应用重组病毒分析试验评价病毒受体/共受体用途以及病毒侵入抑制剂的组合物和方法

专利名称：应用重组病毒分析试验评价病毒受体/共受体用途以及病毒侵入抑制剂的组合物和方法
在整个本专利申请中，是通过在正文中列出作者和时间来引入各种已发表的参考文献，可发现，对这些已发表文献的完全引证，按字母顺序列举在本申请的后面，紧靠权利要求的前面。在此引用的所有专利，专利申请和已发表的文献，不论前后，均被整体引入作为参考。为了更充分地描述根据本发明所述的和权利要求中的资料，技术人员已知的技术状况，这些已发表文献的公开内容在此被整体引入本申请作为参考。
背景技术：
对于抗病毒治疗，病毒的侵入是一个诱人的新颖目标，设计了大约10个阻碍病毒附着或膜融合的药物，目前正在对它们进行临床前或临床研究评价(Richman，1998；phRMA，1999；Stephenson，1999)。通过病毒粒子膜中的病毒蛋白(被膜蛋白)与细胞表面蛋白(病毒受体)的相互作用，具被膜的动物病毒附着于并侵入宿主细胞。由表面被膜蛋白介导受体的识别和结合。
发明概述因此，本发明的一个目标是提供一种快速灵敏的表型分析法，来测定病毒对病毒侵入抑制剂的敏感性。
本发明进一步的目标是提供一个反转录病毒载体系统，此系统可产生包含由多种来源获得的病毒被膜蛋白的病毒颗粒，而且提供对细胞系的鉴别法，用于鉴别可表达病毒受体，并允许病毒复制的细胞系。
本发明的另一目标是为病毒被膜提供表达载体，此载体能够接受病人来源的编码被膜基因的片段。
本发明的另一目标是提供一种生物安全的载体。此载体具有大部分HIV-1病毒基因组，但是携带有代替被膜区的萤光素酶报导基因。
本发明进一步的目标是，通过提供在HIV-1基因组的转录调节区(U3的3′拷贝)带有缺失的病毒表达载体，而提供可减少形成重组感染性HIV-1可能性的表型分析法。
本发明的另一个目标是提供一种能够鉴别和确定受体/共受体向性的分析法，此分析法可快速、准确地鉴别被向性病毒株感染的病人。
通过本发明，借助于测定是否病毒对某一化合物具有敏感性改变的方法可实现这些目标和另一些目标，此方法包括(a)使宿主细胞与此化合物接触，其中该宿主细胞包含病毒来源的核酸和一个指示基因，病毒来源核酸的活性可影响指示基因的活性，以致病毒来源核酸活性的改变将导致指示基因的活性改变，并且该化合物将直接或间接地针对此病毒来源的核酸或者它编码的蛋白质，以及(b)测定指示基因的活性，其中与化合物接触的宿主细胞中指示基因的活性相对于不存化合物时的活性差异，指示该病毒对此化合物具有敏感性改变。
一方面，本发明的第一种细胞包含编码病毒蛋白质的病毒来源的核酸以及病毒表达载体，此载体缺少编码病毒蛋白质的核酸而包含产生可检测信号的指示核酸，以致第一种细胞可产生包含由病毒来源核酸所编码的病毒蛋白质的病毒颗粒。可以在有化合物存在时使第一种细胞与第二种细胞例如宿主细胞接触，其中第二种细胞可表达病毒颗粒与之结合的细胞表面受体。在一个实施方案中，本发明提供了一种用于鉴别化合物是否抑制病毒侵入细胞的方法，此方法包括(a)从被该病毒感染的病人获得编码病毒被膜蛋白的核酸；(b)将如下二种成分共转染进入第一种细胞；(i)步骤(a)中的核酸，以及(ii)缺少编码被膜蛋白的核酸，而包含产生可检测信号的指示核酸的病毒表达载体，以致第一种细胞可产生包含被膜蛋白的病毒颗粒，此被膜蛋白是由从病人获得的核酸编码的；(c)在有化合物存在时，使步骤(b)中产生的病毒颗粒与第二种细胞接触，其中此第二种细胞表达该病毒与之结合的细胞表面受体；(d)测定由第二种细胞所产生的信号数量，以便确定此病毒颗粒的侵染性，以及(e)将步骤(d)中测定的信号数量与不存在此化合物时产生的信号数量相比较，其中，存在化合物时测定的信号数量减少，指示该化合物可抑制病毒侵入第二种细胞。
另一方面，第一种细胞包含编码病毒蛋白质的病毒来源的核酸和病毒表达载体，此载体缺少编码病毒蛋白质的核酸，以致第一种细胞可产生包含由病毒来源的核酸所编码的病毒蛋白质的病毒颗粒。可以在有化合物存在时使第一种细胞与第二种细胞例如宿主细胞接触，其中第二种细胞可表达病毒颗粒与之结合的细胞表面受体。此外，第二种细胞还包含产生可检测信号的指示核酸。在一个实施方案中，指示核酸被整合进入第二种细胞的核酸中。
在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，用于对病毒感染的病人检测能够阻止感染的抗体应答反应的形成，此方法包括(a)使宿主细胞与来自病人的抗体制备物接触，其中该宿主细胞包含来自病人的编码病毒蛋白质的核酸，以及产生可检测信号的指示核酸；(b)测定由宿主细胞产生的可检测信号的数量；以及(c)将步骤(b)中测定的信号数量与不存在抗体制备物时产生的信号数量相比较，其中，存在抗体制备物时测定的信号数量减少，指示该病人已经形成了能够阻止感染的对病毒蛋白质的抗体应答反应。
