块中的SNP单倍型模式；以及选择出现在至少两条基本等同核酸链上的已鉴定的SNP单倍型模式。在一个优选实施方案中，使用了来自至少约10个不同个体或来源的核酸链。在一个更优选的实施方案中，使用来自至少16个不同来源的核酸链。更加优选的实施方案中，使用来自至少25个不同来源的核酸链，还要更优选的实施方案中，使用来自至少50个不同来源的核酸链。进一步，更优选的实施方案将确定来自至少约100个不同来源的核酸链中的SNP位点。另外，该方法可进一步包括选择在基本等同的核酸链中最频繁出现的SNP单倍型模式；选择基本等同的核酸链中次频繁出现的SNP单倍型模式；并重复选择直到所选5NP单倍型模式能鉴定出基本等同核酸链中感兴趣的一部分。在一个优选实施方案中，感兴趣的部分占基本等同核酸链的70％到99％，并且，更优选的实施方案中，感兴趣的部分占基本等同核酸链的约80％。可替换地，可期望将SNP单倍型模式的选择限制到每个SNP单倍型区块中只有不超过约3个SNP单倍型模式。
另外，本发明提供了用于数据分析的选择SNP单倍型区块数据组的方法，包括比较SNP单倍型区块中的信息量；选择高信息量的第一个SNP单倍型区块；将第一个SNP单倍型区块添加到数据组中；选择高信息量的第二个SNP单倍型区块；将第二个SNP单倍型区块添加到数据组中；重复选择和添加的步骤，直到覆盖了感兴趣的DNA链。在优选实施方案中，所选SNP单倍型区块无重叠。
本发明进一步提供了在一个SNP单倍型模式中确定至少一个信息型SNP的方法，包括首先确定SNP单倍型区块的SNP单倍型模式，接着将SNP单倍型区块中每个感兴趣的SNP单倍型模式与SNP单倍型区块中其它SNP单倍型模式进行比较，并在每个SNP单倍型模式中选择至少一个SNP，它可将该感兴趣的SNP单倍型模式与SNP单倍型区块中其它SNP单倍型模式区分开来。所选SNP(或SNPs)是该SNP单倍型模式的信息型SNP。
而且，本发明可快速扫描基因组区域并提供了确定疾病相关遗传位点或药物基因组相关位点的方法，而不需要预先知道疾病相关遗传位点或药物基因组相关位点的序列或位置。可通过确定对照人群中个体的SNP单倍型模式，然后确定例如患病人群中的个体或当给予药物时发生特殊方式反应的个体等实验人群个体的SNP单倍型模式来完成这个过程。比较对照和实验人群SNP单倍型模式的频率。这些频率间的差异指出了疾病相关遗传位点或药物基因组相关位点。
本发明的另一方面提供了在SNP单倍型模式和感兴趣的表型性状间建立联系的方法，包括用本发明的方法建立对照个体的SNP单倍型模式的基线；汇集有共同感兴趣的表型性状的临床人群的全基因组DNA；和确定与感兴趣表型性状相关的SNP单倍型模式。这样，本发明提供了基因组扫描用于鉴定与表型相关的多单倍型区块，当研究多基因性状时这一点尤其有用。
而且，本发明提供了鉴定药物发现靶的方法，包括将SNP单倍型模式与疾病联系起来；确定相关SNP单倍型模式在染色体上的位置；确定染色体位置和所述疾病关系的本质；和用该染色体位置的基因或基因产物作为药物发现靶。
下列附图构成本发明详述的一部分，为进一步证明本发明的特定方面而引入。参考其中一幅或更多附图，结合这里的特殊实施方案详述可更好地理解本发明。
图1是本发明方法的一个实施方案的示意图，表示鉴定变异位点，以便使变异与表型关联，并用这种关联确定药物发现靶或作为诊断标记。
图2显示根据本发明的样本SNP单倍型区块和SNP单倍型模式。
图3是表示选择SNP单倍型区块的方法的实施方案示意图。
图4是图3所示方法的实施方案的简单例子。
图5A是选择最终SNP单倍型区块组的方法的一种实施方案的示意图。图5B是图5A所示方法的简单例子。图5B中标记“字母数字”表示每个区块的“单倍型区块ID信息量值”。
图6表示根据本发明的一个实施方案，如何选择信息型SNPs的例子。
图7A是解决变异体模糊和/或SNP单倍型模式模糊的实施方案示意图。图7B显示了图7A所示方法的简单例子。
图8是在关联研究中使用本发明方法的一个实施方案的示意图。
图9表示适于执行本发明一些实施方案的示范性计算机网络系统。
图10是体细胞杂交体构建示意图。
图11列表显示用Affymetrix，Inc.的HuSNP基因芯片筛选仓鼠—人细胞杂交体的部分结果。
图12表示用长距离PCR扩增人22号染色体和人14号染色体得到的多种扩增基因组区的例子。
图13A是表示针对SNP次要等位基因(变异体)的频率而描绘的SNP百分比的条形图。图13B是作为间隔中核苷酸多样性功能的200kb间隔所占百分比的图。图13C是表示针对间隔长度而描绘的所有间隔百分比的条形图。
图14显示了由人21号染色体上147个常见SNPs确定的20个独立总体多样染色体的单倍型模式。
图15是所覆盖染色体比例作为该覆盖所需SNPs数量的函数的曲线。
具体实施例方式
对本领域技术人员来说，在本申请公开的发明基础上可进行多种实施方案和改进，而不脱离本发明的范围和精神。这里提到的所有公开物的引入是为了描述和公开可能用到的与本发明相联系的试剂、方法学和概念。这些参考资料都不作为与此处所述的本发明相关的现有技术的证明。
说明书中使用的“一个”是指一个或更多。权利要求中使用的与单词“包括”相连时，单词“一个”是指一个或更多。其中使用的“另一个”是指至少第二个或更多。
当使用“不同起源”时，是指不同生物体的DNA链来自不同的起源。进一步，单个生物体的基因组中的每一DNA链来自不同的起源。在二倍体生物中，个体生物的基因组由一套成对的基本等同的DNA链组成。也就是说，单一个体将具有来自两个不同来源的基本等同的DNA链——两条中的一条DNA链来自母源，一条DNA链来自父源。认为两个或更多核酸序列——例如，两条或更多DNA链——是基本相同的，如果它们在核苷酸水平有至少约70％的序列等同性，优选约75％，更优选约80％，更优选约85％，更优选约90％，甚至更优选约95％，甚至更优选如果核酸序列在核苷酸水平表现出至少约98％的序列等同性，认为核酸序列基本相同。两条或更多核酸序列间的相关的序列等同性程度将依赖于该核酸的宿主来源。例如，当进行相同物种比较时，超过95％的序列等同性可能相关，而做交叉物种比较时，70％或甚至更少的序列等同性可能相关。当然，当涉及此处所述的DNA，可包括DNA的衍生物，如扩增子、RNA转录物、核酸模拟物等。
此处所述“个体”是指一个特定单个生物体，如单个动物、人、昆虫、细菌等。
此处所述SNP单倍型区块的“信息量”定义SNP单倍型区块提供有关基因区域信息的程度。
此处所述“信息型SNP”是指SNP或SNPs亚型(一个以上)的遗传性变异体，倾向于将一个SNP单倍型模式与一个SNP单倍型区块中其它SNP单倍型模式区别开来。
此处所述的术语“分离的SNP区块”是指由一个SNP组成的SNP单倍型区块。
此处所述的术语“连锁不平衡”、“连锁”或“LD”是指倾向于从一代到一代一起传递的遗传学位点；如非随机遗传的遗传学位点。
此处所述的术语“单一SNP单倍型”或“单一SNP”是指出现在少于人群一定部分的特异性SNP等位基因或变异体。
此处所述的术语“SNP”或“单核苷酸多态性”是指个体间遗传学变异；如在生物体中DNA的可变单个含氮碱基位点。此处所述的“SNPs”是SNP的复数。当然，当涉及此处所述的DNA，可包括DNA的衍生物，如扩增子、RNA转录物等。
此处所述的术语“SNP单倍型区块”是指一组不单独出现重组，在变异体或SNPs中能聚集在一起的变异体或SNP位点。
此处所述的术语“SNP单倍型模式”是指DNA单链上一个SNP单倍型区块中一系列的SNPs基因型。
此处所述的术语“SNP位点”是一条DNA序列中出现SNP的位点。
此处所述的术语“SNP单倍型序列”是含有至少一个SNP位点的DNA链中的DNA序列。用于分析的核酸的制备用本领域技术人员所知的任何技术制备核酸分子用于分析。优选这种技术可产生足够纯的核酸分子，以确定该核酸分子的一个或更多位点的一个或更多突变的存在与否。这种技术可从，如sambrook，et al.，Molecular CloningALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，New York)(1989)，和Ausubel，et al.，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，NewYork)(1997)中找到，此处引入作为参考。
当细胞中存在感兴趣的核酸，需要首先制备细胞提取物，接着进行下列步骤——即，示差沉淀、柱层析、用有机溶剂等提取——以获得足够纯的核酸制剂。可采用本领域的标准技术如细胞的化学或机械裂解制备提取物。可进一步处理提取物，如采用过滤和/或离心和/或用离液盐如异硫氰酸胍或尿素，或用有机溶剂如苯酚和/或HCCl3使任何污染物和潜在干扰蛋白变性。当使用离液盐时，期望将含核酸样品中的该盐去除。这可通过使用本领域的标准技术来完成，如沉淀、过滤、大小排阻层析等。
在一些情况下，可能期望从细胞提取和分离信使RNA。本领域技术人员知道为这一目的所用的技术和材料，可包括使用附着于固相支持物如珠或塑料表面的寡dT。本领域技术人员知道合适的条件和材料，并可从上述Sambrook和Ausubel的参考文献中找到。可能需要使用如逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA。适当的酶可从商业途径获得，如Invitrogen，Carlsbad CA。然后可以选择性地扩增由mRNA制备的cDNA。
一个尤其适合检查单倍型模式和单倍型区块的方法是用体细胞遗传学将染色体从二倍体状态分离为单倍体状态。在一个实施方案中，二倍体人类淋巴母细胞系可融入也是二倍体的仓鼠成纤维细胞系，这样人染色体被导入仓鼠细胞产生了细胞杂交体。检查所得杂交细胞，确定人哪一染色体被转移，以及，如果存在，可以确定哪一被转移的人染色体是单倍体状态(见，如，Patterson，et al.，Annal.N.Y Acad.OfSciences，39669-81，1982)。
图10显示了步骤流程图。图10显示了胸苷激酶基因为野生型的二倍体人类淋巴母细胞系与含有胸苷激酶基因突变的二倍体仓鼠成纤维细胞系融合。所得细胞的亚群中，人染色体存在于杂交细胞中。使用HAT培养基(筛选培养基)筛选含人DNA的杂交细胞。只有稳定掺入了含野生型人胸苷激酶基因的人DNA链的杂交细胞能在含HAT的细胞培养基中生长。在所得杂交细胞中，一些细胞可能含有一些人染色体的两个拷贝，仅含人染色体的一个拷贝或没有特定人染色体的拷贝。例如，对于含有一个A或一个B等位基因座的人22号染色体，所得杂交细胞可能含有一个人22号染色体变异体(如“A”变异体)或其中一部分，一些可能含有另一种人22号染色体变异体(如“B”变异体)或其中一部分，一些可能含有这两种人22号染色体变异体或其中一部分，还有一些杂交细胞可能根本不含人22号染色体的任何部分。在图10中，只显示了所得杂交细胞群中的两个。一旦选择出合适的杂交细胞，可用如上述技术分离这些杂交细胞中的核酸，然后进行SNP检测，以及本发明的单倍型区块和单倍型模式分析。扩增技术在确定核酸中一个和更多变异的存在与否之前，可能需要扩增一个或更多感兴趣的核酸。核酸扩增增加了感兴趣核酸序列的拷贝数量。本领域技术人员所知的任何扩增技术可与本发明联用，包括但不限于，聚合酶链式反应(PCR)技术。PCR可使用本领域技术人员所知的材料和方法进行。
PCR扩增通常包括使用核酸序列的一条链作为模板，以产生大量的该序列的互补序列。该模板可杂交于具有与模板序列的一部分互补的序列的引物，并接触合适的反应混合物，包括dNTPs和一种聚合酶。聚合酶使引物延伸产生原始模板的互补核酸。
为了扩增双链核酸分子的两条链，可使用两个引物，每个引物可含有与一条核酸链的一部分互补的序列。聚合酶作用下引物的延伸产生两个双链核酸分子，每个分子含有一条模板链和一条新合成的互补链。典型的引物序列选择使每个引物的延伸向着核酸分子中另一引物杂交的位点延长。
变性核酸分子链——例如，通过加热——重复这一过程，这段时间里，将在先步骤新合成的链作为随后步骤的模板。PCR扩增实施方案可包括几个到多个变性、杂交和延伸反应的循环，以产生足够数量的期望核酸。
尽管典型PCR方法采用加热使链变性，允许随后的引物杂交，但可使用其它任何使核酸可以与引物杂交的方法。这种技术包括但不限于，物理、化学和酶学方法，如通过引入解旋酶，(见Radding，Ann.Rev.Genetics 16405-436(1982))或用电化学方法(见PCR申请Nos.WO92/04470和WO95/25177)。
PCR中引物的模板依赖性延伸是在反应介质中至少4种脱氧核苷三磷酸(典型地选自dATP，dGTP，dCTP，dUTP和dTTP)存在下，由聚合酶催化，反应介质中含有合适的盐、金属阳离子和pH缓冲系统。适当的聚合酶是本领域技术人员知道的，可以是克隆的或从自然来源分离，还可以是天然或突变形式的酶。只要酶保持延伸引物的能力，它们均可用于本发明的扩增反应。
本发明的方法中所用的核酸可被标记以利于后续步骤的检测。标记可在扩增反应过程中进行，将一个或更多标记过的三磷酸核苷酸和/或一个或更多标记的引物掺入到被扩增序列中。核酸可在扩增后进行标记，如通过一个或更多可检测基团的共价连接。可使用任何本领域技术人员所知的可检测基团，如荧光基团、配体和/或放射性基团。一个合适的标记技术是用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将含标记的核苷酸掺入到感兴趣的核酸中。例如，将一个含有标记的核苷酸——优选双脱氧核苷酸——与待标记的核酸和足够量的将要掺入核苷酸的TdT一起孵育。优选核苷酸是附着生物素标记的双脱氧核苷酸——即ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP等。
可使用优化长序列扩增的技术。这些技术对基因组序列很奏效。这些方法在以下文献中公开未决的2001年9月5日提交的US专利申请USSN60/317,311；USSN(未授予申请号)，代理案卷号1011N-1，2002年1月9日提交的名称为“选择引物对的运算法则”的申请；和USSN(已授予申请号)，代理案卷号1011N1D1，2002年1月9日提交的名称为“核酸扩增方法”的申请，这些方法尤其适合用在本发明的方法中扩增基因组DNA。
扩增序列可在标记前或标记后进行其它扩增后处理。例如，在一些情况下，期望在与寡核苷酸阵列杂交前将扩增序列分成片段。一般可用本领域技术人员所知的物理、化学或酶学方法对核酸进行分段。合适的技术包括但不限于，迫使含核酸的液体样本通过狭窄的缝隙或用核酸酶消化PCR产物，给扩增核酸一个剪切力。适当的核酸酶的一个例子是脱氧核糖核酸酶I。扩增后，可在核酸酶存在下孵育PCR产物一段时间，以产生合适长度的片段。片段的长度可根据期望而改变，例如，通过增加核酸酶的量或孵育持续时间以产生较小片段，或通过降低核酸酶的量或孵育持续时间产生较大片段。调整消化条件以产生期望大小的片段在本领域普通技术人员的能力范围内。然后可用上述方法标记所产生的片段。检测SNPs的方法(SNP发现)可用任何本领域技术人员所公知的技术来确定核酸中一个或更多变异的存在和缺失。可使用任何允许精确确定变异的技术。优选技术允许使用需要最少样本处理的方法快速、精确确定多个变异。下面提供了一些适当技术的例子。
