专利名称：从有机物废料生产可生物降解的热塑性材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及从多种有机物废料中生产可生物降解的热塑性材料的系统和处理方法。
背景技术：
多羟基烷羧酸盐(PHAs)是由许多原核生物在营养(如氮或磷)限定情况下作为细胞内的碳和能量储备原料，积累的聚酯。PHA聚合体表现出的热塑性或弹性依赖于它们的特别的成分。这些材料引起人们的兴趣是因为它们具有潜在的用途，可作为来自于石油的合成塑料，例如聚丙烯和聚乙烯的可生物降解的代用物。人们已努力尝试通过对葡萄糖和有机酸进行微生物发酵的方法生产PHAs。从有机物废料生产可生物降解的热塑性材料极为有利于环境保护和可持续发展。
在自然状态下有机物废料通常是复合物，不能直接被生产的PHA微生物(例如Ralstonia eutropha，一种典型的PHA合成菌)利用。水解和产酸是将废弃物转换为短链脂肪酸，如乙酸、丙酸和丁酸的第一步，然后才可被产PHA菌进一步利用。目前在废弃物酸化和PHA合成步骤的连接中存在技术上的困难。实质上，产酸和产PHA细胞可以在一起混合培养，前者释放的酸可直接被后者利用。但是，对于有效的聚合物回收率来说，固体中PHA含量不够高(10％-30％重量)，因为在废弃物中有大量的不能生物降解的物质，而且还存在有非生产PHA微生物的生物体。此外，由于引起酸化的微生物的高微生物活性造成的酸浓度很高，抑制产PHA细胞的微生物活性。
一种改进的系统可以包含二种单独的生物反应器，以满足二种微生物不同的生理学和新陈代谢活动；一种是有机物废料的产酸的微生物，第二种是加富培养产PHA菌株(如R.eutropha)的微生物。引起发酵的酸最好从第一个反应器转化到第二个反应器，不引起两个反应器之间固体混合，以便高PHA含量的R.eutropha加富培养可以在第二反应器得以维持。此外，在生产PHA反应器中累积的酸和毒性也可以得到控制。
发明内容
本发明涉及一种将食品废料的厌氧分解与生产多羟基烷羧酸盐(PHAs)结合的方法和系统。
本发明通过屏障进行分子扩散，因此不需要经常进行污物清理，提供了一种可靠的和有效的操作方法。
图1是食品废料厌氧分解和PHA生产相结合的示意图；图2是食品废料在缺氧状态下的时间过程图(a四种主要的引起发酵酸的形成；b固体废物分解、pH变化和控制)；图3是用硅密集的膜形成PHA的时间过程图(a通过该密集的膜，在从酸性浆料转化的引起发酵酸中R.eutropha的生长PHA合成；b在生产PHA反应器的无机溶液中，检测到的有机酸)；图4是用渗析膜生产PHA的时间过程图(a在生产PHA反应器的无机溶液中，检测到的有机酸；b通过该渗析膜，在从酸性浆料转化的引起发酵酸中R.eutropha的生长和PHA合成)；图5是在引起发酵酸通过渗析膜转化合成的聚(羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯)的共聚物中，羟基戊酸酯(HV)单体的克分子百分数；图6是用密集的膜和渗析膜，特定的PHA合成速度和特异性细胞生长率的图；图7是在纯丁酸和乳酸二元混合物上一批R.eutropha培养物的时间过程图(a酸浓度和单位消耗率；b在混合酸中R.eutropha的生长和PHA合成)。
具体实施例方式
本发明涉及一种转换有机物废料为可生物降解的多羟基烷羧酸盐(PHAs)的方法和系统。本方法包括(a)用引起酸化的微生物种群处理有机物废料，形成易挥发的有机酸；(b)易挥发有机酸被生产PHA的微生物聚合，形成PHAs。特定的PHAs可以包含短链(3-5碳)单体或长链(6-4碳)单体。产PHA微生物种类可以是R.eutropha或P。PHA聚合物粘度平均分子量(Mv)是50-100kD。
用于转换有机物废料为可生物降解的PHAs系统包括(a)第一室，用于在无氧条件下有机物废料产酸；(b)第二室，R.eutropha、P.oleovorans或它们混合物通过用氧加富培养合成聚合物。一个屏障设备，连接第一室和第二室。所述室是专门的生物反应器。
本发明将用下列实施例进一步描述。