在另一实施方案中，本发明提供了一种方法，用于对病毒感染的病人检测能够阻止感染的抗体应答反应的形成，此方法包括(a)将如下二种成分转染进入第一种细胞；(i)来自病人的编码病毒蛋白质的核酸，以及(ii)缺少编码病毒蛋白质的核酸，而包含产生可检测信号的指示核酸的病毒表达载体，以致第一种细胞可产生包含病毒蛋白质的病毒颗粒，此病毒蛋白质是由从病人获得的核酸编码的；(b)使在步骤(a)中产生的病毒颗粒与来自病人的抗体制备物接触；(c)使步骤b的病毒颗粒和抗体制备物与第二种细胞接触，其中第二种细胞可表达此病毒与之结合的细胞表面受体；(d)测定由第二种细胞产生的可检测信号数量，以便确定此病毒颗粒的侵染性；以及(e)将步骤(d)中测定的信号数量与不存在抗体制备物时产生的信号数量相比较，其中，存在抗体制备物时测定的信号数量减少，指示该病人已经形成了能够阻止感染的对病毒蛋白质的抗体应答反应。
在另一实施方案中，本发明提供了一种方法，用于对病毒感染的病人体内检测能够阻止感染的抗体应答反应的形成，此方法包括(a)将如下二种成分转染进入第一种细胞；(i)来自病人的编码病毒蛋白质的核酸，以及(ii)缺少编码病毒蛋白质的核酸的病毒表达载体，以致第一种细胞可产生包含病毒蛋白质的病毒颗粒，此病毒蛋白质是由从病人获得的核酸编码的；(b)使在步骤(a)中产生的病毒颗粒与来自病人的抗体制备物接触；(c)使步骤(b)的病毒颗粒和抗体制备物与第二种细胞接触，其中第二种细胞可表达此病毒与之结合的细胞表面受体；并且第二种细胞还包含产生可检测信号的指示核酸(d)测定由第二种细胞产生的可检测信号数量，以便确定此病毒颗粒的侵染性；以及(e)将步骤(d)中测定的信号数量与不存在抗体制备物时产生的信号数量相比较，其中，存在抗体制备物时测定的信号数量减少，指示该病人已经形成了能够阻止感染的对病毒蛋白质的抗体应答反应。
在一个实施方案中，病毒蛋白质是被膜蛋白。在另一实施方案中，病毒蛋白质是衣壳蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供了一种方法，用于对病毒感染的病人检测能够阻止感染的抗体应答反应的形成，此方法包括(a)培育包含如下二种成分的第一种细胞(i)编码来自病人的病毒蛋白质的核酸，以及(ii)缺少编码病毒蛋白质的核酸，而包含产生可检测信号的指示核酸的病毒表达载体，以致第一种细胞可产生包含病毒蛋白质的病毒颗粒，此病毒蛋白质是由从病人获得的核酸编码的；(b)使在步骤(a)中产生的病毒颗粒与来自病人的抗体制备物接触；(c)使步骤(b)的病毒颗粒和抗体制备物与第二种细胞接触，其中第二种细胞可表达此病毒与之结合的细胞表面受体；(d)测定由第二种细胞产生的可检测信号数量，以便确定此病毒颗粒的侵染性；以及(e)将步骤(d)中测定的信号数量与不存在抗体制备物时产生的信号数量相比较，其中，存在抗体制备物时测定的信号数量减少，指示该病人已经形成了能够组止感染的对病毒蛋白质的抗体应答反应。在一个实施方案中，(i)中的核酸是(ii)中病毒表达载体的一部分。在另一实施方案中，(i)中的核酸被整合进入第一种细胞的基因组中。在另一实施方案中，(ii)中的病毒载体被整合进入第一种细胞的基因组中。在另一实施方案中，(i)中的核酸和(ii)中的病毒载体都被整合进入第一种细胞的基因组中。在一个实施方案中，病毒蛋白质是衣壳蛋白。在另一实施方案中，病毒蛋白质是被膜蛋白。
附图简述

图1A被膜表达载体和病毒表达载体的结构此HIV被膜表达载体(pHIVenv)被修饰以便接受来自病人血浆样品的已被扩增的被膜序列。标识符号a/b和c/d指示定位了HIV-1被膜多蛋白(gp160)5′和3′末端的限制性内切酶酶切位点。HIV表达载体(pHIVlucΔU3)编码除了被膜多蛋白以外的所有HIV蛋白。已使一部分被膜基因具有缺失，以便容纳指示基因盒，在本发明的情况下，“萤火虫荧光素酶”被用于监测在存在或不存在抗病毒药物时病毒的复制能力。已使3′U3区具有部分缺失，以便防止在被感染的细胞中从5′LTR转录。在此系统中产生的病毒被限制于单一复制循环。
图1B以细胞为基础的侵入分析通过以PHIVenv和pHIVlucΔU3共转染宿主细胞，实施药敏感性、共受体细胞和病毒中和作用测定。此宿主细胞产生被拟型的HIV颗粒，这种HIV颗粒带有来源于待测病毒或病人样品的HIV被膜序列。转染片(～48h)收集病毒颗粒、并用于感染表达HIV受体(例如CD4)和共受体(例如CXCR4，CCR5)的靶细胞。感染后(～72小时)把靶细胞裂解并测定荧光素酶活性。为了成功地感染靶宿主细胞，并产生荧光素酶活性，HIV必须完成一次复制循环。如果病毒不能够进入靶细胞，则荧光素酶活性被减弱。此系统可以被用于测定对侵入抑制剂的敏感性，测定受体和共受体向性以及病毒中和作用。
