专利名称：一种促使冰核活性细菌高表达冰核活性蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用Xanthomonas ampelinaTS206菌种发酵生产冰核活性细菌技术，促进冰核活性细菌高表达冰核活性蛋白的技术方法，特别涉及使用这种技术培养冰核活性细菌可以获得具有高活性的高生物量的菌体细胞，为冰核活性细菌在工业生产上的应用打下坚实的基础。
通常情况下纯水被冷却至冰点(0℃)以下仍维持液体状态不结冰，体积非常微小的纯水溶液(≤10μl)甚至可冷却至-35℃以下仍不结冰，这就是所谓的过冷现象。，在过冷的纯水中，如果加入晶种或振动产生稳定的冰核后，依附在冰核上的冰晶便开始成长，最终形成巨大冰的晶体，于是水冻结成冰。七十年代人们发现在自然界中有少数几种属于Erwinia(欧文氏菌属)、Pseudommonas(假单胞菌属)及Xanthomonas(黄单胞菌属)的革兰氏阴性细菌，具有在较高温度(-2℃～-7℃)下，使水结冰的能力，这类细菌被称为冰核活性细菌。冰核活性细菌可产生一种特殊的蛋白质——冰核活性蛋白，该蛋白是由ina基因编码的，经低温和一些营养因子诱导表达的一种与细胞膜结合的糖蛋白复合物，它具有类似冰晶的立体结构，因此可以充当模板的作用，促使冰晶提早形成。
目前国内外对于发酵生产冰核活性蛋白作了大量的研究。研究结果表明，培养基中C源的种类对于冰核活性细菌的发酵生产有很大的影响。一般来讲，在培养基中添加蔗糖和甘油可以提高细菌的冰核活性。培养基中的N源和一些微量元素是冰核活性细菌生长所必需的，但当细菌对数生长期结束进入稳定生长期时，N、P、S、Fe的缺乏和N与P的联合缺乏均可以诱导细菌表达较高的冰核活性蛋白产物，尤其是低N和低P水平能最有效的诱导A型冰核(活性最强类型的冰核)的表达。另外在培养基中添加微量的元素也可以促进冰核活性细菌表达冰核活性蛋白，1994年，Watanabe报道在培养基中添加4-羟基-3-硝基苯乙酸可以促进冰核活性蛋白的表达，本实验室的高秀芝研究证明在培养基中添加丝裂霉素c可以促进细菌表达冰核活性蛋白。
冰核活性细菌的最适生长的温度一般为28℃左右，但是较高的培养温度会对细菌的冰核活性有较强的抑制作用。为了实现发酵获得100％表达A型冰核活性蛋白，人们采用变温技术发酵生产冰核活性蛋白，即用冰核活性细菌的最适生长温度培养冰核活性细菌至对数期，然后在较低的温度下培养冰核活性细菌以便诱导细菌大量的表达A型冰核活性蛋白。采用这种技术培养冰核活性细菌可以在不降低细菌发酵生物量的前提条件下生产高活性的冰核活性蛋白。
近十几年来，科学家们开始将冰核活性细菌应用在低温冷冻食品上。1992年希腊的Conslanlinidon H.A.等人和日本的Watanabe M.等人都在柠檬汁、鲜奶、咖啡、橙汁等液体食品中加入冰核活性细菌，实现了这些食品原料的冷冻浓缩。在冷冻浓缩柠檬汁的研究中，显示出浓缩汁的固形物回收率高，风味营养成分保持好，气相色谱分析和感官评定均表明与鲜汁没有差异。1995年Minjung等用P.syringae冷冻浓缩葡萄汁，冷冻温度为-6℃，加入冰核细菌的样品在-2.2℃就出现冰晶并开始冻结，而不加的样品则无结冰现象。这些结果表明了，该技术不仅提高了食品原料的产品品质，而且使得香气流失也低于传统的低温真空浓缩，特别表现出了浓缩速度快的优点。2000年陈庆森、刘剑虹等人从事了高活性冰核活性蛋白制剂在基围虾微冻保鲜的研究，取得了较好的实验结果。