专利名称：一种昆虫病毒繁殖中的收集方法
技术领域：
本发明涉及一种昆虫病毒繁殖技术，更具体地说，本发明涉及一种昆虫病毒繁殖中的高产及收集方法。
背景技术：
茶尺蠼、茶毛虫、扁刺蛾等是茶树的主要食叶性害虫。为了降低茶叶中化学农药的残留量，应用昆虫病毒杀虫剂是茶树害虫的有效生物防治途径。但昆虫病毒只能在活体(细胞)中繁殖，不能像真菌、细菌那样用培养基中进行发酵的方法来大量生产。迄今国内外进行昆虫病毒生产的方法是，大量饲养幼虫，到一定虫龄，使幼虫取食病毒感染体，病毒在幼虫体内不断繁殖，当体内充满病毒时幼虫死亡，在幼虫开始死亡后逐日收集虫尸和濒死幼虫(估计下一天会死亡的幼虫)，收集完毕后再提取虫尸中的病毒，制成生物病毒杀虫剂。但在目前昆虫病毒生产中存在着生产周期长，病毒产量低。如茶尺蠼，产量仅1～1.5亿多角体(PIB)/头，病毒收集工作费工又费时，操作十分烦琐，如一般幼虫饲毒7～8天后开始死亡，即每天要收集虫尸与濒死幼虫，约需收集7～8天，这饲毒、繁毒、收集全过程需经15～16天才能结束，同时，收集虫尸时少数虫尸已解体，难于取出，也有的虫尸在收集时破碎，病毒产量受损失，收集濒死幼虫也较难确认，因此，如何提高单虫病毒产量及简化昆虫病毒繁殖中的收集方法是迫切需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足之处，提供一套生产周期短，病毒产量高，并能一次性快速收集病毒的方法。
本发明目的通过下述技术方案予以实现。
一种昆虫病毒繁殖中的收集方法，包括以下步骤(1)健康幼虫的饲养以广口透明瓶为容器，在20～30℃条件下添加饲料，饲养健康幼虫8～10天，饲养密度由密逐步放稀至10头幼虫/100cm3；(2)适龄幼虫的饲毒感染及病毒繁殖在20～30℃条件下，选用3龄中期健康幼虫，始食含0.005亿多角体(PIB)/毫升浓度病毒的饲料，饲毒3天后再改用无毒饲料，感染病虫在体内逐步繁殖病毒；(3)虫体病毒的收集3龄中期幼虫饲毒7～8天后，即刚开始有虫死亡时，一次性将所有活幼虫及少量虫尸收集到广口容器中，按60～100头虫/100cm3密度在15℃恒温条件下保存20～30天，幼虫在此期间继续繁毒并缓慢死亡；(4)病毒的提取与剂型配置上述虫尸经浸泡、研碎、过滤、离心沉淀，显微镜测数，定量稀释成病毒液后，再辅以填料、助剂等配置成病毒生物农药。
所述幼虫饲料为鲜食饲料，如新鲜茶树叶或人工配合饲料；所述幼虫饲毒，繁毒最佳温度为24℃。
本发明所述方法的有益效果，一是显著提高病毒繁殖的产量，本发明从虫卵孵化开始，科学组配了3龄中期幼虫，0.005亿多角体/毫升饲毒浓度及24℃恒温繁毒的工艺方案，既为病毒繁殖提供了最大的虫体(即为病毒载体与营养源)，又提供了充足的繁毒时间，使感病幼虫均在蛹期前夕充分繁毒后死亡，从而使单虫产毒量由1～1.5亿PIB提高到4～6亿PIB左右；二是简化了病毒收集的方法，提高了效率，新方法采用一次性收集所有感病活虫及少量虫尸，可在一天内完成，操作简便、易行，大面积病毒繁殖周期由原来的15～16天缩短为7～8天，其用工、用电均减少50％左右，也可增加病毒繁殖的批次，同时新方法也不存在由于虫尸体破裂而造成部分病毒损失，从而使每批次病毒产量提高10％以上。
具体实施例方式
下面结合3个实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1 茶尺蠖病毒生产工艺(一)幼虫的饲养1.将1对成虫(雌、雄)放在玻璃罐头瓶(玻璃容器)中饲养，产卵后取出成虫。
