一种克服滞后污染的pcr方法

专利名称：一种克服滞后污染的pcr方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及聚合酶链式反应方法。
背景技术：
聚合酶链式反应(PCR)是一种快捷、高效的扩增特定DNA的方法。根据PCR的基本原理经过25-30循环扩增目标基因片段将增加800万至2亿5千万倍。由于扩增产物和样品中的目标基因均可作为扩增模板，痕迹量乃至几个拷贝扩增产物DNA片段的滞后污染，即会造成比交叉污染严重得多的麻烦。为了减少滞后污染的机会通常需采取严格的物理防范措施(J.L.Hartley等，PCR Method andapplications，1993，3，S10-S14)，例如将PCR反应液制备区与PCR产物检测区分开甚至分二个房间，应用专门的PCR操作箱和专用的移液管，应用带气雾阻挡物的PCR专用移液头，用特制的能破坏DNA的试剂清洁操作台表面及各种器具等等。为了减少气流振荡造成微量反应液扩散，有人甚至主张在PCR反应完成后，先将试管冷冻至液体结成冰，然后再打开管盖。各种物理措施尽管必要，但滞后污染仍防不胜防，为此发展了各种化学和生物化学方法，如光敏DNA交联剂、核酸酶和脱氧尿嘧啶糖苷酶(UDG)方法等。至今，在试剂盒中被采用的是UDG方法，该方法(M.C.Longo等，Gene，1990，125-128)用特殊核苷酸dUTP取代4种核苷酸底物中的dTTP，使扩增产物带有尿嘧啶。PCR反应前用脱氧尿嘧啶糖苷酶分解可能存在于反应液中的滞后污染扩增产物。该方法的严重缺点是由于扩增产物带有大量非天然的碱基，PCR产物不适宜用于克隆等目的。90年代初有科学家提出用核酸酶和能切割扩增产物顺序的一种或几种限制性内切酶处理反应液，能有效去除可能存的滞后污染扩增产物(F.M.deFlilippes，BioTechniques，1991，1026-29和B.Furrer等，Nature，1990，346324)，但必须在酶处理之后再向反应液加样品DNA，否则目标基因DNA也会被酶切割而导致扩增失败。由于样品本身也可能带有滞后污染扩增产物，这种方法形同虚设，实际上难以实施。本发明提出了一种有效而可实际操作的用限制性内切酶减少和消除滞后污染的方法。

发明内容
本发明所要解决的技术问题本发明提供一种克服滞后污染的PCR方法，以填补目前通过引物设计和常规限制性内切酶处理的方法解决滞后污染问题的空白，解决现有技术中克服滞后污染需专用试剂和酶、操作复杂、产物无法进行克隆的缺陷。
发明构思本发明的原理鉴于在引物的适当位置中引进一个或若干个错配碱基，引物仍能在较高的退火温度下专一地完成扩增，同时，扩增产物又带有一个目标基因所不含有的限制性内切酶识别顺序。在每一次PCR反应前用特定的限制性内切酶处理反应液，就可分解可能存在的滞后污染扩增产物，但又不伤及样品DNA中的目标基因。被限制性内切酶分解的扩增产物，因为在它的正、反链的5’端各失去了一个约十个碱基的片段，在设定的PCR退火温度下不再能与引物结合，失去了作为模板的功能。
技术方案本发明提供一种能克服滞后污染的聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括(1)用限制性内切酶处理PCR反应液；(2)DNA模板变性解链；(3)引物与模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行合成反应；特别地，在设计正引物或者反引物时引进错配碱基，使扩增产物含有目标基因所没有的限制性内切酶识别顺序。优选正、反引物同时引进错配碱基。
上述的聚合酶链式反应方法的一个技术方案为，在引物中引进的错配碱基数为1-8个，优选1-3个。
上述的聚合酶链式反应方法的另一个技术方案为，在引物中引进的错配碱基位于引物3’或5’端起5-25碱基，优选位于引物3’或5’端起10-15碱基。
上述的聚合酶链式反应方法的另一个技术方案为，引进错配碱基的引物具有1-6个限制性内切酶切点，优选具有2-4个限制性内切酶切点，这些内切酶的识别顺序碱基数为4-8个，优选的识别顺序碱基数为6个。
上述的聚合酶链式反应方法的另一个技术方案为，所说的限制性内切酶为产生平末端、3’粘性末端或者5’粘性末端的酶。
上述的聚合酶链式反应方法的另一个技术方案为，引进的错配碱基在限制性内切酶的识别顺序中近5’端的位置。
下面通过一些计算和测试分析结果来说明本发明的原理和普遍可用性。
首先以全长1800多碱基的人肌动球蛋白基因为例进行分析，说明在引物的中间位置有一个碱基突变对引物功能的影响，和从该位置开始去除5’端片段碱基对引物功能的影响。测试时每间隔100个碱基取一段30碱基寡核苷酸作为正引物，然后分析在3’端数起的第12个碱基发生A与T，或C与G的碱基置换后，引物与模板的结合强度及解链温度变化，并与去除第12位以后的5’端碱基的数据进行比较。用引物软件Oligo6测算结合强度和解链温度。表1列出每一个项目17个数据的统计结果。
表1.错配碱基和去除一段碱基对引物特性的影响