图2HIV被膜表达载体将来自病人样品的HIV被膜序列扩增，并应用限制性内切酶酶切位点(5′a/b和3′c/d)被插入进表达载体中。借助于人细胞肥大病毒(CMV)的立即早期基因启动子驱动被膜转录过程。使用猴病毒40(SV40)聚腺苷酸化信号序列(A+)使被膜RNA聚腺苷酸化。位于CMV启动子和HIV被膜序列之间的内含子被设计成能在被转染的细胞中增加被膜mRNA的含量。FL表达全长度被膜蛋白(gp120，gp41)；ΔCT表达缺少gp41的C-末端细胞质尾部结构域的被膜蛋白(gp120，gp21)；+CT表达含有预先确定的恒定性gp41细胞质尾部结构域的被膜蛋白(gp120，gp41)；gp120表达同预先确定的恒定性gp41一起来源于病人的gp120蛋白；gp41表达同来源于病人的gp41蛋白一起的预先确定的恒定性gp120。
图3A共受体向性筛选分析试验在此图中，使用了二种细胞系进行该分析试验。一种细胞系表达CD4和CCR5(上面6个方格)。另一细胞系表达CD4和CXCR4(底下6个方格)，通过用大量重组病毒原种感染细胞来实施该分析试验，这些重组病毒原种来源于用pHIVenv和pHIVlucΔU3载体转染的细胞。所显示的实施例代表不存药物(没有任何药物)时，或者存在可优先抑制R5向性病毒的药物(CCR抑制剂)，或优先抑制X4向性病毒的药物(CXCR4抑制剂)时，对被安排在96孔培养板中的96个病毒感染进行分析。通过比较在存在和不存在药物时每种细胞类型中产生的荧光素酶活性数量来确定共受体向性(对分析试验结果的说明见图3B)。
图3B确定共受体向性在此图中，是通过比较每种样品病毒感染(产生荧光素酶活性)表达CD4/CCR5的细胞(R5细胞)，或表达CD4/CXCR4的细胞(X4细胞)的能力来说明分析试验的结果，还评定了CCR5或CXCR4抑制剂特异性阻止感染(抑制荧光素酶活性)的能力。X4向性病毒(绿色方格)感染X4细胞但不感染R5细胞。对X4细胞的感染可被CXCR4抑制剂阻断，R5向性病毒(兰色方格)感染R5细胞但不感染X4细胞。对R5细胞的感染可被CCR5抑制剂阻断，双向性或X4/R5混合向性病毒(黄色方格)感染X4细胞和R5细胞。对R5细胞的感染可被CCR5抑制剂阻断，对X4细胞的感染可被CXCR4抑制剂阻断。无活力的病毒(红色方格)在X4细胞或R5细胞内部不能复制。
图4A测定对融合抑制剂的侵入抑制剂敏感性在此图中，证明了对融合抑制剂T-20的敏感性，在不存在T-20时，以及在存在T-20宽浓度范围时(X-轴，log10分度)，感染表达CD4，CCR5和CXCR4的细胞。通过将存在T-20时感染细胞中产生的荧光素酶数量与不存在T-20时产生的荧光素酶数量相比较，确定对病毒复制的百分数抑制作用(Y轴)。对R5向性，X4向性和双向性的病毒进行了测试。通过确定抑制病毒复制作用50％所需要的T-20浓度(IC50，以纵虚线所显示的)，对药物敏感性作定量测定。与具有较高IC50值的病毒相比。具有较低IC50值的病毒对T-20比较敏感。NL4-3明确鉴定的X4向性株；JRCSF明确鉴定的R5向性株；91USOO5.11R5向性分离物，从NIH AIDS研究和参照试剂单目(ARRRP)中获得；92HT593.1双向性(X4R5)分离物，从NIH ARRRP获得；92HT599.24X4向性分离物，以NIH ARRRP获得。
图4B测定带有药物性抗突变的侵入抑制剂敏感性在此图中，证明了由gp41被膜蛋白中特异性药物抗性突变引起的对融合抑制剂T-20敏感性降低。在不存在T-20时，以及存在T-20宽浓度范围时(X-轴，log10分度)，感染表达CD4，CCR5和CXCR4的细胞。通过将存在T-20时感染细胞中产生的荧光素酶数量与不存在T-20时产生的荧光素酶数量相比较，确定对病毒复制的百分数抑制作用(Y-轴)。对在gp41跨膜被膜蛋白中含有一个或二个特异性突变的等基因病毒进行了测试(图例中显红色标记的)。通过确定抑制病毒复制作用50％所需要的T-20浓度(IC50，以纵虚线所显示的)，对药物敏感性作定量测定。与具有较高IC50值的病毒相比，具有较低1C50值的病毒对T-20比较敏感。
无突变株(野生型序列)GIV单突变株GIV，DIM，SIV双突变株DIM，SIM，DTV图5A测定对CCR5抑制剂的侵入抑制剂敏感性在此图中，证明了对CCR5抑制剂(merck化合物)的敏感性。在不存在CCR5抑制剂时，以及存在CCR5抑制剂宽浓度范围时(X-轴，log10分度)，感染表达CD4和CCR5的细胞(R5细胞)。通过将存在CCR5抑制剂时感染细胞中产生的荧光素酶数量与不存在CCR5抑制剂时产生的荧光素酶数量相比较，确定对病毒复制的百分数抑制作用(Y-轴)。对R5向性，X4向性和双向性病毒进行了测试。通过确定抑制病毒复制作用50％所需要的CCR5抑制剂浓度(IC50，以纵虚线显示的)，对药物敏感性作定量测定。与具有有较高IC5有有值的病毒相比，具有较低IC50值的病毒对CCR5抑制剂比较敏感。X4向性病毒不感染R5细胞。
NL4-3明确鉴定的X4向性株；JRCSF明确鉴定的R5向性株92HT593.1双向性(X4，R5)分离物，从NIH ARRRP获得。