DNA测序的几个方法是本领域技术人员熟知的并通常可获得的，可用于确定基因组中SNPs的位置。参见，如Sambrook，et al.，Molecular CloningALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，New York)(1989)和Ausubel，et al.，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，NewYork)(1997)，此处引入作为参考。这些方法可用于确定来自不同DNA链的相同基因区域的序列，比较该区域的序列，记录差异(链间的变异)。DNA测序方法可使用这样的酶，如DNA聚合酶I的克列诺片段，测序酶(USBiochemical Corp，Cleveland，Ohio.)，Taq聚合酶(Perkin Elmer)，耐热T7聚合酶(Amersham，Chicago，Ill.)，或联合使用聚合酶和校正核酸外切酶，如那些以Gibco/BRL(Gaithersburg，Md.)为商标的延伸扩增系统中的酶。优选地，用机器自动进行这个过程，如Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton，Reno，Nev.)，Peltier热循环仪(PTC200；MJ Research，Watertown，Mass.)和ABI催化剂和373和377DNA测序仪(Perkin Elmer，Wellesley，MA)。
另外，可用商业上可获得的毛细管电泳体系进行变异或SNP分析。尤其是，毛细管测序可使用电泳分离的可流动聚合体，激光激活的4种不同的荧光染料(每种染一种核苷酸)，用电荷偶联装置照相机检测散发的波长。输出/光强度可用适当的软件(如基因型和序列导航器，Perkin Elmer，Wellesley，MA)转换为电信号，从载入样本到计算机分析和电子数据显示的整个过程可由计算机控制。再者，该方法可用于确定来自不同DNA链的相同基因组区域的序列，比较该区域的序列，记录差异(链间的变异)。
可选择地，一旦测序确定了来自一个参照DNA链的基因组序列，就可能使用杂交技术确定参照链和其它DNA链间的序列变异。这些变异可能是SNPs。一个适当的杂交技术的例子包括使用DNA芯片(寡核苷酸阵列)，如那些可从Affymetrix，Inc.Santa Clara，CA.获得的DNA芯片。使用DNA芯片检测如SNPs的详细情况见授权给Lipshultz等的美国专利No.6,300,063和授权给Chee等的美国专利No.5,837,832，HuSNP图谱方法，试剂盒和使用手册，Affymetrix部分No.90094(Affymetrix，Santa Clara，CA)，在这里均引入作为参考。
在优选实施方案中，扫描参照序列和另一条DNA链的10,000多个碱基的变异。在更优选实施方案中，扫描参照序列和另一条DNA链的超过1×106个碱基的变异，甚至更优选扫描参照序列和另一条DNA链的超过2×106个碱基，更优选扫描1×107个碱基，更优选扫描超过1×108个碱基，更优选扫描参照序列和另一条DNA链的超过1×109个碱基的变异。在优选实施方案中，至少扫描外显子的变异，在更优选实施方案中，扫描内含子和外显子的变异。在更加优选实施方案中，扫描内含子、外显子和基因间序列的变异。在优选实施方案中，被扫描的核酸是基因组DNA，包括编码区和非编码区。最优选实施方案中，这种DNA来自哺乳动物，如人类。在优选实施方案中，扫描来自生物体的10％以上的基因组DNA，在更优选实施方案中，扫描来自生物体的25％以上的基因组DNA，在更优选实施方案中，扫描来自生物体的50％以上的基因组DNA，在最优选实施方案中，扫描来自生物体的75％以上的基因组DNA。在本发明的一些实施方案中，不扫描基因组中已知的重复区，并且不计入被扫描的基因组DNA的百分比。这种已知的重复区可以包括单一散布核元件(SINEs，如alu和MIR序列)，长散布核元件(LINEs，如LINE1和LINE2序列)，长末端重复(LTRs，如MaLRs，Retrov和MER4序列)，转座子和MER1和MER2序列。
简言之，在一个实施方案中，采用——如加热到95℃——使适当溶液中标记过的核酸变性，含变性核酸的溶液与DNA芯片共同孵育。孵育后，移去溶液，可用适当的洗涤液洗涤芯片以去除未杂交核酸，检测芯片上杂交核酸的存在。洗涤条件的严格性可根据需要调节，以产生稳定的信号。检测杂交核酸可直接进行，例如如果核酸含有荧光报告基团，荧光可以直接检测到。如果核酸上的标记不能直接检测到，例如，生物素，则可以在检测前加入含可检测标记，如，偶联于藻红素的链霉亲和素的溶液。其它可增强信号水平的试剂也可于检测前加入，例如，可以联合使用链霉亲和素特异性生物素化抗体和生物素、链霉素和素—藻红素检测体系。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的寡核苷酸阵列中每个阵列含有至少1×106个探针。在优选实施方案中，本发明的方法中使用的寡核苷酸阵列中每个阵列含有至少10×106个探针。在更优选的实施方案中，本发明的方法中使用的寡核苷酸阵列中每个阵列含有至少50×106个探针。
一旦使用，如测序或微阵列分析法确定了变异位点(SNP发现)，有必要对对照和样品群的SNPs进行基因分型。刚才描述的杂交方法对这一目的很奏效，它提供了一种对多个样品中的SNPs进行精确和快速检测与基因分型的技术。此外，适于检测基因组DNA中SNPs的技术——无扩增——是Invader技术，可从Third Wave Technologies，Inc.，Madison，WI得到。此技术用于检测SNPs的用途可在如Hessner，et al.，Clinical Chemistry 46(8)1051-56(2000)；Hall，et al.，PNAS 97(15)8272-77(2000)；Agarwal，et al.，Diag.Molec.Path.9(3)158-64(2000)和Cooksey，et al.，Antimicrobial and Chemotherapy 44(5)1296-1301(2000)中发现。在Invader步骤中，两个短DNA探针与靶核酸杂交形成一种可被核酸酶识别的结构。对于SNP分析，进行两个分离的反应——每一个检测一个SNP变异体。如果探针之一与该序列互补，核酶将对其切割以释放称为“瓣(flap)”的短DNA片段。瓣与荧光标记探针结合并形成另一种可被核酸酶识别的结构。当酶切割标记探针时，探针散发出一种可检测的荧光信号，由此表示存在SNP变异体。
Invader技术的可替换方法，滚环扩增使用与环状DNA模板互补的寡核苷酸，以产生扩增信号(见如，Lizardi，et al.，Nature Genetics 19(3)225-32(1998)；和Zhong，et al.，PNAS 98(7)3940-45(2001))。寡核苷酸延伸在长多联体内产生环状模板的多个拷贝。典型地，在延伸反应中，可检测标记掺入到延伸的寡核苷酸。延伸反应允许延续进行直到合成的延伸产物量可被检测到。
为了用滚环扩增检测SNPs，使用三个探针和两个环状DNA模板。第一个探针—靶特异性探针—可构建为与靶核酸分子互补，使探针的5’末端与靶核酸中紧邻5’SNP位点的核苷酸杂交。SNP位点不是与第一探针配对的碱基。
其它两个探针——滚环探针——构建为含有两个3’末端。这可通过多种方法完成，如在探针的中心部分引入一个5’-5’键，使核苷酸序列的极性在那个点发生反转。每个探针的一个末端具有与不同的环状模板分子的一部分互补的序列，而另一个末端与靶核酸序列的一部分互补。靶序列互补末端构建为能使最3’端的核苷酸与在SNP位点的核苷酸对比。探针之一可以包含与靶核苷酸SNP位点的核苷酸互补的核苷酸，而另一个包含非互补的核苷酸。在群体中出现两个或更多SNP变异体的情况下，探针可构建为含有与待检变异体互补的3’-核苷酸。
探针——二者均是靶特异性和滚环探针——可与靶序列杂交并与连接酶接触。当滚环探针的最3’端核苷酸与SNP位点的核苷酸形成碱基对时，这两个探针——靶特异性和滚环探针——被有效连接在一起。当滚环探针的最3’端核苷酸不能与靶核酸的SNP位点形成碱基配对时，探针将不被连接在一起。未连接的探针被洗掉，样品接触模板循环、聚合酶和被标记核苷三磷酸。
另一个适于检测SNPs的技术是利用DNA聚合酶的5’-核酸外切酶活性，通过消化探针分子而释放荧光标记核苷酸以产生信号。该方法常常指Taqman方法(如参见Arnold，et al.，BioTechniques 25(1)98-106(1998)；和Becker，et al.，Hum.Gene Ther.102559-66(1999))。在一个与SNP位点杂交的探针分子存在下，含SNP的靶DNA被扩增。这个探针分子的5’末端含有荧光报告分子标记的核苷酸，3’末端含有猝灭剂标记的核苷酸。选择探针序列，使探针中与靶DNA的SNP位点对比的核苷酸尽可能接近探针的中心，使正确配对探针和错配探针间的解链温度差异最大。当进行PCR反应时，正确配对的探针与靶DNA的SNP位点杂交，并被PCR方法中使用的Taq聚合酶消化。消化使荧光标记核苷酸与猝灭剂物理分离，伴随荧光增加。在PCR反应的延伸过程期间，错配探针不再继续杂交，并且，因此不再被消化，荧光标记核苷酸继续保持猝灭。
用聚苯乙烯-二乙烯基苯反相柱的变性HPLC和离子配对活动相可以鉴定SNPs。含有SNP的DNA片段被PCR扩增。扩增后，加热使PCR产物变性，并与SNP位点的核苷酸已知的第二变性PCR产物混合。PCR产物被退火并在升温阶段用HPLC分析。温度选择为使在SNP位点错配的双链分子变性，而不使那些很好配对的分子变性。在这些条件下，异源双链分子一般早于同源双链分子被洗脱。使用这一技术的例子见Kota，et al.，Genome44(4)523-28(2001)。
可用固相扩增和扩增产物微量测序来检测SNPs。采用已经与引物共价结合的珠进行扩增反应。设计引物包括II型限制性内切酶的识别位点。扩增后产生与珠结合的PCR产物，用限制性酶消化产物。限制性酶切割产物产生一个包括SNP位点的单链部分和一个可延伸填充该单链部分的3’-OH。在延伸反应中加入ddNTPs允许对产物直接测序。使用该技术鉴定SNPs的例子见Shapero，et al.，Genome Research 11(11)1926-34(2001)。数据分析图1显示本发明方法的一个实施方案的步骤示意图。一旦SNPs(变异体)已经通过如supra描述的方法(图1的步骤110)被定位或发现，SNP单倍型区块，每个SNP单倍型区块的SNP单倍型模式和SNP单倍型模式的信息型SNPs即可被确定。可使用所有已定位的SNPs或变异体；可替换地，可仅集中分析已定位SNPs的一部分。例如，被分析的一组SNPs可排除SNPs转换形式Cg<->Tg或cG<->cA。此外，在本发明的一个实施方案中，集中分析常见SNPs。常见SNPs是那些在给定群体中其较不常见形式出现频率很低的SNPs。例如，常见SNPs是那些在至少约2％到25％的群体中发现的SNPs。优选实施方案中，常见SNPs是那些在至少约5％到15％的群体中发现的SNPs。更优选实施方案中，常见SNPs是那些在至少约10％的群体中发现的SNPs。常见SNPs可能源于人进化早期的突变。集中分析常见SNPs缩小了对照和实验人群间的系统等位基因或变体差异，这种差异看来与疾病或药物反应相关，但仅由迁移历史或杂交行为所致；即，集中分析常见SNPs降低现代人群异常造成的假阳性。而且，常见SNPs与人群中的更大部分相关，使本发明可更广泛地应用于疾病和药物反应研究。沿着相同线索，仅观察到一次变异的SNPs可从本发明的一些实施方案的分析中排除(例如单一SNPs)。然而，以下的某些分析仍然可以进行，包括这些单一SNPs的一些或全部，尤其是当研究特异性子人群或已受迁移行为等影响的群体时。
在图1的步骤120，将感兴趣的变异体或SNPs分配到单倍型区块用于估计。可对来自整个基因组或染色体的变异体或SNPs进行分析并将其分配到SNP单倍型区块。可替换地，可将仅仅来自于所关注的对一些疾病或药物反应机制呈特异性的基因组区域的变异体分配到SNP单倍型区块。
图2提供了在基因组单倍型区块中如何发生变异(通常是SNPs)的图解，以及在每个单倍型区块中如何能产生一个以上的单倍型模式。如果SNP单倍型模式是完全随机的，预期N个SNPs的SNP单倍型区块中可观察到的SNP单倍型模式的数量将是2N。然而，观察到在执行本发明的方法时，每个SNP单倍型区块中的SNP单倍型模式数量少于2N，因为SNPs是连锁的(不是4N，由于变异体最常是双等位，如，仅发生两种形式之一，而不是所有可能的四种核苷酸碱基)。观察到某些SNP单倍型模式的频率远远高于在非连锁例子中期望出现的频率。因而，SNP单倍型区块是倾向于作为一个单位而遗传的染色体区域，常见模式的数量相对较少。图2中的每一行代表不同个体的单倍体基因组序列的部分。如此处所示，个体W在241位有一个“A”，242位有一个“G”，243位有一个“A”。个体X在241、242和243位有相同的碱基。相反，个体Y在241和243位有一个T，但在242位有一个A。个体Z在241、242和243位与个体Y有相同的碱基。261区块变异体倾向于一起发生。相似地，262区块的变异体倾向于一起发生，区块263的那些突变体也是。当然，图2仅显示了基因组中的几个碱基。事实上，许多碱基与245和248位的碱基类似，个体与个体间不发生变化。
在一个例子中，分配SNPs到SNP单倍型区块，即图1的步骤120，是重复的过程，包括从SNP位点沿着感兴趣的基因区域构建SNP单倍型区块。在一个实施方案中，一旦构建了初始SNP单倍型区块，即可确定构建的SNP单倍型区块中存在的SNP单倍型模式(图1的步骤130)。在一些特殊实施方案中，步骤130中，每个SNP单倍型区块中所选SNP单倍型模式数量不超过约5个。在另一个特殊实施方案中，每个SNP单倍型区块中所选SNP单倍型模式数量，等于鉴定所分析的50％以上DNA链中的SNP单倍型模式所需的SNP单倍型模式数量。换句话说，选择足够的SNP单倍型模式，例如，每个区块选择四个模式，使所分析的DNA链中至少一半有一个SNP单倍型模式与每个SNP单倍型区块中所选的四个模式之一匹配。在一个优选实施方案中，每个SNP单倍型区块中所选SNP单倍型模式数量，等于鉴定所分析的70％以上DNA链中的SNP单倍型模式所需的SNP单倍型模式数量。在一个优选实施方案中，每个SNP单倍型区块中所选SNP单倍型模式数量，等于鉴定所分析的80％以上DNA链中的SNP单倍型模式所需的SNP单倍型模式数量。此外，在本发明的一些实施方案中，将少于一定比例的所分析的DNA链中存在的SNP单倍型模式从分析中排除。例如，在一个实施方案中，如果分析10条DNA链，发现在10个样本中只有一个存在某种SNP单倍型模式，则将其从分析中排除。
一旦选择出感兴趣的SNP单倍型模式，即可确定这些SNP单倍型模式的信息型SNPs(图1的140步)。从初始的单倍型区块，可构建一组满足特定信息量标准的候选SNP区块(图1的150步)。图4和5显示了120、130、140和150步的更详细情况。