*最邻近碱基计算法**在引物软件设定的标准PCR反应液条件下的解链温度表1说明30碱基长引物与模板的平均结合强度超过570，如果在引物的3’端第12位引进一个碱基突变，则平均结合强度仍达450，远远超过一个高严谨性引物对该项指标的要求。反之，如果模板在该位置以后的5’端被切除，则引物与模板的结合强度下跌至308。另一方面，30碱基长引物的平均解链温度为86℃，最高允许退火温度超过72℃。引物引进一个突变后解链温度下降约4℃，仍能在接近或高于72℃的高温下退火。但是当模板的5’端顺序被切割后，引物与模板的最高允许退火温度平均下降至45℃(根据标准PCR条件下的Tm计算)。所以，在30碱基长引物的第12位引进一个突变，使之形成一个限制性内切酶识别顺序。如用该限制性内切酶处理PCR反应液，酶对目标基因不切割。引物与原始目标基因模板虽有一个错配，但仍能在高温下与之退火完成扩增。滞后污染扩增产物的5’端会被限制性内切酶分解，形成5’端缺失十几个碱基的不完整模板，在同样的温度下引物不能与之退火，滞后污染扩增产物就丧失了模板的作用。
为了理解该方法的普遍应用性，分析在人肌动球蛋白基因中引入一个碱基错配后，能产生多少新增加的限制性内切酶识别顺序。以最常用的识别顺序为六个碱基的六种限制性内切酶BamHI，EcoRI，HindIII，PstI，SalI和XhoI为例进行分析。限制性内切图谱表明这六个酶在该基因中均无切割位点。但是只要改变一个碱基就能产生许多新的被酶切割的位点。分析结果示于表2，粗黑体表示该硷基被取代后能产生一个酶识别顺序。
表2.改变一个碱基后新增的限制性内切酶的识别位点


表2说明在长1880多碱基的基因中，对指定的六种识别顺序为6个碱基的限制性内切酶，只要改变一个碱基就能产生36个新增的识别顺序，平均每个酶能找到6个位点。常用的限制性内切酶有几十种，能找到的总位点数将数以百计。如果将错配碱基数放宽到2或3个，新增的限制性内切酶识别位点数将大大增加。
有益效果本发明提供的通过引物设计和常规限制性内切酶处理克服滞后污染的PCR方法，填补了目前解决滞后污染问题上的空白，其有益效果除其他方法也能达到的完全分解污染片段外，其独特之处还在于；1，本发明的方法是在下一轮PCR反应之前而不是PCR反应结束时采取防范措施，PCR扩增产物可用于分子杂交等，与标准PCR产物完全一样。
2，用本发明的PCR反应溶液不含有任何非天然核苷酸底物，或含非天然核苷酸的引物，PCR反应的各项特性与标准PCR保持一致。
3，PCR扩增产物也不含有非天然核苷酸，产物可用于克隆和其他目的。产物的用途与标准PCR产物完全一致。
4，限制性内切酶除了分解滞后污染的扩增产物外，还会分解基因组DNA的非目标基因，将基因组DNA切割成比原来小片段，有利于减少空间位阻现象和降低非专一扩增机会。
具体实施例方式
实施例1.
实施例1用一对引物扩增GPT结合蛋白RhoA基因(基因库编号L25080)的一个片段，再将PCR扩增产物稀释作为下一轮PCR反应的扩增模板。新一轮PCR反应前用对该片段顺序有切割位点的一个限制性内切酶或二个限制性内切酶分解，并以加热方法预先被完全灭活的酶作为对照。根据新扩增产物条带首次出现的循环数，来估测限制性内切酶对底物DNA的破坏程度。正反引物的顺序见表3。
表3.实施例1引物顺序