图5B测定对CXCR4抑制剂的侵入抑制剂敏感性在此图中，证明了对CXCR4抑制剂(AMD3100)的敏感性，在不存在CXCR4抑制剂时，以及存在CXCR4抑制剂宽浓度范围时(X-轴，log10分度)，感染表达CD4和CXCR4的细胞(X4细胞)。通过将存在CXCR4抑制剂时感染细胞中产生的荧光素酶数量与不存在CXCR4抑制剂时产生的荧光素酶数量相比较，确定对病毒复制的百分数抑制作用(Y-轴)。对R5向性，X4向性和双向性病毒进行了测试，通过确定抑制病毒复制作用50％所需要的CXCR抑制剂浓度(IC50，以纵虚线显示的)，对药物敏感性作定量测定。与具有较高IC50值的病毒相比，具有较低IC50值的病毒对CXCR4抑制剂比较敏感。R5向性病毒不感染X4细胞。
NL4-3明确鉴定的X4向性株；JRCSF明确鉴定的R5向性株92HT593.1双向性(X4，R5)分离物，从NIH ARRRP获得。
图6被膜序列扩增此图证明产生了相当于全长度被膜序列或细胞及尾部缺失的被膜序列的扩增子(amplicons)序列。电泳道数字对应于在凝胶右边紧随每个数字之后所显示的共受体向性。
图7靶细胞受体和共受体的表达显示表明借助于FACS(荧光活性细胞选择)分析法所获得结果的散步图，是使用抗CCR5或者抗CXCR4抗体(Y轴显示的)进行FACS分析试验。此细胞系表达列举在图下面的共受体，X-轴表示CD4荧光。抗CXCR4抗体与表达相应共受体CXCR4的细胞结合最强。
图8共受体拮抗剂的抑制作用以共受体拮抗剂给药之后显示出X4和R5抑制作用图9融合抑制剂肽显示一种肽的CXCR4抑制图和氨基酸序列，此肽是病毒膜和细胞之间融合作用的抑制剂。
图10对病毒侵染性的中和作用使病毒与5倍系列稀释的抗体(血浆)共温育，并用于感染U-87/CD4/CCR5/CXCR4靶细胞。应用矩阵格式以系列的病毒样品(纵行)对系列的抗体样品(横排)进行测试。中和作用值代表抑制病毒侵染性50％所需要的血浆(抗体)稀释度(IC50)。数字越大，稀释度越高，反映抗体中和作用的滴度越高。样品收集的日期以月/日/年表示。还对二个参照病毒NL4-3(X4实验室株)，JRCSF(R5初始分离物)测试了每个血浆样品的中和活性。
通过下面的详细论述并参照附图和实施例，本发明的特点将更加一目了然。如下的详述将论述实施本发明的方式和方法，这些方式和方法属于与鉴别和测定病毒侵入抑制剂有关的表型分析法，包括对例如HIV-1和HIV-1病毒侵入抑制剂(不作为对本发明的限制)的鉴别和测定。
发明详述本发明提供了一种方法，用于确定是否病毒对某一化合物具有敏感性改变，该方法包括(a)使宿主细胞与此化合物接触，其中宿主细胞包含病毒来源的核酸和一个指示基因，病毒来源核酸的活性可影响指示基因的活性，此致病毒来源核酸活性的改变将导致指示基因的活性改变，并且该化合物将直接或间接地针对此病毒来源的核酸或者它编码的蛋白质；以及(b)测定指示基因的活性，其中与化合物接触的宿主细胞中指示基因的活性相对于不存在化合物时的活性差异，指示该病毒对此化合物具有敏感性改变。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于鉴别化合物是否抑制病毒侵入细胞的方法，此方法包括(a)从病毒感染的病人获得编码病毒被膜蛋白的核酸；(b)将如下二种成分共转染进入第一种细胞(i)步骤(a)中的核酸，和(ii)缺少编码被膜蛋白的核酸。而包含产生可检测信号的指示核酸的病毒表达载体，以致第一种细胞可产生包含被膜蛋白的病毒颗粒，此被膜蛋白是由从病人获得的核酸编码的；(c)在有化合物存在时，使步骤(b)中产生的病毒颗粒与第二种细胞接触，其中此第二种细胞可表达病毒与之结合的细胞表面受体；(d)测定由第二种细胞产生的信号数量，必须确定此病毒颗粒的侵染性；以及(e)将步骤(d)中测定的信号数量与不存在化合物时产生的信号数量相比较，其中，存在化合物时测定的信号数量减少，指示该化合物可抑制病毒侵入第二种细胞。
在另一实施方案中，本发明提供了一种用于鉴别化合物是否抑制病毒侵入细胞的方法，此方法包括(a)从病毒感染的病人获得编码病毒被膜蛋白的核酸；(b)将如下二种成分共转染进入第一种细胞(i)步骤(a)中的核酸，和(ii)缺少编码被膜蛋白的核酸的病毒表达载体，以致第一种细胞可产生包含被膜蛋白的病毒颗粒，此被膜蛋白是由从病人获得的核酸编码的；(c)在有化合物存在时，使步骤(b)中产生的病毒颗粒与第二种细胞接触，其中此第二种细胞可表达病毒与之结合的细胞表面受体；并且第二种细胞包含产生可检测信号的指示核酸；(d)测定由第二种细胞产生的信号数量，以便确定此病毒颗粒的侵染性，以及(e)将步骤(d)中测定的信号数量与不存在化合物时产生的信号数量相比较，其中，存在化合物时测定的信号数量减少，指示该化合物可抑制病毒侵入第二种细胞。
在本发明的另一实施方案中，指示核酸包含一个指示基因，在本发明的又一实施方案中，指示基因是荧光素酶基因。