在图3中，步骤310提供了新的SNPs区块的评估。在一个实施方案中，所选的第一区块仅含有SNP单倍型序列的第一个SNP；这样在320步，将第一个单一的SNP加入该区区块。在330步，确定该区块的信息量。
在一个实施方案中，一个SNP单倍型区块的“信息量”定义为该区块提供有关基因区域信息的程度。例如，在本发明的一个实施方案中，信息量的计算可以用一个SNP单倍型区块中SNP位点数量除以该区块中为了区别每个考虑的SNP单倍型模式与其它考虑的SNP单倍型模式(信息型SNPs的数量)所需的SNPs数量。另一种信息测量方法可以是该区块中信息型SNPs的数量。本领域技术人员知道信息量可用任何数量的方法来测定。
再次提到图2，SNP单倍型区块261含有三个SNPs和两个SNP单倍型模式(AGA和TAT)。三个存在的SNPs的任何一个可用于分别表达这些模式；因而，可选择这些SNPs中的任何一个作为这个SNP单倍型模式的信息型SNP。例如，如果确定了一个样本核酸在第一位置含有一个T，同一样本将在第二位置含有一个A，在第三位置含有一个T。如果确定了第二个样本的第二个位置的SNP是G，第一和第三SNPs将是A。因而，根据信息量的一个测定方法，第一区块的信息量值是3即3个总SNPs除以区分各模式所需要的1个信息型SNP。相似地，SNP单倍型区块262含有三个SNPs(两个位点无变异)和两个单倍型模式(TCG和CAC)。在先前分析的区块中，可估计三个SNPs中任何一个来区分一个模式与另一个之间的差异；因此，该区块的信息量是3即3个总SNPs除以区分各模式所需要的1个信息型SNP。SNP单倍型区块263含有五个SNPs和两个SNP模式(TAACG和ATCAC)。同样，五个SNPs的任何一个都可用于区别一个模式与另一个模式；因而，该区块的信息量是5即5个总SNPs除以区分各模式所需要的1个信息型SNP。
图2提供了一个遗传学分析的简单例子。当一个SNP单倍型区块中存在几个SNP单倍型模式时，可能需要使用一个以上的SNP作为信息型SNPs。例如，在一个例子中，一个SNP单倍型区块中含有，如六个SNPs，两个SNPs是区分感兴趣模式所需的，该区块的信息量是3即6个总SNPs除以区分各模式所需的2个SNPs。一般地说，多至2N个不同的SNP单倍型模式可用N个适当选择的SNPs的基因型来区分。因此，如果在SNP单倍型区块中仅存在两个SNP单倍型模式，单一SNP应该能够将二者区分开来。如果有三个或四个模式，可能需要至少两个SNPs，等。
在图3的步骤340中，一旦SNP单倍型区块的信息量确定，即可进行一个测验。该测验主要是基于选择的标准估计SNP单倍型区块(例如，一个单倍型区块是否满足信息量的阈测量值)，测验的结果决定是否，例如，向该区块中加入另一个SNP进行分析或是否用新的单倍型区块从不同的SNP位点开始进行分析。图4图解该过程的一个实施方案。
在图4中，假定有一个含有六个SNP位点的DNA序列。上述SNP单倍型区块的分析可以下述方式进行SNP单倍型区块A选择仅在SNP位置1含SNP(图3的310步和320步)。计算该区块的信息量(330步)，确定该区块的信息量是否满足信息型阈测定值(340步)。在这种情况下，它“通过”并发生了两件事。一，一个SNP的单倍型区块(SNP位置1)被加入候选SNP单倍型区块组中(350步)。二，另一个SNP(这里，SNP位置2)被加入该单倍型区块(320步)以创建一个新的单倍型区块，B，含有SNP位置1和2，然后再分析。在这个例子中，B区块也满足信息量的阈测量值(340步)，因此它将被加入候选SNP单倍型区块组中(350步)，另一个SNP(这里，SNP位置3)被加入该单倍型区块(320步)以创建一个新的单倍型区块C，含有SNP位置1、2和3，然后再分析。在这个例子中，C区块也满足信息量的阈测量值(340步)，并被加入候选SNP单倍型区块组中(350步)，另一个SNP(这里，SNP位置4)加入该单倍型区块(320步)以创建一个新的区块D，含有SNP位置1、2、3和4，然后再分析。在这个图4的图解中，SNP区块D不满足信息量的阈测量值。不将SNP区块D加入候选SNP单倍型区块组中(350步)，也不将另一个SNP加入区块D进行分析。而是选择一个新的SNP位点进行一轮SNP区块评估。
在图4中，单倍型区块D不满足信息量的阈测量值时，选择一个新的区块E，仅在位置2含有SNP。估计区块E的信息量，发现满足信息量的阈测量值，将其加入候选SNP单倍型区块组中(350步)，将另一个SNP(这里，SNP位置3)加入该单倍型区块(320步)以创建一个新的区块F，含有SNP位置2和3，然后再分析，等等。注意区块H不满足信息量的阈测量值，不将其加入候选SNP单倍型区块组中(350步)，也不将另一个SNP加入区块H进行分析。而是选择仅在位置3含有SNP的一个新的区块I，等等。
一旦构建了一组候选SNP区块(图3的350步)，对其进行分析，选择最终的SNP区块组(图1的160步)。可采用多种方法选择最终的SNP区块组。例如，回到图4，可选择含SNP位置1的最大SNP区块，它通过了阈检测值(C区块，含SNPs1，2和3)，放弃含相同SNPs的较小的区块(A和B区块)。然后下一个被选区块可能是起始于SNP位置4的下一个区块，它是满足信息量的阈测量值的最大的区块(G区块)，放弃含相同SNPs的较小的区块(E和F区块)。这种方法可得到一组跨越感兴趣基因组区域的无重叠最终SNP单倍型区块，它含有感兴趣的信息量水平高的SNPs。这样，一旦评估了所有候选SNP单倍型区块，在一个优选实施方案中，结果将是一组涵盖了原始组所有SNPs的无重叠SNP单倍型区块。一些组中，称为分离组，可能仅由单一SNP组成，根据定义，其信息量为1。其它组可能由一百或更多SNPs组成，含有30个以上信息量。
图5A和5B显示了一种筛选最终SNP单倍型区块组的替代方法。首先看图5A，在第一步510，分析候选SNP单倍型区块组(例如，由这里的图3和图4描述的方法得到)的信息量。在520步，选择完全候选组中信息量最高的候选SNP单倍型区块，加入到最终SNP单倍型区块组(530步)。一旦这个SNP单倍型区块被选为最终SNP单倍型区块组的成员，就从候选单倍型区块组中删除(540步)，将与已选区块重叠的所有其它候选SNP单倍型区块从候选SNP单倍型区块组中删除(550步)。下一步，分析候选组中剩余的候选SNP单倍型区块的信息量(510步)，选择信息量最高的候选SNP单倍型区块，加入最终SNP单倍型区块组(520和530步)。同前，一旦这个SNP单倍型区块被选为最终SNP单倍型区块组的成员，就从候选单倍型区块组中删除(540步)，将与已选区块重叠的所有其它候选SNP单倍型区块从候选SNP单倍型区块组中删除(550步)。这个过程持续到构建了一组最终的无重叠SNP单倍型区块，这些区块涵盖了原始组的所有SNPs。
图5B图示了图5A中所述的筛选最终SNP单倍型区块的方法的简单过程。在图5B中，根据本发明的方法分析5’到3’序列的SNPs，SNP单倍型模式和候选SNP单倍型区块。这个序列中所包含的候选SNP单倍型区块由其在序列下的位置指示，用一个字母指示。此外，在字母后，指出每一区块的信息量。例如，候选SNP单倍型区块A位于序列的最5’末端，信息量是1。候选SNP单倍型区块R位于序列的最3’末端，信息量是2。
根据图5A，在第一步510中，分析候选SNP单倍型区块的信息量，在520步中，选择信息量最高的SNP单倍型区块，加入到最终SNP单倍型区块组(520和530步)。在图5B的例子中，信息量为6的候选SNP单倍型区块M将是第一个被选择加入最终SNP单倍型区块组的候选SNP单倍型区块。一旦选择了SNP单倍型区块M，即从候选SNP单倍型区块中删除或去除(540步)，所有其它与SNP单倍型区块M重叠的候选SNP单倍型区块(J，N，K，L，O和P区块)都从候选SNP单倍型区块组中删除(550步)。下一步，分析候选SNP单倍型区块组中剩余区块，即单倍型区块A、B、C、D、E、F、G、H、I、Q和R的信息量，在520步，信息量最高的剩余SNP单倍型区块，I，信息量是5，被选择加入最终SNP单倍型区块组(530)，并从候选SNP单倍型区块中删除或去除(540步)。下一步，在550步，将与SNP单倍型区块I重叠的所有其它候选SNP单倍型区块，在这里，只有H区块，从候选SNP单倍型区块组中删除。再次分析候选SNP单倍型区块组中剩余SNP单倍型区块，即单倍型区块A、B、C、E、F、G、Q和R的信息量。在520步中，信息量最高的剩余SNP单倍型区块F，信息量是4，被选择加入最终SNP单倍型区块组(530)，并从候选SNP单倍型区块中删除或去除(540步)。下一步，与SNP单倍型区块F重叠的所有其它的候选SNP单倍型区块—这里是，E、G、C和D区块—从候选SNP单倍型区块组中被删除，分析候选SNP单倍型区块组中剩余区块，即SNP单倍型区块A，B，Q和R的信息量，等等。
可使用其它方法从候选SNP单倍型区块组中选择用于分析的最终SNP单倍型区块组(图1的160步)。例如，为了这个目的可使用本领域知晓的计算法则。例如，使用最短路径计算法则(通常见，Cormen，Leiserson，and Rivest，Introduction to Algorithms(MIT Press)pp.514-78(1994).)在最短路径问题中，给出了一个带有权重函数wE→R的加权的、定向的曲线图G＝(V，E)，权重函数将各边映射为真实权重。路径P＝(v0，v1，…vk)的权重是其组成边加权值的总和w(p)=Σi=1kw(vi-1,vi).]]>如果存在u到v的路径，从u到v的最短路径权重由δ(u，v)定义，等于最小w(p)u→v；否则，δ(u，v)等于无穷大。接着顶点u到顶点v的最短路径由权重为w(p)＝δ(u，v)的任何路径p定义。边权重可解释为多种度量标准例如，距离、时间、价值、惩罚、损失或其它任何沿路径线性蓄积的期望最小的数量。本发明一个实施方案中所用的最短路径计算法则，每个SNP单倍型区块被认为是“顶点”，该单倍型区块的每个边界定义为“边”。每个SNP单倍型区块与每个其它SNP单倍型区块存在联系，每个边有“价值”。价值由选择的参数决定，如最高点的重叠(或其程度)或最高点间的距离。
单源最短路径问题集中在给定的图G＝(V，E)，确定给定的源顶点s∈V到每个顶点v∈V的最短路径。而且，可应用多种单源的计算法则。例如，可应用单一终点的最短路径解法，可发现从每个顶点v到给定终顶点t的最短路径。逆转图中每个边的方向使问题减为单源问题。可替换地，可应用单对最短路径问题，发现对于给定顶点u和v，从u到v到最短路径。如果源顶点u的单源问题解决了，单源最短路径问题也就解决了。而且，可使用所有成对最短路径方法。在这种情况下，发现对于每对顶点u和v，从u到v的最短路径——单源运算法则从每个顶点开始进行。
本发明方法可使用的一个单源最短路径运算法则是Dijkstra’s运算法则。Dijkstra’s运算法则在加权的、定向的曲线图G＝(V，E)上解决了所有边权重是非负数情况下的单源最短路径问题。dijkstra’s运算法则保留一组顶点S，它们从源s的最终最短路径权重已经确定了。即，对所有顶点v是元件S，d[v]＝δ(s，v)。运算法则重复选择顶点u作为最短路径估计值最小的V-S的元件，，将u插入S，释放所有由u发出的边。在执行过程中，保留包含V-S中所有顶点的优先队列Q，以d值为基准。执行时，假定图G由邻接列表表示。Dijkstra(G，w，s)1INITIALIZE-SINGLESOURCE(G，s)2S←3Q←V[G]4while Q≠5do u←EXTRACT-MIN(Q)6S←SU{u}7for each vertex v∈Adj[u]8do RELAX(u，v，w)这样，本例中的G是所分析的基因组序列的线性覆盖图，S是选择的顶点组。一旦选择了一个覆盖基因组序列特定区域的顶点，可放弃其它与该序列重叠的顶点。
可采用其它运算法则来筛选SNP单倍型区块，包括greedy运算法则(还参见Cormen，Leiserson，and Rivest，Introduction to Algorithms(MIT Press)pp.329-55(1994).)。greedy运算法则通过选择序列得到了解决问题的最佳方法。对于运算法则中每个决定点，选择此时看来最好的选择。这种启发式的策略不是总能产生最佳的解决方法。greedy运算法则不同于动态编程中的运算法则，在动态编程中，每步都作出选择，但选择可依赖于子问题的解决方法。在greedy运算法则中，选择任何此时看来最好的选择，接着解决选择后产生的子问题。因而，greedy运算法则作出的选择依赖于到此为止作出的选择，但不依赖于任何未来的选择或子问题的解决方法。greedy运算法则的一个可变方法是Huffman代码。Huffman greedy运算法则构建了最佳前缀码，该法则建立了对应于自底向上方式中最佳代码的T树。它起始于一组|C|叶，执行一系列|C|-1“合并”序列操作，以产生终树。例如，假定C是一组n个字符，每个字符c∈C是具有确定频率f[c]的对象；用以f为关键码的优先队列Q鉴定两个频率最低的合并在一起的对象。两个对象合并的结果是一个新的对象，其频率是被合并的这两个对象频率之和。例如1.n←|C|2.Q←C3.for i←1 to n-14.do z←ALLOCATE-NODE()5.x←left[z]←EXTRACT-MIN(Q)6.y←right[z]←EXTRACT-MIN(Q)7.f[z]←f[x]+f[y]8.INSERT(Qz)9.return EXTRACT-MIN(Q)第2行用C中的字符初始化优先队列Q。第3-8行的for循环重复提取队列中最低频率的两个节点x和y，并在队列中用新节点z替代它们，表示它们的合并。在第7行中，Z的频率计算为x和y频率的总和。节点z以x作为其左侧后代，y作为其右侧后代。在n-1个合并之后，队列中左侧的一个节点——代码树的根——在第9行中被返回。
同样，这些方法产生了一组最终无重叠的SNP单倍型区块，它涵盖了在特定基因组区域中评估的所有SNPs。根据本发明的方法，筛选SNPs、SNP单倍型区块和SNP单倍型模式的一个重要结果是，在一些实施方案中，计算SNP单倍型区块的信息量的过程中，可确定每个SNP单倍型区块和模式的信息型SNPs。信息型SNPs允许压缩数据。在本发明的一个实施方案中，从每个含p模式的组中选择至少log2p个SNPs(近似到最近的整数)，提供了一组信息型SNPs，它对于预示基因型/表型关联非常有利。本领域技术人员知道在其它分析中，不需要使用空间邻近组来确定这样的亚组。例如，在本发明的一些实施方案中，可能期望鉴定非邻近SNPs组，它们从统计学角度是以类似于SNP单倍型区块的方式传递，即使它们在DNA链中不是空间邻近的。
为了确定将精确用于关联研究的SNP单倍型区块(建立一个精确的SNPs和SNP单倍型区块和模式的基线)，需要检测几个以上的个体DNA链。图6图示了检测至少约5个不同的DNA链对于确定SNP单倍型区块以及选择信息型SNPs的重要性。图6的顶部图解了DNA的假定片段序列，指出了变异位点并画出了变异区块边界；然而，开始不知道SNP单倍型区块边界。如图所示，通常在相对少量个体测序后，可能确定出大部分常见SNPs。在图6的例子中，图6顶部显示的每个位点的SNPs已经被鉴定，由画勾的标记表示。