实施例从当地的小卖部收集食品废料，与水以1∶1(w/w)混合，成为浆料。在35℃时，在5L反应器中用3L工作容积将固体废物进行厌氧分解。通过保持食品废弃物在缺氧状态下，制备一种为食品废弃物产酸的培菌液。将培菌液(25-30％v/v)与新制备的浆料混合，开始厌氧分解。用6M NaOH将浆料pH最初调节到7.0，在pH下降到大约5.0.后，再提高到7.0。在厌氧分解和PHA生产结合之后，不需要再控制pH。
用Ralstonia eutropha ATCC 17699生产PHA。每月在每L含5g酵母抽提物、2.5g牛肉浸膏、5g胨和5g(NH4)2SO4的2.0％琼脂斜面培养基(pH7.0)上再次培养，以保存菌株。同样富有营养的无琼脂培养基也被用来进行种子培养。30℃时，在一个回转式振荡器上以200rpm转速，在含500ml培养基的2L的烧瓶中制备种子。
收获细胞团块，然后再悬浮于生产PHA的无机溶液中。
无机溶液含(每L)1.0g(NH4)2SO4，5.8g K2H PO4，3.7g KH2 PO4，0.4G MgSO4，1ml微量元素溶液，含有(每L1 M HCl中)2.78g FeSO4-7H2O，1.98g MnCl2 4H2O，2.81g CoSO4-7H2O，1.67g CaCl2-2H2O，0.17gCuCl22H2O，0.29g ZnSO4-7H2O。
PHA是培养的R.eutropha细胞在1.6L鼓泡生物反应器(BioengineeringAG，瑞士)中，用1.3L工作容积合成得到的。图1显示食品废料厌氧分解PHA生产的结合装置。反应器10(厌氧分解反应器)内生酸的浆料经由蠕动泵13在两个反应器之间循环，管状的屏障模件12浸于反应器11(鼓泡反应器)内的无机溶液中。浓度梯度越过屏障，成酸浆料中引起发酵的酸转移进入反应器11，在反应器11中作为合成PHA的唯一的碳源被利用。使用两类屏障一个浓相膜，由硅橡胶(聚硅氧烷)管制成(内径3.2mm，膜壁厚度1.6mm或3.2mm，长5m)。一个渗析管状膜(纤维素)，标称分子量(MWCO)6000-8000(平折宽度10mm，厚28μm，长0.23m)。将该PHA合成反应器经由一个水套保持在30℃，通过加入3M HCl或3M NaOH溶液，保持pH为7.5。用3vvm通气，使溶解氧浓度维持在大约20％的空气饱和度。在图1中，还用水浴14提供温度控制。
用带有两个六叶片的圆盘涡轮的2L发酵罐装置，控制处理纯丁酸和乳酸的混合物，生产PHA。大约2.5g自有营养的培养物收获的R.eutropha的细胞团块再悬浮于1.5L无机溶液中。将丁酸(大约4g/L)和乳酸(大约4g/L)混合物加入该无机溶液，作为合成PHA唯一的碳源。用1vvm通气和600rpm每分钟转数的搅动速度，使溶解氧浓度保持在上述20％空气饱和度。培养温度控制在30℃，通过加入3M HCl或3M NaOH溶液，将pH控制在7.5。通过在620nm测量光密度(OD)监视细胞生长。
按如下方式确定干细胞重量和PHA浓度以10,000g转数，离心30ml的培养肉汤10分钟，并冻干至恒重。在60℃时，用过量氯仿PHA(0.2g细胞生物量用10ml氯仿)从此冻干细胞中提取PHA24小时。通过玻璃纤维过滤器滤除残存固体，然后确定剩余生物量。在室温下完全蒸发氯仿之后，形成PHA薄膜，然后称重。此PHA含量定义为PHA在干细胞中的百分比。通过在石英玻璃毛细管柱(0.25mm×25M，Supelco，USA)中直接注入酸性含水试样(pH2-3)，用带有火焰电离检测器的气相色谱装置测定乙酸、丙酸和丁酸，用带有C18柱和紫外二极管阵列检测器的高效液相色谱装置，在210nm测定乳酸。流动相是0.2％H3PO4溶液。用Lageveen等发明的气相色谱-质谱方法进行甲醇酯化作用之后，测定出PHA的组成。
用Amylase and Lipase-PSTMkits(美国Sigma公司出品)测定食品废料浆料淀粉酶和脂肪酶的酶活性。用偶氮化合物测定蛋白酶活性。一个单位的蛋白酶活性是催化偶氮染料释放并在520nm给出0.001/min吸光率的酶的量。
根据测量粘度，给出粘度平均分子量(Mv)，测定出PHA聚合物分子大小。
图2显示食品废料在缺氧状态下批分解和酸化的时间过程。检测了四种有机酸作为主要引起发酵的产品。其中，乳酸和丁酸是两个主要的酸，在20天以后它们的浓度达到32.6g/L和27.4g/L。大约5.5g/L的乙酸和1.8g/L的丙酸在厌氧分解中积累，但是大多数时间保持相当恒定的水平。(图2a).