在本发明的一个实施方案中，细胞表面受体是CD4。在本发明的又一实施方案中，细胞表面受体是化学因子(Chemokine)受体，在本发明的一个实施方案中，细胞表面受体是CXCR4或CCR5。
在本发明的一个实施方案中，病人是感染了HIV-1病毒，肝炎病毒(如HCV或HBV病毒)或者任何其它的病毒。在本发明的一个实施方案中，步骤(a)中的核酸包含编码gp120和gp41的DNA。在本发明的一个实施方案中，其病毒表达载体包含HIV核酸。在本发明的一个实施方案中，其病毒表达载体包含HIV gag-pol基因。在本发明的一个实施方案中，其病毒表达载体包含编码vif、vpr、tat、rev、vpu和nef的DNA、在本发明的一个实施方案中，其第一种细胞是哺乳动物细胞，在本发明的一个实施方案中，该哺乳动物细胞是人细胞。在本发明的一个实施方案中，该人细胞是人胚胎肾细胞。在本发明的一个实施方案中，该人胚胎肾细胞是293细胞。
在本发明的一个实施方案中，第二种细胞是人T细胞。在本发明的一个实施方案中，第二种细胞是人T细胞白血病细胞系。在本发明的一个实施方案中，第二种细胞是外周血单核细胞。在本发明的一个实施方案中，第二种细胞是星形神经胶质瘤细胞。在本发明的一个实施方案中，该星形神经胶质瘤细胞是U87细胞，在本发明的一个实施方案中，第二种细胞是人骨肌瘤细胞。在本发明的一个实施方案中，该人骨肌瘤细胞是HT4细胞。
在本发明的一个实施方案中，其化合物可结合于细胞表面受体。在本发明的一个实施方案中，该化合物是细胞表面受体的配体。在本发明的一个实施方案中，该化合物包括抗体。在本发明的一个实施方案中，该化合物可抑制膜融合。在本发明的一个实施方案中，该化合物是肽，模拟肽，有机分子，或合成的化合物。在本发明的一个实施方案中，该化合物可结合病毒被膜蛋白。
本发明提供了制备一种组合物的方法，包括将通过在此所述的筛选方法(用于鉴别化合物的方法)鉴别的化合物与一种运载体混合。在本发明的一个实施方案中，此运载体是盐水聚乙二醇，缓冲液，淀粉或有机溶剂。
本发明提供了一种方法，用于鉴别当病毒感染细胞时被病毒结合的细胞表面受体，此方法包括(a)获得包含如下二种成分的病毒颗粒(i)病毒核酸和(ii)产生可检测信号的指示核酸；(b)使表达细胞表面受体的细胞与来自步骤(a)的病毒颗粒接触；以及(c)测定细胞内产生的可检测信号的数量，其中，信号的产生指示此细胞所表达的细胞表面受体可被病毒结合，从而可鉴别当细胞受感染时，此细胞表面受体将被病毒结合。
本发明还提供了一种方法，用于鉴别抗体是无抑制病毒侵入细胞，此方法包括(a)从病毒感染的病人获得编码病毒被膜蛋白的核酸；(b)将如下二种成分共转染进入第一种细胞(i)步骤(a)中的核酸，和(ii)缺少编码被膜蛋白的核酸，而包含产生可检测信号的指示核酸的病毒表达载体，以致第一种细胞可产生包含被膜蛋白的病毒颗粒，此被膜蛋白是由从病人获得的核酸所编码的；(c)在有抗体存在时，使步骤(b)中产生的病毒颗粒与第二种细胞接触，其中第二种细胞可表达病毒与之结合的细胞表面受体；(d)测定由第二种细胞产生的信号数量，以便确定病毒颗粒的侵染性，以及(e)将步骤(d)中测定的信号数量与不存在抗体时产生的信号数量相比较，其中，存在抗体时测定的信号数量减少，指示该抗体可抑制病毒侵入第二种细胞。
本发明提供了一种方法，用于测定病毒对于可抑制病毒侵入细胞的化合物的敏感性，此方法包括(a)从病毒感染的病人获得编码病毒被膜蛋白的核酸；(b)将如下二种成分共转染进入第一种细胞(i)步骤(a)中的核酸，和(ii)缺少编码被膜蛋白的核酸，而包含产生可检测信号的指示核酸的病毒表达载体，以致第一种细胞可产生包含被膜蛋白的病毒颗粒，此被膜蛋白是由从病人获得的核酸编码的；(c)在有化合物存在时，使步骤(b)中产生的病毒颗粒与第二种细胞接触，其中第二种细胞可表达病毒与之结合的细胞表面受体；(d)测定第二种细胞产生的信号数量，以便确定此病毒颗粒的侵染性，以及(e)将步骤(d)中测定的信号数量与不存在化合物时产生的信号数量相比较，其中，存在化合物时测定的信号数量减少，指示该病毒对此化合物是敏感的。
本发明还提供了一种方法，用于确定某一病毒与参照病毒相比较，是否对抑制病毒侵入细胞的化合物具有抗性增加，该方法包括(a)首先第一次确定病毒对化合物的敏感性，例如按照上述的方法；(b)后来第二次再测定病毒对此化合物的敏感性；以及(c)比较步骤(a)和(b)中测定的敏感性，其中，在后来第二次测定的敏感性降低指示病毒对此化合物增加了抗性。
本发明提供了一种方法，用于鉴别使病毒对于抑制病毒侵入细胞的化合物具有抗性的病毒突变，该方法包括(a)在用该化合物对病毒作任何处理之前测定病毒的核酸序列或氨基酸序列；(b)获得对此化合物具有抗性的病毒；(c)对来自步骤(b)的抗性病毒测定其核酸序列或氨基酸序列；以及(d)对步骤(a)和(c)的核酸序列或氨基酸序列分别进行比较，以便鉴别使病毒对此化合物具有抗性的病毒突变。
在本发明的一个实施方案中，步骤(b)中获得的病毒，是在有化合物存在时培养步骤(a)的病毒直致使其产生抗性。