然而，如果不评价更多的个体，不可能在这个阶段正确鉴定区块的边界。例如，尽管在这个阶段可以画出620和630区块间的边界(注意第一个C→G变异预示第一个G→A变异，第一个C→T变异预示第二个C→T变异)，在这个阶段不可能区分区块630和640。在此阶段，看来第一C→T变异将预示第一个和第二个T→A变异。因此，需要更多的统计学显著性样本组来绘出区块的边界。例如，在本发明的方法中，确定SNP单倍型区块、SNP单倍型模式，和/或信息型SNPs所分析的DNA链的数量是大数目，例如至少约5或至少约10。在优选实施方案中，分析的DNA链的数量至少是16。在更优选实施方案中，分析确定SNP单倍型区块、SNP单倍型模式，和/或信息型SNPs的DNA链的数量至少是25。然而，一旦相关SNPs已经确定(即已进行了SNP发现)，就可能仅对剩余样本中的变异位点进行基因分型，在不对完整基因组DNA片段进行测序的情况下，完成鉴定单倍型区块边界的过程。这种方法的例子见2002年1月6日申请的USSN10/042,819，代理案卷号是1016N-1，名称为“全基因组扫描”。
在图6中650显示了仅对另一个假定基因组样本中的SNPs进行基因分型处理的结果。如图所示，通过这个额外的分型步骤，现在可能看到630和640单倍型区块可区分开来。特别是现在可能看到第一个C→T变异不与第一个和第二个T→A变异相伴，而是，第一个C→T变异仅可用于预示第二个C→T变异(反之亦然)，以及第一个T→A变异仅可用于预示第二个T→A变异(反之亦然)。
除了上述本发明的方面，本发明一个特殊的实施方案是它能用于解决模糊SNP单倍型序列的数据分析问题。例如，一个SNP可能是模糊的，因为凝胶测序操作资料或阵列杂交实验给出的结果不清晰。这种情况下，“解决”可以指，如通过将SNP单倍型序列与该SNP单倍型序列关系最密切的SNP单倍型模式匹配，来解决SNP单倍型区块中的模糊SNP位点问题。此外，“解决”可以指从数据分析中去除模糊SNP单倍型序列。
解决模糊SNP单倍型序列的一个实施方案中，为了可能加入到模式组，将SNP单倍型序列放在数据组中。为了可能分配到SNP单倍型模式中，数据组将含有所有将要评价的SNP单倍型序列。现在提到图7A，在710步，将数据组中的SNP单倍型序列与模式组中的模式序列进行，逐一比较。在一些情况下，开始时在模式组中没有模式，尽管在其它情况下，一些或全部模式序列已经预先知道。在720步，提出一个问题来自数据组的SNP单倍型序列与模式组中的模式序列一致吗？如果答案是否定的，730步提供了正在评估的SNP单倍型序列将加入到模式组中。如果答案是肯定的，则提出另一个问题来自数据组的SNP单倍型序列是否与模式组中一个以上的模式序列一致？如果答案是肯定的，来自数据组的SNP序列可能被丢弃，或者，在一些实施方案中，保留作进一步或不同的分析(750步)。如果第二个问题的答案是否定的，那么，在760步中，将来自数据组的SNP序列与模式组中与其一致的模式序列比较。从这两个序列中，选择模糊数量最小的SNP序列并放到模式组中(770)。含模糊序列较多的SNP序列可能被丢弃，或，在一些实施方案中，保留作进一步或不同类型的分析。
参考图7A和7B可进一步理解解决过程。在图7B中，第一个SNP序列，TTCGA，与模式组中所含序列进行比较(710步)。在这一点，在模式组中不含有模式序列，这样TTCGA与模式组中任何模式序列都不一致。接着从数据组中去除SNP序列TTCGA的出现(或保留作不同的分析)，并加入到模式组(730)。现在模式组中有了一个模式序列，TTCGA。
再看图7B，数据组中的第二个SNP序列，T？C？？，与模式组中所含序列进行比较(710步)。T？C？？与序列一致(720步)。当此时模式组中只有一个模式序列，TTCGA时，第二个问题SNP序列T？C？？是否与模式组中的一个以上的模式序列一致？的答案(740)是否定的，因为现在模式组中只有一个模式序列，TTCGA。在760步中，T？C？？与TTCGA比较，确定哪个序列更模糊。很清楚是T？C？？；因而，TTCGA被留在模式组中(770)，T？C？？可能被去除或保留作进一步分析。
图7B中数据组中的第三个序列是C？？？？。C？？？？首先与TTCGA比较(710步)，发现与TTCGA不一致(720)，然后加入到模式组(730)。图7B中的第四个序列是CTACA。CTACA与TTCGA和C？？？？比较(模式组中的模式序列，710步)，发现与C？？？？一致(720)。现在提出第二个问题(740)CTACA与C？？？？和TTCGA都一致吗？答案是否定的，因此接着比较C？？？？和CTACA(760)，以及，在这种情况下，模糊数量最少的序列，CTACA保留在模式组中，C？？？？被丢弃(从分析中去除)，或保留作进一步分析(770)。
图7B数据组中的第五个序列是？T？？A。将这个SNP序列与模式序列TTCGA和CTACA(710)比较，发现与TTCGA和CTACA都一致。因而，问题740的答案是肯定的？T？？A与模式组中一个以上的模式序列一致。在750步中，SNP序列？T？？A保留作进一步的分析或丢弃(从分析中去除)。解决问题的另外的方法允许这种情况，比如，如果模式序列是CCATT？，数据组的SNP序列是C？ATTG，那么序列“联合”解决模糊问题(CCATTG)，“联合”序列加入到模式组中。另外的阵列杂交，可使用测序或本领域所知的其它技术分析模糊SNP核苷酸位点。SNP单倍型区块和模式与表型的关联鉴定出的SNP单倍型区块，SNP单倍型模式和/或信息型SNPs可用于各种遗传分析。例如，一旦鉴定了信息型SNPs，它们可用于大量不同的关联研究实验。例如，探针可设计为询问这些信息型SNPs的微阵列。其它作为示范的测定包括，如，前面描述的Taqman测定和Invader测定，及常规PCR和/或测序技术。
在一些实施方案中，如图1的170步所示，鉴定的单倍型模式可用于上面提到的测定，进行关联研究。通过确定带有感兴趣表型的个体(例如，表现出特殊疾病的个体或对特殊给药方式有反应的个体)的单倍型模式，并比较这些个体的单倍型模式频率和对照组个体的单倍型模式频率，可完成这种研究。这种SNP单倍型模式的鉴定优选是全基因组范围的；然而可以仅仅是基因组中感兴趣的特殊区域，及使用的这些特殊区域的SNP单倍型模式。除了这里公开的本发明的方法中的其它实施方案，这些方法额外提供表型“剖析”。也就是说，一个特殊表型可能由两个或更多不同的遗传碱基产生。例如，一个个体的肥胖可能是X基因缺陷的结果，而不同个体中的肥胖可能是基因Y和基因Z突变的结果。因而，本发明的基因组扫描能力允许剖析相似表型的不同遗传碱基。一旦确定基因组的特殊区域与一个特殊的表型相关，这些区域可用作药物发现靶(图1的180步)或作为诊断标记(图1的190步)。
正如前段所述，进行关联研究的一个方法，是将带有感兴趣表型的个体的SNP单倍型模式频率与对照组个体的SNP单倍型模式频率相比较。在优选方法中，用信息型SNPs进行SNP单倍型模式比较。使用信息型SNPs的方法与迄今本领域所知的其它整个基因扫描或基因分型方法相比有极大的优势，不是阅读每个个体基因组的全部30亿个碱基—或甚至不阅读可能发现的3-4百万个常见SNPs—仅需确定一个样本群的信息型SNPs。正如上所述，阅读这些特殊的信息型SNPs，提供了足够的信息，可从特殊实验群中提取统计学精确的关联资料。
图8显示了用本发明的方法确定遗传关联的方法的实施方案。在800步中，确定对照人群的基因组中信息型SNPs的频率。在810步，确定临床人群的基因组中信息型SNPs的频率。800和810步可采用前述SNP测定而分析个体群中的信息型SNPs。在820步中，比较800步和810步得出的信息SNP频率。可采用，例如，确定每群的每个信息型SNP位点中最小等位基因频率(带有特殊最小等位基因的个体数量除以全部个体数量)并比较这些最小等位基因频率的方法，进行频率比较。在830步中，选择在对照与临床人群发生频率间显示差异的信息型SNPs进行分析。一旦选择了信息型SNPs，即可鉴定出含信息型SNPs的SNP单倍型区块，反过来可确定感兴趣的基因组区域(840步)。用本领域所知的遗传学或生物学方法分析基因组区域(850步)，分析这个区域用作药物发现靶(860步)或作为诊断标记(870步)的可能性，如下详述。鉴定基因组序列的用途一旦基因组中遗传学位点或多个位点与一个特殊表型性状相关——如，疾病易感性位点——即可确定与该性状相关的一个或多个基因或调控元件。这样，这些基因或调控元件可被用作治疗该疾病的治疗靶，如图1的180步或图8的860步所示。用本发明的方法确定的基因组序列可以是基因或非基因序列。术语“基因”意指编码特殊多肽的开放阅读框架(ORF)、内含子区域，及5’和3’的非编码核苷酸序列，它参与调节编码区上游最多到约10kb的基因表达，但可能进一步调节任意一个方向。由于鉴定到的基因的ORFs对蛋白结构的影响，它可影响疾病状态。可替换地，鉴定到的基因或非基因序列的非编码区可以通过影响蛋白表达的水平或表达的特异性而影响疾病状态。一般地讲，通过分离对基本不含其它核酸序列(其它核酸序列不包括基因序列)的鉴定基因而进行基因组序列的研究。DNA序列可用于多种途径。例如，DNA可用于检测或定量生物学样本的基因表达。文献中已经很好地建立了探测细胞中存在特殊核苷酸序列的方式，这里不需要再详述，然而，仍参见，如，Sambrook，et al.，Molecular CloingA Laboratorv Manual(Cold Spring HarborLabortory，New York)(1989)。
此外，基因的序列，包括启动子区域和编码区侧翼，可发生本领域所知的各种方式的突变，在表达水平引起定向改变，或编码蛋白的序列发生改变，等等。序列改变可以是置换、插入、易位或缺失。缺失可包括大的改变，如完整区域或外显子缺失。克隆基因的体外诱变技术是已知的。位点特异性诱变方案的例子可在Gustin，et al.，Biotechniques 1422(1993)；Barany，Gene 37111-23(1985)；Colicelli，et al.，Mol.Gen.Genet.199537-9(1985)；Prentki，et al.，Gene29303-13(1984)；Sambrook，et al.，Molecular CloningA Laboratorv Manual(ColdSpring Harbor Press)pp.15.3-15.108(1989)；Weiner，et al.，Gene 12635-41(1993)；Sayers，et al.，Biotechniques 13592-6(1992)；Jones and Winistorfer，Biotechniques12528-30(1992)；和Barton，et al.，Nucleic Acids Res.187349-55(1990)中找到。这种突变基因可用于研究蛋白产物的结构/功能之间的关系，或可用于改变影响蛋白的功能或调节的蛋白特性。
可用鉴定的基因来产生相应多肽的全部或部分。为了表达蛋白产物，使用一个掺入鉴定基因的表达盒。表达盒或载体通常提供一个转录和翻译起始区，可能是诱导型或组成型，编码区在转录起始区，转录和翻译终止区的转录控制下与其可操作性连接。这些控制区可以是鉴定基因的天然形式，或可以源自外源性来源。
肽可按照常规方法在原核或真核中表达，取决于表达的目的。为了大规模生产蛋白，单细胞生物体，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母、与杆状病毒载体组合的昆虫细胞，或较高级生物，如脊椎动物，尤其是哺乳动物的细胞，如COS7细胞，可用作表达的宿主细胞。在许多情况下，期望在真核细胞表达基因，真核细胞将利于基因的天然折叠和翻译后修饰。小肽也可在实验室合成。在大量蛋白或其片段存在的情况下，可按照常规方法分离和纯化该蛋白。可制备表达宿主的裂解物，除了层析、凝胶电泳、亲和层析或其它纯化技术，可用HPLC纯化蛋白或其片段。
表达蛋白可用于生产抗体，短片段诱导特定多肽特异性抗体(单克隆抗体)的表达，以及大片段和完整蛋白允许产生超过多肽长度的抗体(多克隆抗体)。用常规方法制备抗体，表达的多肽或蛋白自身或与已知免疫原性载体，如KLH，pre-S HbsAg，其它病毒或真核蛋白等结合作为免疫原。可使用多种佐剂，进行一系列适当的注射。对于单克隆抗体，一次或更多加强注射后，分离脾脏，通过细胞融合使淋巴细胞无限增殖，筛选高亲和抗体结合。然后可以展平无限增殖细胞，即产生所需抗体的杂交瘤。进一步的描述，见MonoclonalAntibodiesA Laboratory Manual.Harlow and Lane，eds.(Cold Spring HarborLaboratories，Cold Spring Harbor，N.Y.)(1988)。如果需要，可分离编码重链和轻链的mRNA，在大肠杆菌中克隆诱变，混合重链和轻链，进一步增强抗体的亲和性。作为培养抗体的方法的体内免疫法的替换方法包括与噬菌体“显示”文库结合，常常联合体外亲和成熟。
鉴定出的基因、基因片段或编码蛋白或蛋白片段可能在基因治疗退行性和其它疾病中有用。例如，可用表达载体将鉴定基因导入细胞。这种载体通常在启动子序列附近具有方便的限制性位点，可在受体基因组中插入核酸序列。制备的转录盒可包括转录起始区域，靶基因或其片段，以及转录终止区域。转录盒可导入各种载体，如，质粒、逆转录病毒，如，慢病毒属；腺病毒等，在这里载体能够暂时或稳定存在于细胞中。该基因或蛋白产物可采用任何数量的途径，包括病毒转染、显微注射或小泡融合直接导入组织或宿主细胞。肌内给药可以采取喷射注射的方式，如Furth，et al.，Anal.Biochem，205365-68(1992)所述。可替换地，如文献中所述，DNA可包被到金微粒上，通过粒子轰击装置或“基因枪”将其皮内运送，(如见Tang，et al.，Nature，356152-54(1992))。
反义分子可用于下调细胞中鉴定到的基因的表达。反义试剂可能是反义寡核苷酸，尤其是有化学修饰的合成反义寡核苷酸，或能表达这种反义分子如RNA的核酸构建体。可联合给予反义分子，这里联合可包括多种不同的序列。
作为反义抑制剂的替换物质，催化性核酸化合物，如，核酶、反义缀合物等，可用于抑制基因表达。核酶可在体外合成并给予患者，或可编码在表达载体上，核酶在靶细胞中从表达载体合成(例如，见国际专利申请WO9523225，和Beigelman，et al.，Nucl.Acids Res.234434-42(1995))。具有催化活性的寡核苷酸例子在WO9506764中有述。反义寡核苷酸与金属复合物如三联吡啶铜(II)的缀合物，能够介导mRNA水解，在Bashkin，et al.，Appl.Biochem.Biotechnol.5443-56(1995)中有述。
除了用鉴定的序列进行基因治疗，鉴定的核酸可用于产生遗传学修饰过的非人类动物从而构建疾病的动物模型，或在细胞系中产生位点特异性基因修饰，用于研究蛋白功能或调节。术语“转基因”意欲涵盖遗传学修饰的动物，它含有可在宿主细胞中稳定传递的外源基因，如基因序列可以改变，以产生一种修饰蛋白，或可以是与外源启动子可操作性连接的一个报告基因。转基因动物可通过同源重组得到，此时内源基因位点被改变、取代或破坏。可替换地，核酸构建体可能被随机整合到基因组中。稳定整合的载体包括质粒、逆转录病毒和其它动物病毒、YACs等。感兴趣的转基因哺乳动物，如，牛、猪、山羊、马等，以及，尤其是啮齿动物，如，大鼠、小鼠等。