2.上述卵孵化为幼虫时，加入饲料(茶叶或人工饲料)饲养，饲料食完前应添加饲料。随着幼虫不断长大，1个瓶内的幼虫分为3瓶或多瓶，最后使每瓶的虫数为50头左右。用人工饲料饲养的应多分几瓶，每瓶10~15头。
(二)病毒繁殖(增殖)3.上述幼虫在24℃下饲养7～8天时，加入有毒叶片(叶片在0.005亿多角体/ml的病毒液中浸湿后取出晾干)饲毒，3天后再用无毒叶片饲养；用人工饲料饲养的则用喉头喷雾器和上述病毒液将瓶内饲料表面喷湿润即成。
4.上述幼虫从取食有毒叶片(饲毒日期)起饲养7～8天后，幼虫开始死亡，此时将活幼虫抓在罐头瓶中(每瓶300～500头)，放在15℃的恒温中保存25天(此期间活幼虫均缓慢死亡)后即可提取病毒，或转放到冰箱4℃中保存。
(三)病毒提取与剂型配制5.上述虫尸加少量水浸泡数天。
6.浸泡过的虫尸用组织捣碎机捣碎。
7.捣碎液加适量水后用双层纱布或铜60目纱过滤，弃去残渣、取滤液。
8.滤液经300～500转/分离心沉淀，弃去沉淀，取溶液(病毒液)。
9.病毒液经3000～4000转/分离心沉淀，弃去上清液，取沉淀(病毒多角体)。
10.上述沉淀加水搅匀后再经3000～4000转/分离心沉淀一次，弃去上清液，取沉淀(病毒多角体)。
11.上述沉淀加少量蒸馏水搅匀洗出，即获得纯病毒多角体原液。
12.病毒原液用显微镜血球计数法测出多角体含量，再加定量水稀释成一定浓度的病毒液。
13.将填料高岭土、助剂乳化剂等与病毒液按一定比例混匀后，即获得茶尺蠖病毒制剂生物农药。
实施例2茶毛虫病毒生产工艺(一)幼虫的饲养1.将1对成虫(雌、雄)放在玻璃罐头瓶(玻璃容器)中饲养，产卵后取出成虫。、2.上述卵孵化为幼虫时，加入饲料(茶叶或人工饲料)饲养，饲料食完前应添加饲料。随着幼虫不断长大，1个瓶内的幼虫分为3瓶或多瓶，最后使每瓶的虫数为50头左右。用人工饲料饲养的应多分几瓶，每瓶10～15头。
(二)病毒繁殖(增殖)3.上述幼虫在24℃下饲养25天时，加入有毒叶片(叶片在0.005亿多角体/ml的病毒液中浸湿后取出晾干)饲毒，3天后再用无毒叶片饲养，用人工饲料饲养的则用喉头喷雾器和上述病毒液将瓶内饲料表面喷湿润即成。
4.上述幼虫从取食有毒叶片(饲毒日期)起饲养10天后，幼虫开始死亡，此时将活幼虫抓在罐头瓶中(每瓶300～500头)，放在25℃的恒温中保存25天，此期间活幼虫均缓慢死亡后即可提取病毒，或转放到冰箱4℃中保存。
(三)病毒提取与剂型配制5.上述虫尸加少量水浸泡数天。
6.浸泡过的虫尸用组织捣碎机捣碎。
7.捣碎液加适量水后用双层纱布或60目铜纱过滤，弃去残渣、取滤液。
8.滤液经300～500转/分离心沉淀，弃去沉淀，取溶液(病毒液)。
9.病毒液经3000～4000转/分离心沉淀，弃去上清液，取沉淀(病毒多角体)。
10.上述沉淀加水搅匀后再经3000～4000转/分离心沉淀一次，弃去上清液，取沉淀(病毒多角体)。
11.上述沉淀加少量蒸馏水搅匀洗出，即获得纯病毒多角体原液。
12.病毒原液用显微镜血球计数法测出多角体含量，再加定量水稀释成一定浓度的病毒液。
13.将填料高岭土、助剂乳化剂等与病毒液按一定比例混匀后，即获得茶毛虫病毒制剂生物农药。
实施例3 扁刺蛾病毒生产工艺(一)幼虫的饲养1.将1对成虫(雌、雄)放在玻璃罐头瓶(玻璃容器)中饲养，产卵后取出成虫。