在本发明的一个实施方案中，步骤(b)中获得的病毒，是从已经经受用此化合物治疗的病人中分离出的。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种方式和方法，用于准确并可重复地测定HIV-1对病毒侵入抑制剂的敏感性。在另一优选的实施方案中，本发明还提供了一种方式和方法，用于准确并可重复地测定HIV-1的共受体向性。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种方式和方法，用于准确并可重复地测定对HIV-1的抗体介导的中和作用。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种方式和方法，用于发现和最优化针对病毒附着和侵入过程中已明确和尚未明确的不同步骤的，新颖或新型药物，并鉴定其特征。
在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于发现和最优化针对病毒附着和侵入过程中已明确和尚未明确的不同步骤的HIV-1疫苗(用于预防或者治疗的)，并鉴定其特征。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种方式和方法，用于鉴别HIV-1被膜蛋白中(gp41TM和gp120SU)改变对病毒侵入抑制剂敏感性的氨基酸取代/突变。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种方式和方法，用于定量测定HIV-1被膜中存在的特异性突变对病毒侵入抑制剂敏感性的影响。
在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于确定以单独或者组合形式常见于病毒中的HIV-1被膜氨基酸取代/突变，这种病毒表现为对病毒侵入抑制剂的敏感性改变。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种方式和方法，用于鉴别将改变受体或共受体向性的HIV-1被膜蛋白中(gp41TM和gp120SU)氨基酸取代/突变。
在优选实施方案中，本发明提供了一种方式和方法，用于定量测定HIV-1被膜中存在的特异性突变对受体或共受体向性的影响。
在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于鉴别以单独或者组合形式常见于病毒中的HIV-1被膜氨基酸取代/突变，这种病毒表现为CXCR4或CCR5共受体向性。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种方式和方法，用于鉴别将改变抗体介导的中和作用的HIV-1被膜蛋白中(gp41TM和gp120SU)氨基酸取代/突变。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种方式和方法，用于定量测定HIV-1被膜中存在的特异性突变对抗体介导的中和作用的影响。在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于鉴别以单独或者组合形式常见于病毒中的HVI-1被膜氨基酸取代/突变，这种病毒表现为抗体介导的病毒中和作用。
在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于鉴别病人样品病毒中常见的抗体，这种抗体能够中和HIV-1。在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于鉴别其感染需要一个CD4结合的病毒。
在优选的实施方案中，本发明进步提供了一种方式和方法，用于鉴别其感染不需要与CD4结合的病毒。
在优选的实施方案中，本发明还提供了一种方式和方法，用于鉴别表现出与CD4无关感染的病人样品病毒的致病率。
在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于鉴别其感染需要与CD8结合的病毒。
在优选的实施方案中，本发明还提供了一种方式和方法，用于鉴别表现出与CD8相关感染的病人病毒的致病率。
在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于鉴别其感染需要与CXCD4化学激活受体结合，或者与CCR5化学激活受体结合，或者与CXCR4或CCR5结合(双重向性)的病毒。
在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于鉴别其感染需要与CXCR4化学激活受体结合，或者与CCR5化学激活受体结合，或者与CXCR4或CCR5结合(双重向性)的病毒的致病率。