基因功能研究也可使用非哺乳动物模型，尤其是用那些生物学和遗传学已经被很好地区分的生物体，如雅致枝孢，D.melanogaster和啤酒酵母。目的基因序列可用于剔除相应的基因功能，或弥补确定的基因病变，以确定参与蛋白功能的生理学和生物化学途径。药物筛选可与弥补和剔除研究联合进行，如，研究退行性疾病的进展、检测疗效，或药物发现。
此外，修饰过的细胞或动物在蛋白功能和调节的研究中有用。例如，可以在鉴别基因中进行一系列小的缺失和/或替代而确定不同酶活性结构域、细胞转移或定位等的作用。感兴趣的特异性结构包括但不局限于阻断基因表达的反义结构、显性失活基因突变的表达和鉴别基因的过度表达。也可以提供非正常表达细胞或组织中或在发育反常时期中鉴别基因或其变异体的表达。另外，通过提供细胞中非正常产生蛋白的表达，可以引起细胞行为的改变，这种行为改变可提供关于蛋白正常功能的信息。
可以通过测定蛋白分子推测其结构/功能参数。例如，通过提供大量鉴别基因的蛋白产物，就可以鉴别与该蛋白产物结合、调节或模拟该蛋白产物活性的配体或底物。通过药物筛选，可以鉴别出，如那些在受影响细胞中能导致蛋白功能发生替换或增强的试剂，或是调节或灭活蛋白功能的试剂。这里使用的术语“试剂”代表了任何分子，如能直接或间接改变、模拟或掩饰一个鉴别基因或基因产物生理功能的蛋白或小分子。通常用多数对应于不同试剂浓度的测定混合物进行试验，以获得对不同浓度的差异性反应。一般用这些浓度中的一种作为阴性对照，即浓度为零或处于检测水平之下的浓度。
大量不同的测定法可用于此目的，包括标记的体外蛋白——蛋白结合测定、蛋白—DNA结合测定、电泳迁移率转换测定、蛋白结合免疫测定等。而且，纯化的蛋白或其片段可以用于确定蛋白的三维晶体结构，用该结构可以确定蛋白或其部分的生物学功能、模拟分子间的相互作用及膜融合等。
候选试剂包括大量不同类的化学物质，虽然典型的是有机分子或复合体，但优选分子量大于50，小于约2500道尔顿的小分子有机化合物。候选试剂含有与蛋白结构性相互作用必需的功能基团，尤其是氢键，一般包含至少一个氨基、羰基、羟基、羧基，并常常含有至少两个功能性化学基团。候选试剂常常含有碳环或杂环结构和/或芳香族或有一个或多个上述功能性基团替代的聚芳香族结构。候选试剂还包括但不局限于肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其联合的生物分子。
候选试剂可以通过不同的来源获得，包括合成或天然化合物文库。例如，可以利用多种方法来随机和直接合成大量的有机化合物和生物分子，包括随机寡核苷酸和寡肽的表达。或者，以细菌、真菌、植物或动物提取物的形式存在的天然化合物文库也可利用或易于产生。另外，可以通过常规化学、物理和生化手段很容易地对天然或合成文库和化合物进行修饰，并可用于产生组合文库。可以直接或随机地对已知药理试剂进行如酰化作用、烷基取代、酯化作用、酰胺化等化学修饰，从而产生结构类似物。
在筛选试验为结合测定时，一种或多种分子与一种标记偶联，该标记可以直接或间接地提供一种可检测信号。各种标记包括放射性同位素、荧光素、化学发光剂、酶、特异性结合分子、微粒，如磁性微粒等。特异性结合分子包括成对的，如生物素和链酶亲和素、地高辛和抗地高辛等。为了检测出特异性结合成分，通常根据已知步骤用一种提供检测的分子标记互补成分。在筛选试验中还可以使用多种其它试剂。它们包括，如盐、中性蛋白(如白蛋白)、洗涤剂等，用于促进最佳的蛋白—蛋白结合和/或减少非特异性的或本底的相互作用。蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物剂等试剂可以用来改进检测效率。
试剂可以结合可药用载体，该载体包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗氧化剂、等渗和吸收延迟剂等。这种可以作为药用活性物质的介质和试剂的用途是本领域熟知的。除了作为任何与该活性成分不相容的常规介质和试剂，也考虑了它们在此处所述的治疗组合物和方法中的用途。附加的活性成分也可以加入组合物中。
配方可制备用于多种给药方式。配方可口服、吸入，或可注射，如血管内、肿瘤内、皮下、腹膜内、肌内注射等。治疗配方的剂量可以根据疾病的性质、给药的频率、给药的方式、药物从宿主的清除率等发生很大变化。首剂量可以大些，接着小剂量维持。给药可以不频繁，如一次给予、每周一次或两周一次，或者可分成较小剂量每天或每半周等给药一次，从而保持一个有效的剂量水平。在一些实例中，口服与静脉内给药需要不同的剂量。本发明确定的试剂可以掺入多种用于治疗给药的配方。更优选地，将复合物与适当的、可药用载体或稀释剂结合配伍成药物组合物，也可以将之配制成固体、半固体、液体或气态的制剂，如药片、胶囊、粉末、颗粒、药膏、溶剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球体、气溶胶。这样，试剂的给药可以通过多种途径完成。试剂可在给药后扩散全身，或可以通过使用能使植入部位保持活性剂量的植入物使试剂局限。
下列方法和赋形剂仅仅是作为示范，并不以任何方式限制。对于口服制剂，一种试剂可以单独使用，或与适合的添加剂结合制成药片、粉末、颗粒或胶囊，如与传统的添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉结合；和粘合剂，如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或白明胶结合；和分解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或碳甲纤维素钠结合；和润滑剂，如云母或硬酯酸镁结合；如果需要还可以和稀释剂、缓冲剂、潮湿剂、防腐剂和调味剂混合。
另外，试剂可以通过溶解、悬浮或乳化于水或非水溶剂中配制成注射用制剂，这些溶剂包括植物性或其它相似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙烯乙二醇；如果需要，还可以添加传统的添加剂，如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、固定剂和防腐剂。进而试剂可以用于气溶胶配方中，通过吸入方式给药。本发明确定的药剂可以配制成适合加压的推进剂，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。还可以选择将试剂与不同基质如乳化基质和水溶性基质混合形成栓剂。进一步地，本发明确定的试剂可以通过一种栓剂直肠给药。栓剂可能含有一种载体如可可黄油、聚乙二醇和聚乙烯乙二醇，这些载体在体温下可以溶解，而处于室温时呈固态。
用于持续释放配方的植入物是本领域公知的。植入物可以和可生物降解的或非生物降解聚合物配制成微球体、胶块等。例如，乳酸和/或乙醇酸聚合物能形成易被宿主耐受的一种易蚀的聚合物。包含本发明确定的试剂的植入物可以置于作用位点临近处，这样活性试剂的局部浓度相对于身体的其他部位会增加。可以提供用于口服或直肠给药的制剂如糖浆、酏剂、悬浮液的单位剂量形式，其中一茶匙的量、一大汤匙的量、胶囊、药片或药栓等每一剂量单位含有预定量的本发明的成分。与之相似，用于注射或静脉内给药的单位剂量形式可以包含存在于组合物中，作为无菌水溶液、盐类或其它可药用载体的溶液的本发明的化合物。本发明新的单位剂量形式的规格取决于使用的特定化合物和需要产生的效果，及与宿主中每一种活性试剂相关的药代动力学。
可药用的赋型剂如媒介物、佐剂、载体或稀释剂，公众易于得到。而且，公众也容易得到可药用的辅助性物质，如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、增湿剂等。
给患有疾病或紊乱的病人服用治疗剂量的鉴定试剂。根据特定的疾病进行局部用药、定位用药或是全身性用药。施用的化合物应保持一个有效的剂量，这样可以在一段适当的时期内基本阻止病情进展。体内使用时最好在医生的指导下开取和服用该组合物。剂量随特定的药剂和使用的配方、紊乱的类型、病人的状况等发生变化，这样可以充分地针对疾病或症状，同时减少副作用。治疗可以是短期的，如在外伤后，或是进行长期治疗，如精神分裂症的预防和治疗。
本发明鉴别的SNPs可以用于分析关联基因表达模式和与生物体的表型性状如疾病的易感性或药物反应性等相关的表达模式。可以确定多种组织的表达模式并用来鉴别普遍存在的表达模式、组织特异性表达模式、暂时性表达模式和由各种外部刺激物如化学物质或电磁辐射诱导的表达模式。这种鉴别可以提供关于基因和/或其蛋白产物功能的信息。
新鉴别的序列还可以用作诊断标记，即预测表型特征，如对疾病的易感性或药物反应性。另外，本发明的方法可以用于对临床研究群体分层。同样地，这些基因或其片段可以用作探针来确定被检测生物体基因组中是否存在相同的核酸序列。另外，探针可以用来监控被测生物体或其部分，如特定组织或器官的RNA或mRNA的水平，从而确定与生物体内特定表型性状相关的标记表达水平。同样地，标记可在蛋白水平上分析，可以采用任何常规技术如免疫学方法——蛋白印迹、放射免疫沉淀等——或用活性基础分析测定一种与基因产物相关的活性。而且，当一种表型不能清楚区分有不同遗传基础的相似疾病时，可以用本发明的方法来正确鉴别疾病。
同样，本发明的方法显然能应用于除人类以外的生物体。例如，当该生物是动物时，本发明的方法可以用来鉴别与疾病抵抗力/或易感性、环境耐受力、药物反应等相关的位点，当该生物是植物时，本发明的方法可以用来鉴别与疾病抵抗力/或易感性、环境耐受力或除草剂抵抗力的相关位点。
可以理解本发明并不局限于所述的特定的方法、方案、细胞系、动物种或属、试剂，这些均可以发生改变。还需要说明的是，这里使用的术语只是为了描述特定的实施方案，并不限制本发明的保护范围，本发明的保护范围只能由所附权利要求限定。数据库本发明包括含有与变异相关信息的数据库，例如，这些信息包括有关SNPs、SNP单倍型区块、SNP单倍型模式和信息型SNPs的信息。在一些实施方案中，本发明的数据库可以包含与一个或多个表型性状相关的一个或多个单倍型模式的信息。数据库还可以包含与给定变异相关的信息，如对发生变异的一般基因组域进行描述的信息，以及诸如变异是否发生在一个已知基因上，和附近是否有已知基因、基因同系物或调节区域等。
本发明数据库还可以包括其他信息，但不限于这些信息，SNP序列信息、关于用于分析SNP单倍型模式的组织样品临床状况的描述性信息，或是与作为样品来源的患者的临床状况的描述性信息。数据库可被设计成包括不同的部分，如变异数据库，SNP数据库，SNP单倍型区块或SNP单倍型模式数据库，信息型SNP数据库。数据库的构造和配置方法可广泛获得，见Akerblom等，(1999)的美国专利US5,953,727，此处引入作为本发明的参考。
本发明的数据库可以链接外部或远程数据库，图9显示了一种适用于数据库和执行本发明软件的计算机网络实例。计算机工作站902通过一个局域网(LAN)如以太网905与应用/数据服务器906相连。打印机904可以直接与工作站或以太网905相连。LAN可以与广域网(WAN)相连，如通过网关服务器907与因特网908相连，网关服务器907也可以作为WAN908和LAN905之间的防火墙。在优选实施方案中，工作站可以通过因特网908联系外部的数据资源，如SNP联盟(TSC)或国家生物技术信息中心909。
可以用任何适宜的计算机平台进行SNP单倍型区块或模式、相关表型、数据库中的其他信息或由外部输入的信息间必要的比较。例如，可以从多个厂商，如Silicon Graphics购得大量计算机工作站。也可广泛获得客户服务器环境、数据服务器和网络，并用作本发明数据库的合适平台。
本发明的数据库还可以用于描述鉴别个体中SNP单倍型模式的信息，用这种描述可以来预测个体的一个或多个表型性状。该方法可以用于预测个体对疾病的易感性/抵抗力和/或对药物的反应。更进一步，本发明的数据库可以包括与本发明变异相关的一个或多个基因的表达水平有关的信息。
以下实施例具体描述了本发明的特定实施方案，但本发明例证的方法和材料并不限制发明的范围。实施例1制备体细胞杂交体用体细胞遗传学的标准方法将人类DNA链(染色体)从二倍体状态分离到单倍体状态。在本例中，一个具有野生型胸苷激酶基因的人二倍体类淋巴母细胞系与一个胸苷激酶基因突变的仓鼠二倍体成纤维细胞系融合，产生的细胞亚群体为包含人类染色体的杂交细胞。将仓鼠细胞系A23细胞吸进一个离心管中，管内有10ml DMEM，其中添加了10％的胎牛血清(FBS)+1×Pen/Strep+10％谷氨酰胺，1500rpm离心5分钟，后重悬于5ml RPMI中，吸移进一个含有15ml RPMI培养基的组织培养瓶中。类淋巴母细胞在37℃生长至汇合。同时，将人类类淋巴母细胞吸移进一个离心管中，管内有10mlDMEM，其中添加了10％的胎牛血清(FBS)+1×Pen/Strep+10％谷氨酰胺，1500rpm离心5分钟，后重悬于5ml RPMI中，吸移进一个含有15ml RPMI的组织培养瓶中。类淋巴母细胞在37℃生长至汇合。
为了制备A23仓鼠细胞，吸走生长培养基并用10ml PBS漂洗细胞。接着用2ml的胰蛋白酶消化细胞，将这些细胞分开置于3-5个有新鲜培养基(没有HAT的DMEM)的培养皿上，于37℃孵育。转移培养基，将类淋巴母细胞移进离心管，以1500rpm离心5分钟，吸走生长培养基，将细胞重悬于5mlRMPI中，吸移1-3ml的细胞至2个装有20ml的RPMI的烧瓶中。
将约8-10×106个类淋巴母细胞1500rpm离心5分钟以获得融合细胞。接着用DMEM重悬漂洗细胞沉淀，再次离心并吸走DMEM，将类淋巴母细胞重悬于5ml于新鲜的DMEM中。受体A23仓鼠细胞生长至汇合，在融合前3-4天前，将其分开，此时细胞已经融合了50-80％。移走原有的培养基后用DMEM漂洗细胞三次，用胰酶消化，最后将细胞重悬于5ml DMEM。小心地把类淋巴母细胞移至受体A23细胞上，轻缓涡旋混合培养基，37℃孵育1小时。孵育后，接着小心地吸走A23细胞的培养基。一只手转动培养皿的同时，另一只手将一个移液管靠在培养皿的边缘缓慢地加入2ml室温PEG1500，其中转动培养皿一周添加所有的PEG大约需要1分钟的时间。接着缓慢转动培养皿的同时沿培养皿边缘加入8ml DMEM。小心地吸走细胞上层的PEG/DMEM混合物，用8ml DMEM漂洗细胞。移走DMEM，再加入10ml新鲜的DMEM，在37℃孵育细胞30分钟，吸走细胞上层的DMEM，加入10ml 10％FBCS和1×Pen/Strep的DMEM后过夜孵育。
孵育后吸走培养基，用PBS漂洗细胞，胰蛋白酶消化细胞，分到含有选择性培养基(含有10％的FBCS+1×Pen/Strep链锁状球菌+1×HAT的DMEM)的培养皿中，这样每块培养皿中约达10万个细胞。铺板后第三天更换培养基。挑出克隆并置于24孔培养板中直到肉眼可见(9-14天)，如果挑出的克隆在5天内就融合，表明生长良好，胰蛋白酶消化细胞并移至6孔板中。