2.上述卵孵化为幼虫时，加入饲料(茶叶或人工饲料)饲养，饲料食完前应添加饲料。随着幼虫不断长大，1个瓶内的幼虫分为3瓶或多瓶，最后使每瓶的虫数为50头左右。用人工饲料饲养的应多分几瓶，每瓶10～15头。
(二)病毒繁殖(增殖)3.上述幼虫在24℃下饲养15天时，加入有毒叶片(叶片在0.005亿多角体/ml的病毒液中浸湿后取出晾干)饲毒，3天后再用无毒叶片饲养，用人工饲料饲养的则用喉头喷雾器和上述病毒液将瓶内饲料表面喷湿润即成。
4.上述幼虫从取食有毒叶片(饲毒日期)起饲养7～8天后，幼虫开始死亡，此时将活幼虫抓在罐头瓶中(每瓶300～500头)，放在15℃的恒温中保存25天，此期间活幼虫均缓慢死亡后即可提取病毒，或转放到冰箱4℃中保存。
(三)病毒提取与剂型配制5.上述虫尸加少量水浸泡数天。
6.浸泡过的虫尸用组织捣碎机捣碎。
7.捣碎液加适量水后用双层纱布或60目铜纱过滤，弃去残渣、取滤液。
8.滤液经300～500转/分离心沉淀，弃去沉淀，取溶液(病毒液)。
9.病毒液经3000～4000转/分离心沉淀，弃去上清液，取沉淀(病毒多角体)。
10.上述沉淀加水搅匀后再经3000～4000转/分离心沉淀一次，弃去上清液，取沉淀(病毒多角体)。
11.上述沉淀加少量蒸馏水搅匀洗出，即获得纯病毒多角体原液。
12.病毒原液用显微镜血球计数法测出多角体含量，再加定量水稀释成一定浓度的病毒液。
13.将填料高岭土、助剂乳化剂等与病毒液按一定比例混匀后，即获得扁刺蛾病毒制剂生物农药。
权利要求
1.一种昆虫病毒繁殖中的收集方法，其特征是包括以下步骤(1)健康幼虫的饲养以广口透明瓶为容器，在20～30℃条件下添加饲料，饲养健康幼虫8～10天，饲养密度由密逐步放稀至10头幼虫/100cm3；(2)适龄幼虫的饲毒感染及病毒繁殖在20～30℃条件下，选用3龄中期健康幼虫，始食含0.005亿多角体/毫升浓度病毒的饲料，饲毒3天后再改用无毒饲料，感染病虫在体内逐步繁殖病毒；(3)虫体病毒的收集3龄中期幼虫饲毒7～8天后，即刚开始有虫死亡时，一次性将所有活幼虫及少量虫尸收集到广口容器中，按60～100头虫/100cm3密度在15℃恒温条件下保存20～30天，幼虫在此期间继续繁毒并缓慢死亡；(4)病毒的提取与剂型配置上述虫尸经浸泡、研碎、过滤、离心沉淀，显微镜测数，定量稀释成病毒液后，再辅以填料、助剂等配置成病毒生物农药。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述幼虫饲料为鲜食饲料或人工配合饲料。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述幼虫饲毒，繁毒最佳温度为24℃。
全文摘要
本发明公开了一种昆虫病毒繁殖中的收集方法，旨在提高昆虫病毒的产量并简化病毒繁殖中的收集方法，它以3龄中期的幼虫为适宜虫龄，0.005亿多角体/毫升浓度饲养3天，在24℃环境下试验7～8天后即可一次性将活幼虫收集，在15℃恒温条件下保存20～30天后，提取病毒并加工成昆虫病毒杀虫剂，该法单虫产量由1～1.5亿PIB提高到4～6亿PIB，并大大简化了病毒收集的工序，用工、用电均接省50％左右，并使每批次病毒产量提高10％以上。
文档编号C12N7/01GK1584021SQ0315044
公开日2005年2月23日 申请日期2003年8月20日 优先权日2003年8月20日
发明者殷坤山, 肖强, 唐美君, 郭华伟 申请人:中国农业科学院茶叶研究所