在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于鉴别以单独或者组合形式常见于病毒中的HIV-1被膜氨基酸取代/突变，这种病毒表现为(a)对病毒侵入抑制剂敏感性的改变，(b)CXCR4或CCR5共受体向性，以及(c)抗体介导的病毒中和作用。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种方式和方法，用于利用对病毒侵入抑制剂的敏感性来指导对HIV-1的治疗。
在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于利用对病毒侵入抑制剂的敏感性，来指导反转录病毒药物治疗失败的病人进行治疗。
在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于利用对病毒侵入抑制剂的敏感性，来指导新近感染HIV-1的病人进行治疗。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种方式和方法，用于利用HIV-1的共受体向性来指导对HIV-1的治疗，或者指导反转录病毒药物治疗失败的病人进行治疗。
在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于利用HIV-1的共受体向性来指导新近感染HIV-1的病人进行治疗。
在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于测定对HIV-1的抗体介导的中和作用，以便监测疫苗接种后初始的预防性抗体应答反应。
在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于测定对HIV-1的抗体介导的中和作用，以便监测疫苗接种后初始的治疗性抗体应答反应。
在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于测定整个时间对HIV-1的抗体介导的中和作用，以便监测疫苗接种后预防性抗体应答反应的持续时间。
在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种方式和方法，用于测定对HIV-1的抗体介导的中和作用，以便确立和最优化疫苗接种的基础-加强免疫方案，使疫苗接种的效力最强，持续时间最长。
例如，在HIV-的情况下，SU蛋白(gp120-SU)与跨越膜的被膜蛋白(gp41-TM)密切相关，此被膜蛋白将该复合物固定于病毒膜。通过断开被膜基因的未断裂前体产物gp160，可得到被膜蛋白gp120和gp41。HIV-1对其细胞受体(CD4)和共受体(CCR5或CXCR4)的结合，将促进TM蛋白发生构象改变，而导致病毒与细胞膜融合，并使病毒核心进入细胞质中(反转录病毒，1997)。虽然新型HIV-侵入抑制剂都是针对病毒被膜蛋白(gp120/gp41)或者宿主细胞蛋白(CD4，CCR5，CXCR4)，但是正如所预料的，HIV-1中大多数与抗性相关的突变都被定位于病毒被膜基因，例如，很可能病毒发展的一种途径是转换对共受体的利用。侵入阻断剂构成了一类新颖的抗反转录病毒药物，并且具有较高的对抗目前多药物抗性HIV-1变异体的广泛活性潜力。这类潜在的病毒侵入阻断剂中，包括融合抑制剂，受体/共受体拮抗剂和疫苗。
尽管如此，病毒侵入抑制剂也很可能产生药物抗性病毒(通过被膜基因突变)，这样，使对病人的治疗变得复杂化了，类似于用蛋白酶抑制剂(PR1)和反转录酶抑制剂(RT1)治疗HIV所见到的情况。实际上FDA在审批任何阻断病毒侵入的新药时将要求有抗性评价资料。在融合抑制剂T-20的情况下已经证明有必要进行测定对侵入阻断剂敏感性的诊断分析。已有报导表明，在有药物存在时使病毒通过体内之后，表现出对T-20敏感性降低。在此时还不能方便地进行能够测定对病毒侵入阻断药物敏感性的表型分析。因而，医生将很快面临挑战要在没有为寻求药物敏感性所必需的工具存在的情况下，设计合适的治疗方案。因此，对于被感染的病人，可准确地测定对抑制病毒侵入的药物敏感性的可靠分析法将是极端有价值的。
例如，最近世界卫生组织的评估指出，全世界有三千三百万以上的人感染了HIV-1这种流行性AIDS(艾滋病)的致病因素。在美国有将近一百万人感染，目前有三十万人在接受抗病毒治疗(CDC，1999，WHO，1999)。抗击AIDS已成为政府机构，院校研究室和制药/生物技术产业共同的空前努力目标。FDA已经批准了14个抗病毒药物用于治疗HIV-1感染(Carpenter等，2000)，并且另有20个以上药物目前正在进行临床试验评价(PHRMA，1999)。这些被批准的药物可通过干扰蛋白酶(PR)或者反转录酶(RT)的酶促活性而抑制HIV-1的复制。PR抑制剂(PRIs)阻断病毒适当地形成病毒感染和复制所必需的病毒蛋白质，而RT抑制剂(RTIs)阻断病毒拷贝其遗传物质。由于尚未达到最佳效果，为了阻止病毒复制，目前最通常的方式是组合使用PRIs和RTIs(Carpenter等2000)。