扩增产物长度为590bp，限制性内切酶EcoRV和PvuII对扩增产物片段各有一个切点。先以商品人组织总RNA为原始模板，用Clontech公司的反转录试剂盒以Oligo(dT)作反转录引物合成cDNA。再用该公司的Advantage-2-PCR试剂盒进行扩增。每管反应体积25微升，加cDNA2.5微升，引物浓度0.4uM。PCR程序为首次变性95℃1分钟，循环变性95℃10秒钟，退火和延伸68℃1分半钟，共30循环。反应结束后用电泳和染色方法检测扩增产物，然后将扩增产物稀释100倍，作为下一轮PCR的模板。
第二轮PCR反应，每管反应体积5微升，每100微升反应液加经稀释的扩增产物2微升，并加0.5微克商品Iamda噬菌体DNA代替人基因组DNA作为“背景”DNA。PCR程序与第一轮相同，但PCR反应开始前先37℃保温1小时，首次变性为95℃3分钟。对照组加预先热灭活的EcoRV和PvuII2.5微升/50微升反应液，试验组1加EcoRV2.5微升/50微升反应液，试验组2加EcoRV和PvuII各2.5微升/50微升反应液。从PCR第12循环起每隔3个循环取一管进行分析，直至第36循环。试验结果示于表4。
表4.实施例1试验结果

表4说明用一个限制性内切酶破坏模板，扩增产物出现比对照组迟6个循环；用二个限制内切酶同时作用时，扩增产物出现比对照组迟12个循环，假定每一循环扩增产物增加达到倍增，则用2个限制性内切酶作用时99.9％以上的底物DNA被分解。
实施例2.
实施例2以人beta-2-肾上腺素受体基因(基因库编号M15169)和人甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因(基因库编号XM_006959)为例进行类似的分析。引物顺序见表5。
表5.实施例2引物顺序


肾上腺素受体基因扩增产物长252碱基，同时用二种限制性内切酶PstI和HaeII作用；甘油醛磷酸脱氢酶基因扩增产物长388碱基，同时用二种限制性内切酶XhaI和HaeII作用。cDNA制备，第一轮和第二轮PCR扩增程序，限制性内切酶的加量等均与实施例1相同，但将25微升第一轮扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，切割其条带溶于500微升水，在37℃洗脱过夜作为第二轮PCR的模板。试验结果示于表6。
表6.实施例2试验结果


结果表明用酶处理的试验组扩增产物条带的出现都比对照组迟9个循环。说明99％以上的底物DNA被酶破坏。
实施例3.
实施例3以人肌动球蛋白基因为目标基因(基因库编号BC016045)设计一对引物，正反引物与目标基因顺序匹配，但分别引进一个错配碱基，正引物造成一个EcoRI切割位点，而反引物造成一个HindIII切割位点。实施例3所用引物顺序和特性示于表7和8。
表7.实施例3引物顺序

引物“A正”和“A反”顺序中的斜写字体碱基为引进的错配碱基，含下划线部分分别为引进错配碱基后形成的EcoRI和HindIII识别顺序。引物“A1正”与引物“A正”的3’端相同；引物“A1反”与引物“A反”的3’端相同。
表8.实施例3引物特性

用Oligo(dT)合成cDNA，用引物“A”扩增cDNA的试剂和方法与实施例1相同，退火步骤为68℃1分15秒。用凝胶电泳检查PCR扩增产物，然后将PCR反应液稀释500倍作为下一轮PCR反应的模板。第二轮PCR方法与实施例1相同，退火步骤为68C°1分15秒。对照组加预先热灭活的EcoRI和HindIII各2.5微升/50微升反应液；试验组1加EcoRI和HindIII各2.5微升/50微升反应液；试验组2与试验组1相同但不加Iamda噬菌体DNA；试验组3与试验组1相同但PCR退火温度为48℃。试验结果示于表9。
表9实施例3试验结果