来源于6孔板培养基中的细胞来制备DNA和干杂交细胞培养基。胰蛋白酶消化细胞，在100mm大的含有10ml选择性培养基的板上分开细胞并将之置于Eppendof管中，管中细胞聚集成团，细胞重悬于200μl PBX中，使用QiagenDNA mini试剂盒分离DNA，在每一旋转柱中细胞浓度少于5百万个。待100mm板上细胞生长至融合后，细胞继续培养于培养基中或进行冷冻保存。实施例2选择单倍杂交体使用Affymetrix的HuSNP基因芯片(Affymetrix，InC.，of Santa Clara，CA，HuSNP图谱鉴定、试剂盒和使用手册，Affymetrix Part No.900194)评定人类染色体的存在、缺失和二倍体/单倍体状态，该芯片可以在单芯片杂交中测定1494个标记。作为对照，用HuSNP基因芯片杂交分析筛选仓鼠和人类二倍体类淋巴母细胞系。在每个融合细胞系中评定任何在亲本类淋巴母细胞二倍体细胞系为杂合型的SNPs的单倍性。假定“A”和“B”是在每个SNP位点可以选择的变异体，通过比较作为“AB”杂合型在亲本二倍体细胞系中出现的标记与作为“A”或“B”(半杂合)出现在杂交体中的相同标记，可以确定每个杂交系中单倍体状态的人类DNA链。
图11显示检测两个人类/仓鼠细胞杂交体(杂交体1和杂交体2)中位于第21号人类染色体上的选择标记的结果。第1栏列出了HuSNP芯片标记名称，第2栏表明了当仓鼠细胞核酸(非融合)和HuSNP芯片杂交后是否获得了一种信号。如预测的一样，在仓鼠细胞样本中没有检测到任何标记的信号。第3栏表明了在二倍体亲本人类类淋巴母细胞系CPD17中检测到每种标记的变异体(“A”、“B”或“AB”)。在某些情况下，只有一种A变异体存在；在某些情况下，只有一种B变异体存在；在某些情况下，CPD17细胞是杂合型(“AB”)变异体。最后两栏表明了来源于两种人类/仓鼠杂交体(杂交体1和杂交体2)的核酸样本与HuSNP芯片杂交的结果。注意当只有A变异体出现在亲本CPD17细胞系中时，只有A变异体在细胞融合中转移；当只有B变异体出现在亲本CPD17细胞系中时，只有B变异体在细胞融合中转移；当CPD17细胞系为杂合型时，A变异体转移进一些融合克隆，而B变异体转移进其他融合克隆。但必须要了解的是，通常只有部分染色体存在于融合过程产生的杂交细胞系中，一些杂交体可以是某些人类染色体或其部分的二倍体，一些杂交体可以是另一些人类染色体或其部分的单倍体，一些杂交体可以不含有某些染色体的任一种变异体。可以选择只含有特定人类染色体(如21号染色体)的一种变异体的杂交体用于分析。更优选的，将含有全部染色体(相对于只有其中部分而言)的杂交体选来分析。实施例3长距离PCR
来源于仓鼠/人类细胞杂交体的DNA可以用于进行长距离PCR分析，这种分析一般可以从文献中获知，例如，Boehriger Mannheim扩展长距离PCR试剂盒所述的标准长距离PCR方法，此处引入作为参考或用于所有目的。
通过以下途径设计用于扩增反应的引物将一个给定序列，例如将21号染色体的23兆碱基的重叠群序列输入一个现有技术中已知的所谓“重复掩饰(repeat masker)”的软件程序，该掩饰可以识别基因组上的重复序列(如Alu和Line元件)(见A.F.A.Smit和P.Green，www genome washington edu/uwgc/analvsistools/repeatmask，作为本发明的参考)。重复序列通过用“N”替换重复序列中的每个特定核苷酸(A、T、G或C)的程序被“掩饰”。接着将重复掩饰替代后产生的输出序列输入一个商业上可获得的引物设计程序(Oligo 6.23)，利用该程序选择长度大于30个核苷酸、解链温度大于65℃的引物。将Oligo 6.23设计的输出引物输入到一个程序，接着该程序“选择”出能PCR扩增基因组上的给定区域但与临近PCR产物重叠最小的引物对。商业上可获得的方法和这种引物设计进行长距离PCR的成功率至少为80％，在人类染色体的某些部分上可以获得95％以上的成功率。
长距离PCR的解释性实施方案使用Boehringer Mannheim Cat# 1681834、1681842或1759060扩展长模板PCR系统。在过程中，每个50μL PCR反应中需要两种主混合物。在特定的实施例中，在置于冰上的1.5ml的微量离心管中制备每个反应所需的主混合物1，其中含有终体积为19μL的分子生物学级水(Bio Whittaker Cat.# 16-001Y)；2.5μL 10mM dNTP，含有的dATP、dCTP、dGTP和dTTP均为10mM(Life Technologies Cat.#10297-018)，每种dNTP的终浓度达到400μM和50ng DNA模板。
制备用于所有反应的主混合物2，冰上保存。每个PCR反应的主混合物2包含一个终体积为25μL的分子生物学级水(Bio Whittaker)；5μL 10×PCR缓冲液，其中含有22.50mM Mgcl2(Sigma，Cat.#M 10289)；2.5μL 10mM Mgcl2(为了使Mgcl2的终浓度为2.75mM)和0.75μL酶混合物(最后添加)。
将6微升预混合引物(含有2.5μL的主混合物1)加入合适的试管中，然后在每管加入25μL主混合物2，盖上管混合，轻缓离心，重置冰上。这时，开始按照以下程序进行PCR循环步骤194℃变性模板3分钟；步骤294℃30秒；步骤3在引物适宜的退火温度退火30秒；步骤468℃延伸1分钟/Kb产物；步骤5重复第2-4步38次共39个循环；步骤694℃30秒；步骤7退火30秒；步骤868℃延伸1分钟/Kb产物加上额外的5分钟；和步骤9保持于4℃。也可以选择使用两步PCR步骤194℃变性模板3分钟；步骤294℃ 30秒；步骤368℃退火和延伸1分钟/Kb产物；步骤4重复第2-3步38次共39个循环；步骤594℃ 30秒；步骤668℃退火和延伸1分钟/Kb产物加上额外的5分钟；步骤7保存于4℃。
人类第14和22号染色体上不同区域的长距离PCR扩增反应的结果可以通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳(图12)显示。利用本发明长距离PCR扩增方法常规产生的扩增片段的平均大小约为8Kb，只有在很少的情况下(见第22号染色体胶G11)中没有扩增出基因组区域。实施例4晶片设计、制造、杂交和扫描寡核苷酸探针系列保存在一个寡核苷酸阵列(芯片或晶片)上，它是根据需要查询的人类DNA链序列设计的。寡核苷酸序列来源于公众可以利用的数据库报道的共同序列。一旦确定了探针序列，计算机运算法则就可以用于设计在加工含探针的阵列中应用的光刻掩模。通过一种光指示的化学合成过程来制造阵列，该过程结合了固相化学合成与光刻制作技术。见，例如，WO92/10092，或美国专利5,143,854、5,384,261、5,405,783、5,412,087、5,424,186、5,445,934、5,744,305、5,800,992、6,040,138、6,040,193，在此引入其完整内容作为参考。利用一系列的光刻掩模来确定特定化学合成步骤后在玻璃底物(晶片)上的曝光位点，通过这个过程构建阵列上核苷酸探针的高密度区域，同时每个探针位于预定的位置。同时和平行合成多个探针区域。
合成过程包括通过将光透过一个光刻掩模，其中在未保护区域的化学基团被光激活，选择性照亮一个影像——保护的玻璃底层。接着选择性激活的底物晶片和一个选择的核苷酸一起孵育，在晶片激活区域发生化学偶联。一旦发生偶联，应用一个新的掩模模式与另一种选择的核苷酸重复偶联步骤，直到获得期望的探针系列。在一个特定的实施例中，应用25-mer的寡核苷酸探针，其中第13个碱基是待确定的碱基。用四个探针来查询存在于每个序列中的每个核苷酸——除了第13个碱基，一个探针与该序列互补，三个错配探针等同于互补探针。在某些情况下，每个阵列上至少有10×106个探针。
一旦阵列构成后，就与通过在仓鼠—人类细胞杂交体上进行长距离PCR反应产生的产物进行杂交。标记待分析的样品并将它与阵列一起孵育，直到样品与晶片上的探针杂交。
将杂交后的阵列插入一个共焦高性能的扫描仪，这样可以检测杂交的模式。当样品中PCR产物与探针结合，已掺入到PCR产物中的荧光报道基团发射荧光时，收集杂交数据。与那些含有错配的序列相比，样品中与晶片上探针互补的序列与晶片杂交的程度更强并能产生更强的信号。由于阵列中每个探针的序列和位置是已知的，通过互补性，可以鉴定出应用于探针阵列的样品核酸的变异。用于本发明的扫描仪和扫描技术是本领域技术人员已知的，并公开在如描述了微阵列芯片的美国专利US5,981,956，US6,268,388和US5,459,325 U.S.S.N。另外2000年8月3日提交的60/223,278，及要求2001年8月3日提交的USSN60/22,3278的优先权的非临时专利申请描述了扫描仪和全晶片扫描的技术，在此引入其完整内容作为参考。实施例5鉴定人类21号染色体的SNP单倍型代表了非洲人、亚洲人和高加索人21号染色体的20个独立的染色体拷贝被用于分析SNP发现和单倍型结构。采用啮齿动物—人类体细胞杂交技术将每个个体21号染色体的两个拷贝物理分离(图10)，讨论如前。用于分析的参考序列由人类21号染色体基因组DNA序列组成，此序列由32,397,439个碱基组成。掩饰这种参考序列的重复序列，用高密度寡核苷酸阵列分析产生的21,676,868个碱基的(67％)的独特序列中的变异。将八个独特的寡核苷酸，每个长为25个碱基，用于查询独特样品中每一条21号染色体的碱基，共约1.7×108条不同的寡核苷酸。这些寡核苷酸分布于用前述策略(Chee，etal.，science，274610，1996)设计的共八个不同的晶片上。光指示性寡核苷酸的化学合成是在5英寸×5英寸的玻璃晶片(购自Affymetrix，Inc，SantaClara，CA)上进行的。
设计的独特寡核苷酸用于产生3253个最低程度重叠的长距离PCR(LRPCR)产物，平均长度为10kb左右，跨越了邻近21号染色体DNA的32.4Mb，制备如前所述。将相应的LRPCR产物混合，并用Qiagen tip 500(Qiagen)纯化后用于与每个晶片杂交。用37μl 10X One-Phor-All缓冲液PLUS(promega)和1单位DNA酶(生命技术/Invitrogen)将共280μg纯化的DNA分离成片段，反应总体积为370□L，置于37℃反应10分钟，99℃热灭活10分钟。成片段的产物用500单位的Tdt(Boehringer Manheim)和20nmol的生物素-N6-ddATP(Dupont NEN)进行末端标记，置于37℃反应90分钟，95℃热灭活10分钟。标记的样品与晶片杂交，该过程是在以下溶液中进行的10mM Tris-HCL(PH8)3M氯化四甲铵，0.01％ Tx-100，10μg/ml变性的鲱精子DNA，总体积为每个晶片10ml，在50℃反应14-16个小时。在4×SSPE中粗略漂洗晶片，用6×SSPE洗涤三次，每次十分钟，用链酶亲和素R-藻红蛋白(SAPE，5ng/ml)室温染色10分钟。通过用抗链酶亲和素的抗体(1.25ng/ml)染色和重复SAPE染色步骤增强信号。
相应于一个单晶片上碱基的PCR产物被混合并作为一个单独反应与晶片杂交。为了寻找DNA序列变异，在160个晶片上合成共3.4×109个寡核苷酸用于扫描20个独立的人类21号染色体的拷贝。采用长距离PCR，由一个啮齿动物—人类杂交细胞系扩增得到每个独特的21号染色体。利用具有高适度严格参数的Oligo6.23引物设计软件设计LRPCR实验。所得引物长度典型为30个核苷酸，解链温度＞65℃。扩增子长度范围在3kb-14kb之间。建立一个全染色体的引物数据库，用软件(pPicker)选择一套最小的非冗余的引物，这种引物能最大程度地涵盖21号染色体序列，并且在相邻扩增子之间重叠最小。作为选择，本发明也可以使用实施例3描述的选择引物的方法。使用较少改进的延伸长模板PCR试剂盒(Boehringer Mannheim)进行LRPCR反应。用常用共焦扫描仪扫描晶片。
用一个模式识别运算法则检测变化杂交时的SNPs。将先前描述的运算法则(Wang，et al.，Science，2801077(1998))经过组合后用于检测基于变化杂交模式的SNPs。在20个染色体样本中鉴定出共35,989种SNPs。这些人类多态的序列和位点已经保存在GenBank的SNP数据库。双脱氧序列用于评定一个随机样本中的227种SNPs，这些SNPs存在于最初的DNA样本中，从而证实了分析的220(97％)种SNPs。为了获得3％的低假阳性SNPs，晶片上SNPs的检测需要严格的阈值，这样会产生高的假阴性率。晶片上约65％的碱基产生了高质量足够用于SNPs检测的数据，剔除了35％的呈假阴性的数据。分析样本中由于长距离PCR的失败导致35％假阴性率中的15％。剩下20％的假阴性分布于不产生高质量数据的碱基(10％)和只在分析的20条染色体的一个片段上产生高质量数据的碱基(10％)之间。一般来说，碱基所处的序列的内容决定了它是否产生高质量的数据。发现约有20％的碱基一贯提供差的数据，这与发现的在单个双脱氧测序时阅读500个碱基时质量评分太低不能用于可靠的SNPs检测(Altschuler，et al.，Nature，407513，(2000))非常相似。在只有有限数量的被分析的样本产生了对于一个给定碱基的高质量数据的情况下，相对于较常见的SNPs，发现罕见SNPs的能力发生不成比例地降低。结果，用这种方法进行的SNP发现偏向于常见SNPs。
图13A表明了在总体多样染色体样本发现的所有35,989种SNPs中次要等位基因频率的分布。用两种核苷酸多样性方法估计针对样本中染色体数目标准化的遗传变异每位点平均杂合性π和群体突变参数θ(见Hartl和Clark，Principles of Population Genetics，(Sinauer，Massachusetts，1977))。完成的基因组21号染色体DNA的32,397,439个碱基被分成200,000碱基对的片段，检测每个片段中用于SNP发现的高质量碱基对。观察到的这些碱基的杂合性用于计算每个片段的平均核苷酸多样性(π)。总数据组(π＝0.000723和θ＝0.000798)估计出来的平均核苷多样性与在21号染色体的200,000个邻接碱基对中测定的核苷多样性(图13B)分布均处于先前描述值的范围内(国际SNP图谱工作组，Nature 409928-33(2001))。
将SNP联盟(TSC)发现的15,549种21号染色体上SNPs的重叠程度与本发明发现的SNP进行比较。由于TSC发现的SNP中有5,087种位于重复DNA中，故没有将它们排在晶片上，在剩余的10,462种TSC SNPs中，鉴定了4705种(45％)。观察发现θ的估计值要大于所分析的邻近DNA序列的162200kb框中的129kb得出的π估计值。这种差异与最近的人口数量增长相一致，并与最近关于人类基因核苷酸多样性的研究相似(Stephens，et al.，Science293489(2001))。研究发现，与已知观察到的核苷酸多态性数量的中性模型期望的43％单一相比，SNPs中的11,603(32％)种具有次要等位基因，在样本中只观察到一次(单一)。(Fu和Li，Genetics 133693(1993))。观察值与期望值之间的差异可能是由于与上述讨论的与常见SNPs相比，本研究鉴别罕见SNPs的能力较低。