初始的浆料中固相含量为172g/L，在34天时，60.3％(w/w)或103.7g/L被分解。在前7天，固体物质减少很快，在此期间耗费59.5％的可分解食品废料。由于大量有机酸的积聚，pH迅速地从7.0下降到低于5.0。在前10天将pH调回到7.0三次。然后不再调节pH，因为此时pH减少或酸释放率要慢很多。成酸的浆料通过管状的屏障模件(图1中12)循环。因为酸分子通过屏障转移至聚合物生产反应器中(图1中11)被R.eutropha细胞利用，在厌氧分解反应器(图1中10)中pH得到控制。大约13.7％的可分解食品废料在最后17天被分解(图2b)。固体分解的减速不仅由于低pH水平，而且由于残存的固体变得难以分解。这表明食品废料中大部分容易分解的成分在最初就很快地消耗了。在第17天，酸浓度达到几乎恒定水平之后，通过浸于合成PHA的PHA生产反应器11中的屏障模件12，成酸的浆料得以循环.
在鼓泡反应器11中，用浓相膜和渗析膜2类屏障进行PHA的生产，同时进行食品废料的厌氧分解。图3说明当浓相膜用于从成酸的浆料中转移酸时PHA生产的时间过程。在73小时后，剩余生物量从1.9g/L增加到4.5g/L。在70小时后，PHA含量和PHA浓度分别达到60.2％和6.5g/L，(图3a)。这表示通过硅树脂浓相膜成酸的浆料转入R.eutropha细胞，用作细胞生长以及PHA积聚唯一的碳源。在不同的时间，在R.eutropha的培养肉汤中检测到乙酸、丙酸和丁酸，这有赖于每种酸通过膜的相对速率并且被R.eutropha分解的相对速率(图3b)。丁酸是引起发酵主要的酸，它在无机溶液中的浓度低于120mg/l。由于它具有透过屏障的高浓度差，所以它的传送率最快。乙酸和丙酸出现在较晚期，它们的浓度分别达到3.0mg/l和1.6mg/l。和成酸的浆料中的酸浓度相比，透过浓相膜的酸浓度差分别是27.4g/L(丁酸)、5.5g/L(乙酸)和1.8g/L(丙酸)。在PHA生产反应器中没有检测到乳酸，即使它透过膜的浓度差达到32.6g/L。
图4显示当渗析膜被用作产酸和生产PHA之间的屏障时生产PHA。在PHA生产反应器中，初期可检测到乙酸和丁酸，而乳酸和丙酸在40小时以后才能检测到。不同于图3b，除三种挥发性脂肪酸之外，乳酸也通过渗析膜转移。
此外，PHA生产反应器(图1中11)中，四种酸的浓度比在浓相膜上的浓度高的多。在60小时以后，因为PHA合成减速，酸浓度上升很快。乙酸、丙酸、丁酸和乳酸聚合物合成的液体培养基中的浓度分别达到0.42、0.16、1.40和1.51g/L(图4a)。随着大量有机酸通过渗析膜转移，在生产聚合物细胞内积累PHA。在73小时后，PHA含量和PHA浓度分别达到72.6％和16.5g/L，(图4b)。这比图3a(60.2％、6.5g/L)高许多。73小时后干细胞物质达到22.7g/L，比从浓膜得到(11.3g/L)的高2倍多。
而且获得的PHA是羟基丁酸酯(HB)和羟基戊酸酯(HV)的共聚物。在PHA中检测到从丙酸和乙酸合成的HV单位，在大部分发酵期间内，它的克分子份数约为2.8％(图5)。相反，从硅树脂浓相膜得到的PHA中，没有HV单位被检测到，即使在培养肉汤中检测到少量丙酸(1.6mg/l)(图3b)。
图6是用两类屏障对特异性细胞的生长率(μ)和特定的R.eutropha PHA合成率(UPHA)的比较。用浓相和渗析膜时，特异性细胞的生长率很相近，分别在16小时达到0.018h-1，在11小时达到0.020h-1。然而，特定的PHA合成比率相差很大。用浓膜的PHA合成缓慢增加，在70小时时，达到最大值0.047h-1。而用渗析膜PHA率快速达到高位值，在细胞中产生大量PHA累积，甚至在PHA合成的最初阶段。
在食品废料分解期间由于大量有机酸累积，pH下降，分解率受pH变化的影响，依次影响到酶对固体水解的活性。表1说明在前14天，不同的pH水平下，三种用于食品废料水解的主要的细胞外酶。很明显，酶活性有赖于pH水平，特别是水解淀粉的淀粉酶和水解脂肪的脂肪酶的活性。
