空间细胞电融合培养系统的制作方法

专利名称：空间细胞电融合培养系统的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及空间生物技术，尤其是指一种能够在空间环境下同时分别实现动物和植物细胞融合和培养的细胞电融合培养系统。
背景技术：
细胞融合是细胞工程的重要方法之一。植物细胞可通过体细胞融合克服远缘杂交不孕性培育新品种，动物细胞可通过产生特定抗体的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合获得用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。如果细胞融合获得成功，不论是拿到一个植物新品种还是拿到一个动物杂交瘤，其经济效益和社会效益都是无法估量的。动物细胞和植物细胞的各项融合参数存在较大的差异，对植物细胞来说，细胞融合技术实际应用存在的主要问题是杂种细胞的筛选。对动物细胞来说，细胞融合技术实际应用的主要问题是融合得率太低，一般只有10-4～10-5左右。由于细胞融合在分子生物学、生物技术和生物制药等方面的重要性，任何一种能增加细胞融合频率、提高细胞融合效率和改善融合细胞活力的技术，都会很快引起普遍的关注。在地面细胞融合实验中，由于重力引起的细胞沉淀和热对流干扰了细胞膜的紧密接触，大大限制了细胞融合效率的提高。而空间微重力环境中，重力沉降趋于消失，为提高细胞融合效率创造了前所未有的条件和特别的机会，在这种条件下实施细胞融合，可以获得比较理想的实验结果。大量的飞行实验结果表明在微重力条件下酵母细胞杂种得率有很大的增加(TEXUS 11/12)。有液泡和无液泡的烟草叶肉原生质体在微重力条件下融合，不仅1∶1杂种细胞得率大大增加，而且获得的杂种细胞更具有活力(TEXUS 17)。哺乳动物细胞在微重力环境中融合得率增加10倍，有活力的杂种细胞数也比地面对照增加2倍(TEXUS 18)。融合效率的提高显然是由于没有重力沉降影响的缘故，杂种细胞活力增加可能是由于在空间微重力环境下需要的细胞排列时间缩短引起的。与化学及生物因素诱导细胞融合相比，电融合是一种高效无毒、简便易行和通用性强且能够实施遥控的细胞融合技术，更适合于空间实验。因此，建立一个空间细胞电融合培养系统，研究空间微重力条件对细胞电融合效率、生物样品的活性及相关的细胞电融合参数的影响，将具有非常重要的实际意义。
根据我们的文献检索结果，到目前为止，国内外还没有一套系统能同时分别完成动物亲本细胞和植物亲本细胞两种细胞保存、细胞环境液体置换、细胞电融合和融合后细胞的培养。

发明内容
本实用新型的目的是要提供一套全封闭的、无菌的、可实施遥控的、同时分别进行二种细胞环境液体置换、细胞电融合和融合后的细胞培养的空间细胞电融合系统。
本实用新型是通过采用下述技术手段实现的。空间细胞电融合系统是由储液机构、换液机构、细胞电融合室和控制系统工作的控制机构组成。
储液机构有二套，每套储液机构包括三个带独立液体进出口的腔体，它们是培养液室、融合液室和废液室。每个腔体内包括一个密封的硅橡胶翻转囊，分别用来装载培养液、融合液和液体置换后产生的废液。硅橡胶翻转囊还具有液体无菌防护作用。
换液机构包括两组结构独立的换液泵和驱动两组换液泵同步联动的泵驱动电机；控制二组液体管路通、断的液路切换开关和驱动两组开关同步联动的开关驱动电机。详细情况请见本发明人的“细胞环境液体更换装置”，专利申请号031416730X。
电融合室有二个，每个电融合室有一箱体，箱体内有一带有小孔的分隔板将箱体分为前、后二个室，前室内置有二电极构成的横截面为同心圆的电融合腔。前室底部有一箱体底盖，电融合信号接口固定在底盖上，并通过导线与电极连接，为两个电极间的细胞提供高频交流排列电场信号和高压直流脉冲信号。后室内有硅橡胶缓冲囊和细胞滤膜构成的融合液缓冲腔。这样可以保证细胞样品保留在两个电极之间，不会漏出，而多余融合液留在缓冲腔内，达到适合细胞密度变化的高密度细胞电融合目的。详细情况请见本发明人的“空间细胞电融合室”，专利申请号03141674.8。
液体管路有二组，分别将储液机构、换液机构和电融合室连接，形成二套结构独立的，可分别进行二种细胞电融合和培养的细胞电融合培养系统。整个系统置在箱体内，箱体内底部置有带温度传感器的半导体制冷器，使系统在一定的温度范围内工作。