综上所述，对估计位于人类基因组上32.4Mb的53000种常见SNPs中的47％进行了鉴定，这些SNP的等位基因频率大于等于10％。将其与约18-20％的国际SNP图谱工作组和SNP联盟收集的所有这样的常见SNPs进行比较。涵盖差异可以通过本研究使用了较大数量染色体用于发现SNP来解释。为了评定发现的可重复性，进行SNP发现以便设计一个晶片，该晶片具有21号染色体的19个额外的拷贝，来源于和原始系列样本相同的多样性实验对象。利用两套样本鉴别了共7188种SNPs，其中平均66％在第一套样本中发现的SNPs也存在于第二套中，与先前的发现相一致(Marth，et al.，NatureGenet，2737(2001)和Yang，et al.，Nature Genet，2613(2000))。如预期的一样，一种SNP在第二套样本中没有复制大大依赖于等位基因的频率。那些次要等位基因在一套样本中只出现2到3次的SNPs中的80％也出现在第二套样本中，而次要等位基因出现一次的SNPs的32％出现在第二套样本中。这些结果表示，次要等位基因出现不止一次的集合中的24,047种SNPs在不同的总体样本中可高度重复，因而这些SNPs能用来定义常见总体单倍型。在SNP发现的过程中，鉴定了看来具有两个以上的等位基因的339种SNPs，但这些SNPs不包括在本分析中。
除了SNPs在不同样本中可以重复，SNPs集合中的连续SNPs之间的距离对于定义有意义单倍型结构是关键的。如果集合中连续的SNPs之间的距离很大程度上依赖于实际单倍型区块的大小，则可能不识别短至几kb的单倍型区块。即使重复序列不包括在SNP发现过程中，本研究中的SNPs集合也均匀地分布在染色体上。图13C表明了SNPs的分布覆盖了已完成的21号染色体DNA序列的32,397,439个碱基。一个间隔就是连续SNPs之间的距离。整个SNP组之间共有35,988个间隔，常见SNP组之间共有24,046个间隔(即次要等位基因在样本中出现多于一次的SNPs)。考虑所有的SNPs时，连续SNPs之间的平均距离为900个碱基，当只考虑24,047个常见SNPs时，连续SNPs之间的平均距离为1300个碱基。对于这组常见的SNPs来说，93％位于包括重复DNA序列的基因组DNA的连续SNPs之间的间隔小于等于4000个碱基(同样，见图13C)。
从二倍体数据构建单倍型区块或模式是复杂的，因为任两个杂合SNPs等位基因之间的联系不能直接观察到。考虑带有两拷贝的21号染色体和两个等位基因，A和G，位于一条21号染色体SNP，同时两个等位基因，A和G，位于第二条21号染色体SNP。在这样一个例子中，不清楚是21号染色体的一个拷贝在第一个SNP含有等位基因A以及，在第二个SNP含有等位基因A，而21号染色体的另一个拷贝在第一个SNP含有等位基因G，在第二个SNP含有等位基因G，还是21号染色体在第一个SNP含有等位基因A，在第二个SNP含有等位基因G，而21号染色体的另一个拷贝在第一个SNP含有等位基因G，在第二个SNP含有等位基因A。目前的方法用于解决这个问题，包括统计估计单倍型频率，直接由家系数据得出推论，和对短片段进行等位基因特异性PCR扩增。
为了避免复杂性，本发明鉴定了从啮齿动物—人类体细胞杂交体分离的21号染色体的单倍体拷贝上有代表性的SNPs，允许直接确定这些染色体的全部单倍型。这组带有在数据组中不只出现一次的一个次要等位基因的24,047个SNPs用于定义单倍型结构，如图14所示。表示了由147个常见人类21号染色体的SNPs定义的20种独立总体多样性染色体的单倍型模式。147个SNPs覆盖106kb的基因组DNA序列。每一行有色框代表了一个SNP，其中黑框代表SNP的主要等位基因，白框代表SNP的次要等位基因。任何位置没有框则代表数据丢失。每一列有色框代表了一条染色体，SNPs按照它们的物理顺序排列在染色体上。在连续SNPs之间的没有变异的碱基没有在图中表示出来。147个SNPs分成18个区块，由黑色水平线确定。确定一个区块开始和邻接区块结尾的21号染色体基因组序列中的碱基位置由垂直黑线左边的数字标示。图右面放大的框代表一个SNP块，由跨越基因组DNA上19kb的26个常见SNPs定义。在样本中表示的7个不同的单倍型模式中，四个最常见的模式包含了采样的20条染色体中的16条(即80％的样本)。黑圈和白圈表明两种信息型SNPs等位基因的模式，可以明确区分这个区块中的四种常见单倍型。虽然没有两条染色体具有与这147个SNPs相同的单倍型模式，但在多条染色体的许多区域却有着一个相同的常见模式。通过扩展跨越19kb的26个SNPs定义的区域，可以进行更细致的分析(见图14放大的区域)。这个区块确定了20条染色体中的七种唯一的单倍型模式。除了由于不能通过数据质量阈值而丢失了一些数据以外，所有的情况下给定的DNA可以明确定位到这七种中的一种单倍型。四种最常见单倍型，每一种由三到四条染色体代表，占样本所有染色体的80％。只需要26个中的两个“信息型”SNPs来区别四种最常见的单倍型。在这个实施例中，仅使用这两个信息型SNPs中的信息将具有不常见单倍型的四条染色体分类为常见单倍型，这种分类是不准确的。然而，很明显80％的整个总体样本中的单倍型结构是用区块中所有SNPs中的10％定义的。几种可能性存在于可以被选择的三个信息型SNPs中，这样四种常见单倍型中的每一种可以由一个SNP来唯一确定。在混合样本分型的试验中，这些“三SNP”选择中的一种将优于两SNP的组合，因为两SNP的组合将会限制在这种情形下四种常见单倍型频率的确定；因此，本发明提供了一种SNP作图的动态改进方法，该方法优于随机选择方法。
总而言之，尽管特定应用可以指导能获得单倍型信息的信息型SNPs的选择时，样本中大部分单倍型信息包含在所有SNPs的非常少的亚组中是显而易见的。另外从这个SNPs区块中随机选择的两到三个信息型SNPs将不能经常提供足够的信息来唯一分配一条染色体到四种常见单倍型中的一种。
当将定义单倍型结构时需要SNPs总数降至最少时，如何确定跨越21号染色体的32.4Mb的一组连续的SNPs区块是一个问题。在一个实施方案中，一个基于“greedy”策略的优化算法可以来解决该问题。考虑大小为一个SNP或更大的物理上连续的SNPs区块，将模糊单倍型模式视为缺失数据，并在计算涵盖百分率时不把它们包括在内。同时考虑到余下那些重叠的区块，选择在最少数量SNPs区块中总SNPs与唯一区别区块中不只一次出现的单倍型所需要的最小SNPs数目的比率最大的区块。任何与选择区块发生物理性重叠的剩余区块被放弃，重复这个过程直到选择了一组连接的，无重叠的覆盖21号染色体的32.4Mb序列而无缺口的区块，同时将每一个SNP分配到区块上。给定20条染色体样本大小，此算法产生每个区块10个常见模式的最大值，每种模式由两条独立染色体代表。
将这种算法应用于24,047个常见SNPs的数据组，确定了跨越21号染色体的4135个区块。其中有14％的区块每一个含有10个以上SNPs，共589个区块，包括总长32.4Mb的44％。与之形成对照的是有52％的区块每一个含有3个以下SNPs，共2138个区块，只构成了染色体物理长度的20％。最大的区块含有114个常见SNPs，跨越基因组DNA的115kb。总的来说，区块的平均物理长度为7.8kb。区块的大小与它在染色体上的顺序没有关系，大区块与小区块散布在染色体上。每个区块平均有2.7个常见单倍型模式，定义为在多染色体上观察到的单倍型模式。平均说来，样本中20条染色体中的9.6条代表了区块中最常见的单倍型模式，第二常见单倍型模式由4.2条染色体代表，如果存在第三常见单倍型模式，则由2.1条染色体代表。总体多样性染色体的这样一个大片段由如此有限的单倍型多样性来代表的事实是值得注意的。当考虑单倍型模式的频率时，发现与观察相一致，在313个人类基因的集合中观察到的82％的单倍型模式出现在所有种族中，只有8％的单倍型是群体特异性的(Stephens，et al.，Science 293489-93(2001))。通过几个试验测定单倍型算法中参数对产生的区块模式的影响。需要被常见单倍型覆盖的染色体比例可以改变，从起初的80％到70％和90％。如所预期的，需要更完整的覆盖产生更大数量的短的区块。只用样本中次要等位基因频率至少为20％的16,503个SNPs产生了一些更长的区块，但每个区块SNPs的数目并没有显著改变。在约3Mb的一个区域，分析了一个含有38条染色体的更稠的样本中的SNPs和频率至少为10％的常见单倍型区块，使其与20条染色体的分析可比。产生的区块大小的分布接近于原始结果。而且，进行一项随机选择试验，改变每个SNP中已知等位基因顺序，然后用于单倍型区块发现。在这一项研究中，94％的区块含有3个以下的SNPs，只有一个区块含有5个以上的SNPs。这证实了由数据中看到的较大区块不是偶然联系产生的，或是本发明区块选择方法人为制造的结果。
为了确定基因是否按比例地表现于大区块和小区块中，用含有10个以上SNPs、3-10个SNPs，3个以下SNPs的区块中外显子碱基的数目来确定。外显子碱基比含有3-10个SNPs区块中的总碱基有些过表现(变换试验确定的P＜0.05)。
基于区块中单倍型结构的知识，可以选择24,047个常见SNPs的亚组来获得任何需要的常见单倍型信息的片段，常见单倍型信息定义出现超过一次，包括跨越了整个32.4Mb的样本的80％以上的单倍型的信息。图15表明获得32.4Mb长的21号染色体上常见单倍型信息所需的SNPs的数量。对于每一个SNP区块，明确区分该区块中出现不只一次的区块所需的SNPs的最小数量(即常见单倍型信息)被确定下来。这些SNPs提供了由区块限定的全长物理距离的比例的常见单倍型信息。从为最大物理距离提供常见单倍型信息的SNPs开始，在物理覆盖(即覆盖比例)的累积增长被作图为与添加的SNPs的数量(即需要的SNPs)相关。基因DNA包括开始于每个已知21号染色体基因的第一个外显子的5’端10kb，延伸到该基因最后一个外显子的3’端10kb的所有基因组DNA。例如，尽管获得所有常见单倍型信息需要最少的SNPs为4563个，获得含有三个或更多SNPs、覆盖32.4Mb中81％的区块中的常见单倍型信息只需要2793个SNPs。获得基因DNA中所有常见的单倍型信息共需要1794个SNPs，代表了约二百二十个不同的基因。
本发明特别涉及全基因组关联研究，对表型如普通疾病的基因作图。这种方法是基于一种假设，即对常见疾病的易感性是由常见的遗传变异引起的(Risch and Merikangas，Science 2731516(1996)，Lander，Science 274536(1996))。通过比较在不相关的病例和对照中的遗传变异频率，遗传关联研究可以识别在人类基因组中对引起疾病起重要作用的特定的单倍型。虽然这种方法已经成功地应用于与疾病相关的单个候选基因(Altschuler，et al.NatureGenet.2676(2000))，近来人类DNA序列的确定提供了研究整个基因组的可能性，这使基因关联分析(Kruglyak，Nature Genet.22139(1999))的能力极大提高。实现这种方法的主要限制是缺乏人类基因组单倍型结构方面的知识，而这方面的知识对于选择合适的遗传变异进行分析是必不可少的。本发明证明结合高密度寡核苷酸阵列与体细胞遗传样本制备可以提供一种高效解决办法，依据经验确定人类基因组的单倍型结构。
尽管具有一种简单单倍型结构的基因组区域的长度差异极大，但一组密集的常见SNPs还是可以帮助人们用系统的方法确定人类基因组区块，其中80％的总体人群仅由三种常见单倍型来描述。总而言之，当在这个实施方案中运用特定的算法时，任何区块中最常见的一种单倍型可以在50％的个人中找到，第二常见的单倍型可以在25％的人群中找到，而第三常见的单倍型可以在12.5％的人群中找到。要注意的是，区块是基于它们的遗传信息内容来确定的，而非根据这种信息是如何产生或为何存在。正是如此，区块没有绝对的界限，可以通过不同的方式进行定义，这主要依据其特定的用途。这个实施方案中的算法仅仅提供了多种可行方法中的一种。结果表明，需要一组高密度的SNPs来捕获所有常见单倍型信息。另一方面，这种信息也可以用于识别更小亚组的SNPs，从而有助于复杂的全基因组关联研究。
本领域的专业人员很容易想到将人类21号染色体上应用的这种技术运用到人类基因组中其他所有的染色体。在本发明的优选实施方案中，各代表性的许多人群的多个全基因组被用于识别所有或大多数人常见的SNP单倍型区块。在一些实施方案中，SNP单倍型区块是基于排除了出现频率低的SNPs后的亲本SNPs。当亲本SNPs被保存在基因组中时，它很可能非常重要，因为亲本SNPs能传达给携带它的生物体一些选择优势。实施例6使用关联基因进行基因治疗和药物发现本预见性的实施例概括了一个使用本发明方法的例子。SNP是在20个单倍体基因组中被发现的，采用本发明的方法分析了50个单倍体基因组，确定SNP单倍型区块、SNP单倍型模式、信息型SNPs以及每个信息型SNP携带的次要等位基因频率。这50个单倍体基因组包含了本研究的对照基因组(见图13的步骤1300)。
随后使用长距离PCR和如前所述的微阵列(见授权于Lipshutz等的美国专利US6,300,063，和Chen等的美国专利US5,837,832)，可以分析来自于500个具有肥胖表型的个体的基因组DNA，同时确定这个临床群体中每个信息型SNP的次要等位基因的频率(见图13步骤1310)。比较两个群体中信息型SNP位点的次要等位基因频率，结果表明对照和临床群体在三个信息型SNP位点具有统计学上的显著差异(步骤1320和1330)，选择对照群体和临床群体在次要等位基因频率上具有最大差异的SNP位点用于分析。
选择的信息型位点存在于一个SNP单倍型区块中，此区块跨越编码区5′端的1kb非编码序列和瘦素基因编码区的4kb(步骤1340)。分析这个区域里发生的变异表明这个区域里在一个SNP位点的一个G是负责破坏瘦素基因的启动子，使瘦素蛋白的表达相当缺乏。
成纤维细胞可以通过皮肤活组织切片检查获得。产生的组织置于组织培养基中，并分成小片。将小片组织放在装有培养基的组织培养瓶底部的潮湿表面，室温下24小时后，加入新鲜的培养基(如含有10％FBS、青霉素、链霉素的Ham’s F12培养基)。接着将组织在37℃孵育约一个星期。在这段时间里，每隔几天更换一次培养基，同时加入新鲜的培养基。在培养额外的两个星期后，单层纤维原细胞形成，这些单层细胞被吸移进一个较大的培养瓶中。
将含有一个耐卡那霉素基因的来源于莫洛尼鼠白血病病毒的载体用限制性酶消化，从而克隆一个待表达的片段。消化的载体用牛肠磷酸酶处理，制止自连接。去磷酸化的线性载体在一块琼脂糖胶上进行分馏和纯化。分离能够表达活性瘦素蛋白产物的瘦素cDNA。如果需要对片段的末端进行修饰，将它克隆进载体。将相同摩尔量的莫洛尼鼠白血病病毒线性主链和瘦素基因片段一起混合，用T4 DNA连接酶连接。连接产物用于转化E.coli细菌，接着将细菌平铺在含有卡那霉素的琼脂上，卡那霉素表型和限制性分析证实了载体中适当插入了瘦素基因。