表1在食品废料厌氧分解期间，不同的pH水平下的酶活性
在pH为中性时，淀粉酶和脂肪酶显示高活性；在低pH水平，蛋白酶显示高活性。这些事实表明，在pH为中性时，食品废料中的淀粉和油脂快速进行水解，在低pH水平，促进蛋白质的水解，释放氨基酸营养素。与pH恒定水平相比，pH在中性和酸性之间变化可增强食品废料分解。前14天，大多数容易分解的固体已经使用，微生物活性减少。与开始厌氧分解时酶的活性(40-80u/L)相比，即使在中性pH水平，酶的活性也变低(10-15u/L)。
酸物质从成酸的浆料转移到PHA合成培养基对于两个反应器的连接必不可少。有机酸转移速率不但受PHA合成影响，也受食品废料分解影响，因为连续除去有机酸可以控制pH。PHA生产取决于碳源供应。在一定程度上，从成酸的反应器以更快的速度转移更多的酸可以合成更多PHA。连续除去成酸的浆料中积累的酸还可以提高酶活性，例如可提高淀粉酶和脂肪酶水解食品废料的活性。
小分子的有机酸转移可解除屏障上的分子扩散，屏障结构对扩散速率起着重要的作用。表2显示四种有机酸在2种培养基(水与食品废料浆料)上通过两类屏障(浓相与渗析)的转移速率。对于浓相膜，通过使用不同厚度(3.2mm和1.6mm)的同样的膜，比较了膜厚度对于转移速率的效果。当膜厚度从3.2mm减少到1.6mm时，酸的转移速率几乎加倍。(表2中No.1和No.2)。速度与膜厚度成反比。用浓相膜和相同的浓度梯度透过膜，酸转移速率也受分子大小和酸的极性的影响。(表3中No.3)。丁酸中比较长的脂肪链使酸在浓相膜上有最高的溶解度，因此扩散速率最高，其次是丙酸和乙酸(表2中No.3)。这说明在浓相膜上，挥发性脂肪酸的转移速率受酸溶解度以及膜内部分子扩散两种作用。特殊的酸的溶解度在较大程度上决定其在浓相膜上的转移速率。因为乳酸的碳原子上连接有额外的羟基，比丙酸极性更高，它在硅树脂膜中的溶解度低的多，观察到可以忽略的物质转移。观察到了酸分子在渗析膜不同的物质转移机理。理论上，通过膜可以去掉全部小分子(MW≤MWCO)，无论它们形成离子或自由分子。与在浓相膜相比，乙酸、丙酸和丁酸通过渗析膜的渗析速度分别增加1298、448和225倍。(表2中的No.4和No.6)。而且，不能在浓相膜转移的乳酸通过渗析膜也可以快速转移。当表面与微生物细胞和浆料接触时，表面堵塞或膜表面上附着微生物是无法避免的现象，会降低物质转移速率并需要经常进行非生产性清理。比较在食品废料浆料和水溶液中有机酸的物质转移速率，表明表面堵塞对两类屏障速度的影响可以忽略。水和浆料中的酸有类似的渗析速度(浓相膜No.2和No.4，以及渗析膜No.6)表2 有机酸在2种培养基通过两种浓相膜和一种渗析膜的渗析速度
液体培养基A水溶液(PH5)，和乙酸、丙酸、丁酸和乳酸分别是5，2，25和30g/L。
B水溶液(PH5)，和乙酸、丙酸、丁酸和乳酸分别是25g/L。
C食品废料浆料(PH5)，和乙酸、丙酸、丁酸和乳酸分别是5.45，1.84，25.7和31.6g/L。
个别有机酸，包括乙酸、丙酸、丁酸和乳酸已经由R.eutropha作为碳源用于生产PHA。有机物废料的厌氧分解，通常获得引起发酵酸的混合物。而且，用于反应器连接的屏障类型决定了合成PHA的聚合物生产反应器中混合酸的组成。用浓相膜时，丁酸是主要被转移的酸，形成的PHA是均聚物(如聚(3-羟基丁酸酯)，PHB)，或共聚物(如聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)，PHBV)。用渗析膜酸大大地提高了酸物质转移率，转移的酸是乙酸、丙酸、丁酸和乳酸。由于渗析膜改善丙酸的物质移动，R.eutropha从丙酸和乙酸合成的羟基戊酸酯(HV)成为PHA中可测量的单体单元。因为羟基丁酸酯和羟基戊酸酯的共聚物比PHB具备更多合乎需要的材料性质，可以通过在产酸反应器加入更多丙酸控制共聚物的HV含量。