控制机构包括微处理器和软件程序存储器，与微处理器相连的驱动换液泵电机的驱动电路，驱动管路开关电机的驱动电路，细胞电融合所需的高频信号发生器和高压信号发生器。系统通过微处理器程序进行电机驱动与控制、电融合信号产生与控制、温度测量与控制、数据采集和数据通信等，实现对细胞电融合实验全过程的自动控制。
本实用新型的优点是1.该系统可以在空间环境下，同步分别进行动物细胞和植物细胞生存环境液体的自动更换；2.该系统可以在空间环境下，同时分别进行动物细胞电融合和植物细胞电融合，电融合参数可以预置，实验时的电融合参数可以实时测量；3.该系统可以在空间环境下，对动物亲本细胞和植物亲本细胞、动物融合细胞和植物融合细胞进行保存与培养。
4.该系统为生物细胞样品提供了无菌的生存环境条件保障，可以保证细胞样品的生物活性。


图1为空间细胞电融合培养系统结构示意图；图2为储液机构结构示意图；图3为换液机构结构示意图；图4a图为细胞电融合室剖面结构示意图；b图为a图的A-A剖面结构示意图；图5为换液过程控制示意图；图6为融合信号控制示意图；图7为系统控制结构框图；图8为系统控制软件流程图。
具体实施方式
以下结合附图对本实用新型作进一步的详细阐述
见图2，储液装置1是采用聚碳酸脂材料机械加工而成的矩形腔体，内有二个与矩形腔体联成一体的分隔板，形成三个容积相同的废液室11、融合液室12和培养液室13，每个室内装有一个容积为35ml的硅橡胶囊。废液室11采用顶部敞开、底部封闭的结构，其中的硅橡胶囊111采用正装，并与废液室顶部敞开口和环形盖体112之间形成密封，使硅橡胶囊和废液室11矩形腔体之间构成了密封腔体114用来储存废液，当废液从入口113流入时，硅橡胶囊逐渐翻转用来装载废液体。融合液室12和培养液室13采用底部有盖、顶部敞开的结构，融合液室盖体122和培养液室盖体132都采用密封结构，其中的硅橡胶囊和盖体之间形成密封的腔体用来储存液体，充满融合液的硅橡胶囊121和充满培养液的硅橡胶囊131都倒装，硅橡胶囊的翻转功能使液体易于排出；每个硅橡胶囊具有密封功能和液体无菌防护作用。融合液室12盖体122中间有融合液出口123，培养液室13盖体132中间有培养液出口133。
换液机构2中的换液泵21由泵驱动电机22驱动，通过液体出入口23将储液装置1中的融合液或培养液抽入换液泵21，或通过液体出口24将换液泵21内的液体排出到储液装置1中的废液室11。换液机构2中的液路切换开关25～28由步进电机29驱动。换液过程是按照程序存储器的预定程序在换液泵21内自动完成的。换液前，换液泵内充满了细胞和培养液，换液开始后，由步进电机29驱动液路切换开关25～28进行管路切换，将液路切换开关25打开，同时将液路切换开关26、27和28关闭；再由泵驱动电机22通过转动使换液泵21执行推出动作，将细胞和培养液的混合物向左推出，由烧结陶瓷210和细胞滤膜211组成的过滤网可以挡住细胞而使培养液通过，培养液流经出口24进入废液室11。换液泵21准备抽入融合液时，步进电机29通过转动将液路切换开关26打开，同时将液路切换开关25、27和28关闭，然后，泵驱动电机22通过转动使换液泵21执行抽入动作，经过出入口23将融合液从融合液室12抽入换液泵21内。经过预定程序数次液体更换后，换液泵21内充满了细胞和融合液的混合体。
细胞电融合室3如图4所示，由二电极31、32之间构成的横截面为同心圆的电融合腔33用来进行细胞的电融合。完成换液的细胞和融合液混合物由换液泵21通过出入口23推入细胞电融合室3的电融合腔33内，液体缓冲室34中的硅橡胶囊35的容积为2ml，可以容纳由换液泵21推入的多余融合液，细胞滤膜36一方面可以让多余的融合流入液体缓冲室34，另一方面可以保证细胞样品保留在两个电极之间，不会漏出，达到高密度细胞融合的目的。高频插座37是电融合信号的接口，其两个插针分别与两个电极相连，可以为细胞提供排列电场和融合脉冲信号。通过观察窗38可以利用显微镜观察到细胞电融合过程。细胞电融合实验完成后，液路开关27和28打开，同时25和26关闭，换液泵21通过细胞电融合室3将其中的融合细胞和培养液室13内的培养液一起抽入，在换液泵21内进行融合细胞的保存和培养。