试验组1出现扩增产物比对照组迟9个循环，这是由于在正反引物中各引进了一个错配碱基后，扩增产物的二个末端各形成了一个限制性内切酶识别顺序，PCR反应前用酶处理使99％以上的滞后污染扩增产物破坏。试验组2结果说明如果减少“背景”DNA则滞后污染扩增产物破坏更彻底，出现扩增产物比对照组迟12个循环。试验组3结果说明在低退火温度下，被限制性内切酶分解的模板仍能作为扩增模板，说明限制性内切酶作用非常专一，酶只在预期的扩增产物末端的引物部位对扩增产物切割。引物“A1”与基因组DNA模板的结合强度，相当于引物“A”与被酶分解后的扩增模板之间的结合强度。试验表明引物“A1”在48℃退火时能以cDNA为模板扩增目标基因，但68℃退火时得不到目标扩增产物，从另一角度说明了扩增产物被酶解后不再能作为扩增模板，是因为扩增产物的末端顺序被切割。
实施例4实施例4仍以人肌动球蛋白基因为目标基因，引物与实施例3引物”A“相同。cDNA的制备、PCR试剂和PCR程序等均与实施例3相同。试验组1以不同稀释度的cDNA为扩增模板，每100微升PCR反应液加2微升不同稀释度的cDNA。试验组2也以不同稀释度的cDNA为扩增模板，方法与试验组1相同，但反应前用限制性内切酶EcoRI和HindIII处理，方法与实施例3相同。试验组3以不同稀释度的提纯的扩增产物作为扩增模板，每100微升PCR反应液加2微升不同稀释度的扩增产物，PCR反应前用酶处理，方法与试验组2相同。试验组4也以不同稀释度的提纯的扩增产物作为扩增模板，方法与试验组3相同，但EcoRI和HindIII预先被加热灭活。试验组5和6分别与试验组1和2相同，但以基因组DNA为模板，正反引物跨越2个内涵子以基因组DNA为模板时扩增产物长度为727硷基，基因组DNA的扩增片段内也无EcoRI和HindIII的识别顺序。试验组1-4结果示于表10。
表10.实施例4试验结果


试验组1结果表明加常规量的cDNA时，需30循环反应出现扩增产物条带，cDNA加量降低10倍后需35循环才出现扩增产物条带，模板加量继续降低后需要更多的循环才能出现扩增产物条带，或因灵敏度不够而得不到扩增产物。试验组2的结果和试验组1相同，说明限制性内切酶不切割RNA/DNA嵌合物。试验组5和6的扩增结果也相同，说明限制性内切酶处理不影响正常的扩增反应。试验组4结果说明痕迹量滞后污染会造成严重的假阳性，本例将25微升PCR反应液用凝胶电泳分离，切割条带后再用DNA分离试剂盒回收，并恢复至原来的体积。假定纯化步骤的得率为50％，则试验组4结果表明，20万分之一体积的PCR反应液的滞后污染就导致假阳性结果。试验组3结果表明用本发明方法能完全克服痕迹量滞后污染导致的假阳性，也能有效降低较严重滞后污染导致的假阳性。
权利要求
1.一种能克服滞后污染的聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括(1)用限制性内切酶处理PCR反应液；(2)DNA模板变性解链；(3)引物与模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行合成反应；在设计正引物或者反引物时引进错配碱基，使扩增产物含有目标基因所没有的限制性内切酶识别顺序。
2.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应，其特征在于正、反引物同时引进错配碱基。
3.根据权利要求1或2所述的聚合酶链式反应，其特征在于在引物中引进的错配碱基数为1-8个。
4.根据权利要求3所述的聚合酶链式反应，其特征在于在引物中引进的错配碱基数为1-3个。
5.根据权利要求1或2所述的聚合酶链式反应，其特征在于引进的错配碱基位于引物3’或5’端起5-25碱基。
6.根据权利要求5所述的聚合酶链式反应，其特征在于引进的错配碱基位于引物3’或5’端起10-15碱基。
7.根据权利要求1或2所述的聚合酶链式反应，其特征在于引进错配碱基的引物具有1-6个限制性内切酶切点，这些内切酶的识别顺序碱基数为4-8个。
8.根据权利要求7所述的聚合酶链式反应，其特征在于引进错配碱基的引物具有2-4个限制性内切酶切点，这些内切酶的识别顺序碱基数为6个。
9.根据权利要求1或2所述的聚合酶链式反应，其特征在于所说的限制性内切酶为产生平末端、3’粘性末端或者5’粘性末端的酶。
10.根据权利要求1或2所述的聚合酶链式反应，其特征在于引进的错配碱基在限制性内切酶的识别顺序中近5’端的位置。
全文摘要
本发明提供一种克服滞后污染的PCR方法，就是针对滞后污染严重影响PCR在临床诊断中应用，而尚无一种理想的克服方法的现状，提供一种比现有方法更简单、有效的克服滞后污染的方法，PCR反应过程和扩增产物均切合原来的状态。
文档编号C12P19/34GK1584042SQ03150448
公开日2005年2月23日 申请日期2003年8月19日 优先权日2003年8月19日
发明者徐定邦, 朱德芬, 谢文凯, 徐文慧 申请人:徐定邦, 徐文慧