另外，在食品原料如鱼肉、蛋白质、油脂中添加冰核活性细菌可使过冷却程度减轻，温度提高到-3～-4℃就可以冻结，总的冷却时间降低33％。冰核活性细菌在低温冷冻食品中的应用不仅可提高冻结的温度，缩短冻结所需时间，更重要的是可解决由于过冷却现象而生成大的冰晶对冷冻食品的风味和营养成分造成过多损失的这样长期困扰低温冷冻食品的问题，同时也为制冷工业节约了大量的能源，可见冰核活性细菌的应用前景相当广阔，也是生物技术在食品科学和食品工业中的一项独特的应用。这些研究充分说明，冰核活性细菌在冷冻技术上将产生巨大的潜能和开发空间。
然而，绝大部分的冰核活性细菌都是植物致病菌，要将冰核活性细菌应用到食品行业就不得不考虑其安全性的问题。应用的冰核活性细菌必须是卫生、无毒性、无致病性的，这样才符合食品安全性的要求。近年来，日本的厚生省批准了将冰核活性细菌Xanthomonascamperstris INXC-1在高静压处理后可以应用在食品加工行业。本技术使用的菌种也属于Xanthonanas这一菌属，与Xanthomonascamperstris INXC-1有很近的亲缘关系，所以这种细菌也很有希望被应用在食品生产行业。此外本技术所使用的菌种还具有稳定性强，呈冰核活性高的特点。这些特点都使这种菌种有希望大规模的应用在食品加工行业。
本发明目的在于提供一种促进冰核活性细菌高表达冰核活性蛋白的发酵生产技术。本发明所选用的菌种为本实验室分离纯化所获得的一种黄单胞细菌(Xanthomonas ampelinaTS206)，采用二级发酵工艺培养冰核活性细菌。为了获得大量的具有高冰核活性的菌体，首先要确定适合菌体生长的C源、N源以及促进菌体生长和表达冰核活性蛋白的促进因子，然后通过实验确定这些因子在培养基中的最佳配比，以获得最佳的培养基配方。改善细菌的培养条件对于获得高产的具有高冰核活性的细菌也是至关重要的。利用最佳的培养基配方培养冰核活性细菌，通过实验确定冰核活性细菌的最适培养条件。
该发酵技术发酵培养冰核活性细菌，所得的发酵液中的菌体浓度大于2.87×1010个/ml，通过离心沉淀的方法获得的具有活性的菌体烘干后的干重大于9g/L。该项发明为将冰核活性细菌能够应用于工业化的生产打下了坚实的基础。
本发明所建立的促使冰核活性细菌高表达冰核活性蛋白的技术的主要特点为①通过这种培养方法发酵获得的冰核活性细菌具有很高的生物量，为今后提取冰核活性蛋白的工业化生产奠定了基础；②发酵获得的菌体具有很高的冰核活性，为提取大量的冰核活性蛋白打下坚实的基础。
下面的实施例是对本发明做详细描述。
实施例
通过无菌操作，将菌体在斜面上活化，斜面的主要成分为牛肉膏1％～20％、蛋白胨1％～20％、甘油3％～30％和琼脂1％～2.5％。
将活化的菌种接入种子液培养4～48h，培养的温度为15℃～40℃，液体培养基的装液量为120～320ml/L，摇床转速为140～200rpm。种子液的主要成分为牛肉膏1～10g/L，蛋白胨1～20g/L，甘油5～50g/L，pH值为3～11。
将种子以1％～5％的接种量转接入发酵培养基中培养。发酵液的主要成分为酵母浸出粉5～40g/L，蔗糖5～50g/L，山梨醇1～10g/L，牛肉膏1～10g/L，蛋白胨1～20g/L，甘油5～50g/L，K2HPO41～10g/L，pH值为3～11。培养的条件为培养的温度15℃～40℃，液体培养基的装液量120～320ml/L，培养的时间30～60h，摇床转速150～220rpm。