细胞电融合培养系统的控制机构见图5～8，控制运行过程描述如下微处理器选用80C31单片机，时钟频率为12M，内存使用其片内RAM。程序存储器为E2PROM(28C64)用来固化系统控制程序。换液泵电机控制和管路开关电机控制都采用SNJ2004达林顿功率输出集成电路。系统启动后首先完成初始化检查和设置，然后，通过向两路达林顿电路分别输出频率不同的四相四拍的脉冲信号，控制泵驱动步进电机22和步进电机29的启动、停止、以一定的速度正向/反向转动及转动圈数，完成细胞换液过程。高频信号发生器和高压信号发生器分别单独形成细胞电融合需要的高频交流电场和高压直流电场，系统按照预定程序向融合信号控制中的磁保持继电器和高速电子开关输出控制信号，将细胞电融合信号加载到细胞电融合室3的两个电极，完成细胞电融合。数据采集接口由A/D转换集成电路AD574、多路开关4067和不同的传感器组成，为微处理器提供系统各个部分的运行状态信息。用微处理器自带的串行通讯接口将获得的实验数据传输给飞船遥测计算机系统。
本实用新型的高频信号发生器和高压信号发生器分别产生过零高频交流排列信号和非过零高压直流脉冲融合信号，它由完全相互独立的电路产生，控制灵活。其中，信号加载时间、信号输出时刻、脉冲宽度、脉冲间隔和脉冲个数可以通过程序设置任意调控，以适应不同种类细胞电融合需要的最佳电信号参数，适用范围更加广泛。
本实用新型的空间细胞电融合培养系统已成功地装载在神舟四号飞船返回舱内，进行了空间细胞电融合实验，并达到了生物学家预期的效果。
权利要求1.一种空间细胞电融合培养系统，包括储液机构、换液机构、细胞电融合室和控制系统工作的控制机构组成，其特征在于储液机构(1)有二套，每套储液机构包括三个带独立液体进出口的腔体，它们是培养液室(13)、融合液室(12)和废液室(11)；每个腔体内分别有一个用来装载培养液、融合液和液体置换后产生的废液的硅橡胶翻转囊(131、121、111)；换液机构(2)包括两组结构独立的换液泵(21)和驱动两组换液泵同步联动的泵驱动电机(22)，控制二组液体管路(213)通、断的液路切换开关和驱动两组开关同步联动的开关驱动电机(29)；电融合室(3)有二个，每个电融合室是一箱体，箱体内有一带有小孔的分隔板(310)将箱体分为前、后二个室，前室内置有二电极(31、32)构成的横截面为同心圆的电融合腔(33)，前室底部有一箱体底盖(39)，电融合信号接口(37)固定在底盖上，并通过导线与电极(31、32)连接；后室内有硅橡胶缓冲囊(35)和细胞滤膜(36)构成的融合液缓冲腔(34)；液体管路(213)有二组，分别将储液机构(1)、换液机构(2)和电融合室(3)连接；整个系统置在箱体(4)内，箱体内底部置有带温度传感器(5)的半导体制冷器(6)；控制机构包括微处理器和软件程序存储器，与微处理器相连的驱动换液泵电机的驱动电路，驱动管路开关电机的驱动电路，细胞电融合所需的高频信号发生器和高压信号发生器。
2.根据权利要求1的一种空间细胞电融合培养系统，其特征在于所说的废液室(11)采用顶部敞开、底部封闭的结构，其中的硅橡胶囊(111)采用正装，并与环形盖体112之间形成密封。融合液室12和培养液室13采用底部有盖、顶部敞开的结构，其中的硅橡胶囊121、131都采用倒装，并与盖体122和盖体132之间形成密封。
专利摘要本实用新型公开了一种空间细胞电融合培养系统，包括储液机构、换液机构、细胞电融合室及分别将储液机构、换液机构和电融合室连接的液体管路，形成二套结构独立的，可分别进行二种细胞电融合和培养的细胞电融合培养系统和控制系统工作的控制机构。本实用新型的优点是该系统可以在空间环境下，同步分别进行动物细胞和植物细胞生存环境液体的自动更换，为生物细胞样品提供了无菌的生存环境条件保障，可以保证细胞样品的生物活性。本实用新型的空间细胞电融合培养系统已成功地装载在神舟四号飞船返回舱内，进行了空间细胞电融合实验，并达到了生物学家预期的效果。
文档编号C12M3/00GK2633892SQ0321038
公开日2004年8月18日 申请日期2003年9月5日 优先权日2003年9月5日
发明者张涛, 杨旭东, 刘学明, 孙榕仁 申请人:中国科学院上海技术物理研究所