因为丁酸和乳酸是食品废料分解的主要的酸，它们的物质转移率比在渗析膜中乙酸的物质转移率高五到六倍，比丙酸高十五到十六倍。因而丁酸和乳酸被作为细胞生长和PHA生产的聚合物-生产反应器中出现的主要的酶作用物。单独用丁酸或乳酸培养R.eutropha表明，两个酸都是合成PHA适宜的碳源。在浓度约为10g/L时，获得最大细胞生物量和PHA含量，而且在此浓度水平未观察到较大的酸抑制现象。图7进一步显示用纯丁酸和乳酸的二元混合物分批培养的R.eutropha。丁酸和乳酸几乎同时被利用，乳酸比丁酸更快被利用。丁酸和乳酸的最大消耗率分别在12小时达到0.20h-1，在10小时达到0.23h-1(图7a)。干细胞物质和PHA含量在16小时分别达到3.98g/L和66.1％(图7b)。形成的聚合物是均聚物(PHB)。这提示丁酸和乳酸混合物是合成PHA优良的碳源，但与丙酸不同，乳酸不能被用来合成羟基戊酸酯(HV)单体，即使都具有三个碳原子。
通过使用本发明的系统和处理方法，从食品废料的厌氧分解中不断地释放出有机酸，并透过合成PHA的屏障转移。因为没有固体混合和水力冲失细胞，PHA合成加富培养可以保持生产很高PHA含量的生物资源。获得的72.6％(W/W)PHA是从有机废物的处理中得到的高聚合物含量，与纯葡萄糖发酵得到的高聚合物含量相当。对于从细胞中重获聚合物有经济效益的方法，具有高聚合物含量是展开下游加工的先决条件。因此，本发明证明有机物废料可以作为有价值的产品得以利用。
表3显示出在碳氮重量比(C/N)控制的条件下，生产的PHA聚合物的粘度平均分子量(Mv)。
表3在不同初始碳/氮比率(C/N)条件下有机酸上形成的PHA生物高聚物的粘度平均分子量(Mv)
权利要求
1.一种将有机物废料转变为包括多羟基烷羧酸盐(PHAs)在内的可生物降解的热塑性材料的方法，该方法包括(a)在第一室用引起酸化的微生物种群处理有机物废料，形成易挥发的有机酸；(b)在第二室通过多羟基烷羧酸盐(PHA)生产微生物，聚合所述易挥发有机酸，以形成PHAs，其中所述易挥发有机酸透过屏障通过分子扩散从第一室转移至第二室。
2.根据权利要求1所述的方法，其中产生PHA的微生物是R.eutropha或P.oleovorans。
3.根据权利要求1所述的方法，其中(a)发生于无氧环境，(b)发生于需氧环境。
4.根据权利要求1所述的方法，其中PHAs含3-5个碳单体。
5.根据权利要求1所述的方法，其中PHAs含6-14个碳单体。
6.根据权利要求1所述的方法，其中PHA是聚(3-羟基丁酸酯)或聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述室是生物反应器。
8.一种将有机物废料转变为包括多羟基烷羧酸盐(PHAs)在内的可生物降解的热塑性材料的系统，包括(a)一个第一室，用于有机物废料产酸；(b)一个第二室，用于通过加富培养多羟基烷羧酸盐(PHAs)生产微生物，合成聚合物，所述微生物包括R.eutropha、P.oleovorans或它们的混合物，其中引起发酵的酸通过屏障从第一室转移到第二室。
9.根据权利要求8所述的系统，其中所述屏障防止两个室的微生物细胞、微粒和水混合。
10.根据权利要求8所述的系统，其中屏障保持两个室不同的培养条件。
全文摘要
公开了一种用于转变有机废料为包括多羟基烷羧酸盐的可生物降解的热塑性材料的系统和方法，该方法包括用引起酸化的微生物种群处理有机物废料，形成促使发酵的有机酸，并通过生产PHA的微生物使有机酸聚合，以形成PHAs。所述系统包括用于有机物废料无氧产酸的第一室，用于通过对R.eutropha、P.P.oleovorans或它们的混合物进行有氧微生物加富培养合成聚合物的第二室。该装置带有屏障，可使有机酸进行转移，同时保持不同的培养条件。
文档编号C12P7/62GK1615366SQ03802258
公开日2005年5月11日 申请日期2003年1月15日 优先权日2002年1月16日
发明者俞坚 申请人:夏威夷大学