包装细胞在组织培养物中生长，达到在含有10％牛血清、青霉素、链霉素的Dulbecco’s Modified Eagles培养基(DMEM)中的融合密度。用标准技术将携带有瘦素基因的载体导入包装细胞，给细胞添加新鲜的培养基，在孵育一段时间后，从融合包装细胞平板中回收培养基，将含有感染性病毒颗粒的培养基滤过一个微孔过滤器，移走分离的包装细胞用于感染成纤维细胞。将培养物从一个亚融合成纤维原细胞平板转移，迅速以过滤后的培养基取代。Polybrene(Aldrich)可以包含在培养基中加强转导。在合适的孵育后，去除培养基，并用新鲜的培养基代替。如果病毒的滴度高，那么基本所有的成纤维细胞将被转染，并不需要选择。如果滴度低，则有必要使用一个逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体带有一个选择性标记，如neo或his，通过该标记可以选出转导的细胞用于细胞的扩展。
单独将加工的成纤维细胞导入个体，或在微载体珠如Cytodex 3珠上生长至融合后再导入。注射入的成纤维细胞产生瘦素产物，蛋白的生物活性被传输进宿主。
可以选择或额外将分离的瘦素基因克隆进一个表达载体，用它来产生瘦素多肽。表达载体含有合适的转录和翻译起始区域，以及转录和起始终止区域，如前公开。可以用这种方式产生分离的瘦素蛋白并将该蛋白用于识别与其结合的试剂；或者用表达这种加工的瘦素基因和蛋白的细胞在化验中鉴别试剂。试剂的鉴别可以通过例如，将一个候选试剂和一个分离的瘦素多肽接触一段足够长的时间，从而能形成一个多肽/化合物复合物，对复合物进行检测。如果检测到了一个多肽/化合物复合物，则结合在瘦素多肽上的化合物就能鉴别出来。通过这种方法鉴别的因子包括调节瘦素活性的化合物。用这种方式筛选出的试剂包括肽、碳水化合物、维生素衍生物，和其他小分子或药用制剂。除了通过生物化验来鉴别试剂外，还可以通过利用基于瘦素蛋白结构的蛋白模拟技术选择的候选试剂对试剂进行预筛选。
除了鉴别与瘦素蛋白结合的试剂外，对能通过结合瘦素基因来控制基因表达的序列特异性或元件特异性的试剂也进行了鉴别。一类核酸结合结合试剂含有能与瘦素mRNA杂交、从而抑制翻译的碱基残基(如反义寡核苷酸)。另一类核酸结合试剂是那些能与DNA形成三螺旋结构来阻断翻译的试剂(三螺旋寡核苷酸)。这种因子通常含有20-40个碱基，是基于磷酸二酯、核糖核酸骨架、或可能是具有碱基附着能力的各种巯基或聚合衍生物。
另外，能与瘦素基因特异性杂交的等位基因特异性寡核苷酸、和/或能与变异瘦素蛋白特异性结合的试剂(如一种变异体特异性的抗体)可以用作诊断剂。制备和使用等位基因特异性寡核苷酸的方法，以及制备抗体的方法如前所述，是现有技术已知的。
在本说明书中提及的所有专利和公开文献提示了本领域技术人员本发明涉及的水平。所有的专利和公开文献均在此引入作为参考，与每一篇公开文献中特别和单独引入作为参考的程度相同。
本发明通过鉴别个体变异、确定SNP单倍型区块、确定单倍型模式、和进一步使用单倍型模式鉴别信息型SNPs，从而提供了进行基因组范围关联研究的很大程度改进的方法。信息型SNPs可以用于以先前未知的实用的和经济有效的方式进一步分析疾病和药物反应的遗传基础。以上的描述是为了更好地理解发明，而不是对发明作的限制。本领域技术人员看了以上的描述，可以清楚地理解许多实施方案。因此，本发明保护的范围不应由以上描述的内容得出，而应该参考所附权利要求书，以及这些权利要求声明请求保护的等同物的全部范围。
序列表<110>珀尔根科学公司<120>基因组分析方法<130>054801-5001<150>US 60/280,530<151>2001-03-30<150>US 60/313,264<151>2001-08-17<150>US 60/327,006<151>2001-10-05<150>US 60/332,550<151>2001-11-26<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>样本SNP单倍型W<400>1agattcgata acg13<210>2<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>样本SNP单倍型X<400>agactacata acg 13<210>3<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>样本SNP单倍型Y<400>3tatttcgata acg 13<210>4<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>样本SNP单倍型Z<400>4tatctacaat cac 13<210>5<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>SNP序列<400>5agtaacccct ttt 13<210>6<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>SNP序列<400>6actgacccct ttt13<210>7<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>SNP序列<400>7agtgactctt taa1权利要求
1.一种选择SNP单倍型模式的方法，包括从大量不同来源中分离出基本等同的核酸链用于分析；确定每条核酸链中一个以上的SNP位点；鉴别在所述核酸链上连锁的SNP位点，其中所述连锁的SNP位点形成一个SNP单倍型区块；鉴别分离的SNP单倍型区块；鉴别存在于每个SNP单倍型区块和分离的SNP单倍型区块中的SNP单倍型模式；和选择存在于至少两条所述不同来源的基本等同的核酸链中的每一种鉴定出的SNP单倍型模式。
2.权利要求1的方法，其中通过greedy算法或最短-路径算法来确定所述的第一个鉴别步骤。
3.权利要求1的方法，其中所述SNP单倍型区块是非重叠的。
4.权利要求1的方法，其中所述基本上等同的核酸链至少从约10到约100个不同的来源获得。
5.权利要求4的方法，其中所述基本上等同的核酸链至少从约16个不同来源获得。
6.权利要求5的方法，其中所述基本上等同的核酸链至少从约25个不同来源获得。
7.权利要求6的方法，其中所述基本上等同的核酸链至少从约50个不同来源获得。
8.权利要求1的方法，其中所述基本上等同的核酸链是基因组DNA链。
9.权利要求1的方法，其中分离并分析至少10％的来源于一个生物体的基因组DNA。
10.权利要求1的方法，其中分离并分析所述基本等同的核酸链中的至少1×108个碱基。
11.权利要求1的方法，其中对从基本等同的核酸链上选择出的重复区域不进行分析。
12.权利要求1的方法，进一步包括在所述确定步骤后，鉴别所述大量等同的核酸链中只出现一次的SNP位点；和分析时排除所述出现一次的SNP位点。
13.权利要求1的方法，进一步包括选择一种在所述基本等同的核酸链中出现频率最高的SNP单倍型模式；和选择一种在所述基本等同的核酸链中出现频率次高的SNP单倍型模式；和重复所述第二个选择步骤直到所述选择的SNP单倍型模式鉴别了一部分所述的基本等同的核酸链。
14.权利要求13的方法，其中所述的一部分是所述基本等同核酸链的约70％到99％。
15.权利要求14的方法，其中所述的一部分是所述基本等同核酸链的至少约80％。
16.权利要求13的方法，其中只选择了不超过三种SNP单倍型模式。
17.一种选择用于数据分析的SNP单倍型区块数据组的方法，包括比较SNP单倍型区块的信息量；选择高信息量的第一SNP单倍型区块；将所述第一SNP单倍型区块加入到所述数据组中；选择高信息量的第二SNP单倍型区块；将选择的所述第二SNP单倍型区块加入到所述数据组中；和重复所述选择和加入步骤直到覆盖了核酸链上感兴趣的一段区域。
18.权利要求17的方法，其中所选择的SNP单倍型区块是非重叠的。
19.权利要求17的方法，其中采用greedy算法进行所述的选择步骤。
20.一种用于确定SNP单倍型模式中的信息型SNP的方法，包括确定SNP单倍型区块中的SNP单倍型模式；将所述SNP单倍型区块中每一感兴趣的SNP单倍型模式与所述SNP单倍型区块中其他感兴趣的SNP单倍型模式进行比较；在感兴趣的第一SNP单倍型模式中选择至少一个SNP，该SNP可以把所述SNP单倍型区块中这种感兴趣的第一SNP单倍型模式与其他感兴趣的SNP单倍型模式区别开来，其中所选择的至少一个SNP是在所述SNP单倍型区块中所述的第一SNP单倍型模式中的信息型SNP。
21.权利要求20的方法，进一步包括重复所述选择步骤直到选择了足够数量的信息型SNPs来区分SNP单倍型区块中的一部分SNP单倍型模式。
22.权利要求21的方法，其中所选择的一部分SNP单倍型模式占所述SNP单倍型区块中SNP单倍型模式的大约70％到大约99％。
23.权利要求21的方法，其中所选择的一部分SNP单倍型模式允许感兴趣疾病的鉴别。
24.一种确定SNP单倍型区块的信息量的方法，包括确定在所述SNP单倍型区块中SNP位点的数目；确定区分所述SNP单倍型区块中感兴趣的SNP单倍型模式所需要的信息型SNP的数目；用所述SNP位点的数目除以所述信息型SNP的数目产生一个商，其中所述商就是所述SNP单倍型区块的信息量。
25.一种确定SNP单倍型区块的信息量的方法，包括确定在所述SNP单倍型区块中SNP位点的数目；确定区分所述SNP单倍型区块中每一个感兴趣的SNP单倍型模式所需要的信息型SNP的数目，其中区别感兴趣的SNP单倍型模式所需要的所述信息型SNP数目即所述SNP单倍型区块的信息量。
26.一种在预先不知道疾病相关遗传位点的序列或位置时，确定疾病相关遗传位点的方法，包括确定一个对照群体中至少16个个体的SNP单倍型模式；确定一个患病群体中个体的SNP单倍型模式；和将所述对照群体中所述SNP单倍型模式的频率与所述患病群体中所述SNP单倍型模式的频率进行比较，其中所述频率的差异指示了疾病相关遗传位点的位置。
27.权利要求26的方法，其中所述SNP单倍型模式在对照群体中的至少50个个体中确定。
28.权利要求26的方法，其中所述群体的所述SNP单倍型模式通过使用信息型SNPs来确定。
29.一种使用多种全基因组构建SNP单倍型区块图谱的方法将所述全基因组的至少大约10％中发现的SNPs分配到SNP单倍型区块中。
30.一种将SNP单倍型模式和一种感兴趣的表型性状进行关联的方法，包括用本发明的方法建立SNP单倍型模式的基线；汇集来源于一个具有感兴趣的常见表型性状的群体的全基因组DNA；和鉴别与所述感兴趣的表型性状相关联的所述SNP单倍型模式。
31.权利要求30的方法，其中信息型SNPs用于所述建立和鉴别步骤。
32.一种鉴别诊断标记的方法，包括鉴别权利要求20的信息型SNPs，其中所述的信息型SNPs是基于关联的诊断标记。
33.一种鉴别药物发现靶的方法，包括将SNP单倍型模式与一种疾病相关联；鉴别所述关联SNP单倍型模式上的一个染色体位点；确定所述染色体位点和所述疾病之间关联的性质；和选择与所述疾病相关联的一个染色体位点或染色体位点的一种表达产物；其中所选择的与所述疾病相关联的染色体位点或染色体位点的一种表达产物是药物发现靶。
34.权利要求33的方法，其中基于一系列标准而排列所述关联染色体位点作为药物发现靶的优先次序，所述位点包括处于高度保守区域的位点和基因间区域的位点。
35.权利要求33的方法，其中信息型SNPs用于所述的关联步骤。
36.一种确定个体SNP单倍型模式的方法，包括检验至少一个信息型SNP。
37.一种确定一个物种或一个物种的亚型的SNP单倍型模式的方法，包括鉴别在所述物种的多个生物体基因组中出现的SNPs；通过重复选择具有少量模糊位置的SNP单倍型模式，将所述SNPs分配到SNP单倍型区块中。
38.一种包含来源于多种生物体基因组的SNP单倍型区块的数据库，其中所述数据库鉴别至少一种信息型SNP并且其中所述数据库保存在一种计算机可读介质上。
39.一种存在于计算机可读介质上的数据库，含有鉴别为与一个或多个特定表型性状关联的SNP单倍型模式。
40.一种存在于计算机可读介质上数据库，含有鉴别为与一个或多个特定表型性状关联的信息型SNPs。
41.权利要求38、39或40的数据库，进一步包含关于选自环境因素、其他遗传因素、相关因素，包括但不限于生化标记、行为，和/或其他多态现象，包括但不限于低频率的SNPs，重复、插入和缺失的一个或多个因素的信息。
42.一种诊断疾病、疾病易感性或治疗反应的试剂盒，包括检测患者基因组DNA的样本中SNP单倍型模式或信息型SNPs存在与否，及检测存在于计算机可读介质上的所述SNP单倍型模式或信息型SNPs与一个或多个特定表型性状的关联的数据组的工具。
43.一种分离的核酸，包括至少一种信息型SNP，其中所述信息型SNP指示一种根据本发明方法确定的SNP单倍型模式，其中所述信息型SNP与表型性状相关。
44.一种方法，包括鉴定大量个体的遗传变异；鉴别个体的至少某些所述遗传变异，这些变异还同时伴有至少某些其他所述遗传变异；和使用某些但不是全部的所述变异，所述变异还同时伴有至少某些其他与一种表型状态相关的所述遗传变异。
45.一种方法，包括确定一种生物体的序列；扫描所述生物体的其他个体的所述序列的变异体；鉴别在第一个群体中与其他所述变异体同时出现的一些所述变异体；鉴别在第二个群体中与其他所述变异体同时出现的一些所述变异体；和使用某些但不是全部的与具有一种表型状态的群体相关的所述第一和第二个群体中的所述变异体。
46.一种选择用于基因组分析的SNP单倍型区块的方法，包括从至少约五种不同的来源分离一条基本上等同的DNA链用于分析；分析至少约五种不同来源的每条所述基本上等同的DNA链上至少约1×106个碱基；确定每条DNA链上一个以上的SNP位点；在所述DNA链中鉴别连锁的SNP位点，其中所述连锁的SNP位点形成一个SNP单倍型区块；鉴别存在于每一个SNP单倍型区块中的SNP单倍型模式；和选择存在于不同来源的任何所述基本等同的DNA链中的每个鉴别出的SNP单倍型模式。
47.一种在预先不知道药物基因组相关遗传位点的序列或位置的情况下，确定所述药物基因组相关遗传位点的方法，包括确定一个对照群体中至少16个个体的SNP单倍型模式；确定对给予一种物质以变化方式产生反应的个体的SNP单倍型模式；和将所述对照群体的SNP单倍型模式的频率，与所述对给予一种物质以变化方式产生反应的个体的所述SNP单倍型模式的频率进行比较，其中所述频率的差异指示药物基因组相关的遗传位点的位置。
48.权利要求47的方法，其中所述SNP单倍型模式在对照群体的至少50个个体中确定。
49.权利要求47的方法，其中使用信息型SNP来确定所述群体中的所述SNP单倍型模式。
全文摘要
本发明涉及鉴别人类基因组发生的变异的方法,及将这些变异与疾病和药物反应的遗传基础相关联的方法。具体地说,本发明涉及鉴别个体SNPs、确定SNP单倍型区块和模式,和进一步利用SNP单倍型区块和模式来分析疾病和药物反应的遗传基础。本发明的方法适用于全基因组的分析。
文档编号C12Q1/68GK1381591SQ0211928
公开日2002年11月27日 申请日期2002年3月29日 优先权日2001年3月30日
发明者N·帕蒂尔, D·R·科克斯, A·J·贝尔诺, D·A·海因兹 申请人:珀尔根科学公司