获得的发酵也可以通过离心沉淀的方法获得有活性的菌体。离心的转速为2000～6000rpm，时间为10～30min。
实施例1所获产品的主要技术指标为获得发酵液菌体浓度≥2×109～4×1011cell/ml，菌体的干重可以达到9克以上。将具有冰核活性的菌悬液稀释到OD600＝0.1后，在-3℃下1min内的冻滴率应≥90％。
通过上述实验所获得的产品不仅菌体的含量高，而且菌体细胞具有很高的冰核活性(达到90％～100％)，这项技术为将冰核活性蛋白应用在食品行业打下了坚实的基础。
权利要求
1.一种促使冰核活性细菌高表达冰核活性蛋白的方法，其特征在于使用具有冰核活性的菌种，如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)和黄单胞菌属(Xanthomonas)。通过优化培养冰核活性细菌的发酵培养基和改善培养冰核活性细菌的发酵条件，从而获得高产量并具有高冰核活性的冰核活性细菌的菌体。通过利用本专利的方法培养冰核活性细菌可以通过离心沉淀菌体的方法获得冰核活性细菌，发酵液的菌浓大于2.87×1010个/ml。
2.根据权利要求1所述，本发明所使用的菌种由发明人分离和保藏(该菌种从天津地区油菜叶表分离获得)，该菌种的主要特征为在肉汤培养基平板上菌落为黄色，杆状，革兰氏染色为阴性，极生鞭毛，不发酵葡萄糖，不还原硝酸盐，氧化酶阴性，经鉴定为Xanthomonas属，再根据该菌种具有脲酶活性和相应碳源利用谱，推测该菌种为X.anpelima[源自天津市蔬菜叶表冰核活性细菌的调查与分离鉴定《食品科学》2000，21(11)54-56]。
3.根据权利要求1所述，培养获得高表达冰核活性蛋白的冰核活性细菌采用二级发酵生产工艺，即原菌种活化、一级种子、二级发酵的工艺过程。
4.根据权利要求1所述，培养获得高表达冰核活性蛋白的冰核活性细菌首先要寻找适合菌种发酵生产的C源、N源以及促进菌体生长和表达冰核活性的各种促进因子，最后优化各个营养组分在培养基中的比例，以便获得最适宜冰核活性细菌生长发酵培养基的配方。其特点在于培养基的组份为酵母浸出粉5～40g/L，蔗糖5～50g/L，山梨醇1～10g/L，牛肉膏1～10g/L，蛋白胨1～20g/L，甘油5～50g/L，K2HPO41～10g/L。
5.根据权利要求1所述，培养获得高表达冰核活性蛋白的冰核活性细菌还要改善细菌的培养条件，找出最佳的综合培养条件。其特征在于培养条件为培养基的pH值为3～11，培养的温度为15℃～40℃，液体培养基的装液量为30～80ml/250ml，接种量为1％～5％，培养的时间为30～60h，摇床转速为140～200rpm。
6.根据权利要求1所述，用上述方法培养冰核活性细菌可以获得高产量、高冰核活性的细菌。其特点在于培养所得到的发酵液的菌体浓度为2.87×1010个/ml。用离心沉淀的方法可以获得有高冰核活性的菌体。烘干菌体获得的菌体干重大于9g/L。
全文摘要
将冰核活性蛋白应用于食品的冻结和低温保鲜过程中，可提高被冻结物料的过冷点，缩短冷冻时间，从而节省大量能源，同时可以大大地提高冻结物料的品质。本发明采用微生物发酵生产技术，获得了具有高冰核活性和高生物量的冰核活性细菌的菌体蛋白质。为冰核活性细菌在食品行业的应用打下坚实的基础。
文档编号C12N15/63GK1480536SQ0315029
公开日2004年3月10日 申请日期2003年7月24日 优先权日2003年7月24日
发明者陈庆森, 宋丽萍, 阎亚丽, 刘健 申请人:天津商学院