因此，所希望的是提供一种能够进行如下评估测定的快速、准确和安全的病毒分析法测定病毒附着和侵入抑制剂(包括配合抑制剂，受体和共受体抑制剂)的活性；测定受体/共受体病毒向性，以便促进病毒侵入抑制剂的药物设计和治疗；测定病人的病毒对附着和侵入抑制剂的药物敏感性改变；以及测定在应答使用被膜蛋白抗原作免疫接种所产生的中和病毒的活性。
本发明的方法可以被用于其病毒对病毒侵入抑制剂敏感的任何一种病毒疾病，并且其中对病毒侵入抑制剂的抗病毒药物敏感性和抗性与如下病毒有关，例如包括但不限于lentiviruses(例如HIV-2)，其它反转录病毒(例如HLV-1和HTLV-2)，hepednavimses(例如人乙型肝炎病毒)，flaviviruses(黄病毒)(例如人丙型肝炎病毒)以及疱疹病毒(例如人细胞肥大病毒)。
侵入阻断剂构成了一类新颖的抗反转录病毒药物，并且具有较高的对抗目前多药物抗性HIV-1变异体的广泛活性潜力。这类潜在的病毒侵入阻断剂中，包括融合抑制剂，受体/共受体拮抗剂和疫苗。
融合抑制剂被设计成竞争性抑制TM构象改变的化合物称为融合抑制剂，是HIV-1复制的有效抑制剂，虽然在细胞培养系统和HIV-1感染的病人中都已证明了它们的活性(Wild等1992；Judice等1997；Kilby等1998)，但是在美国迄今尚没有任何融合抑制剂被批准用于HIV-1感染的治疗。这类药物中例如T-20和T-1249(Trimeris公司，美国)是进一步深入临床研究的对象。
受体/共受体拮抗剂除了在HIV-1与其受体相互作用之后发挥作用的融合抑制剂之外，还在努力开发另一类药物，这类药物是阻止HIV-1与CD4或者其二个主要共受体中的任何一个相互作用。已经在细胞培养系统和动物模型中证明了这类药剂抑制HIV-1感染的能力。几个针对被巨噬细胞向性病毒(R5)利用的gp120，CD4和CCR5共受体的，或者针对被T-细胞向性病毒(X4)利用的CXCR4共受体的导向性化合物已经被发现(Allaway等1993，Reimann等1995；Baba等1999；Bridger等1999)。
目前在美国还没有批准将任何共受体拮抗剂用于治疗HIV-1感染，这类药物中，例如PRO 542(美国Progenic公司)，5a8(美国Tanox)，TAK-779(Takeda公司，日本)，以及AMD-3100(加拿大Anormed公司)是进行临床前研究或者早期临床研究的对象。因此，提供一种能够鉴别和确定受体/共受体向性的分析法，用此分析法可快速准确地鉴别被向性病毒株(如HIV-1)感染的病人，这样将促进对病毒侵入抑制药物的设计和对病人的治疗。
疫苗还已证明，在人类抗击致病性病毒感染的战斗中，疫苗也是一种有效的对策，并且有几个防止HIV-1感染的候选幼苗正在临床开发研究中，被膜蛋白gp120和gp41是最显而易见的候选者，正在为用作HIV-1疫苗而加紧研究，并且正在临床评价中的多达11个候选疫苗都是以被膜蛋白为基础的(PhRMA，1999)。一般认为，有效的被膜疫苗可诱导产生阻止病毒感染的中和抗体(Mascola等2000)。因此，迫切需要一种灵敏的高效率分析法，能可靠地测定这种中和抗体的效力，并且不需要进行长时间的病毒培养。这种分析法将可显著地促进研究有效的AIDS疫苗，特别是考虑到末期临床试验将包括数以千计的大规模病人群体时更是如此。因为中和抗体将阻止对靶细胞的有效感染，所以被膜受体分析法将有益于用作病毒中和作用分析法。
不幸地是，大多数这些药物组合物仅在有限的时间内有效，主要是由于药物抗性病毒的出现，由于天生地缺乏对以高水平偶联的RT和RNA聚合酶II的校正功能，而易进行错误的复制，致使病毒如HIV-1容易发生突变(Coffin 1995)，这种高频率的突变促使HIV-1能够成功地逃避长时间的药物治疗，导致病毒数量反弹。对于全部14个通过审批的药物以及许多研究中的化合物的抗性相关的突变已被描述(Schinazi等1999)。因而，多药物抗性HIV-1变异体导致对感染病人的护理更加困难。为了获得长期临床治疗的效果，理想的是选择可最大限度阻止病毒复制的那些药物，并避免使用病人的病毒对其有抗性的药物(DHHs，2000)，长远的解决问题的方法可以依赖于药物抗性试验，这种试验可以指导医生选择针对病人病毒的最有效药物。对抗性试验的必要性已在来自DHHs的最新指南中被确认，它推荐在治疗HIV-1感染的病人时常规地使用抗性试验。敏感性试验也可以有助于开发针对抗性病毒的新药。最近FDA咨询委员会(1999年11月)曾建议，在开发用于HIV-1的抗病毒新药时使用抗性试验。
几种方案已被运用于评价抗病毒药的敏感性。基因型试验可分析基本核苷酸序列中的突变或者基因型，并尝试将这些突变与药物抗性相关联(Rodriguez-Rosado等1999；Schinazi等1999)。但是，基因型与表型之间的关系很复杂，而不容易解释，并且这些试验结果不能定量分析。使用基因型药物敏感性资料需要由专家进行解释(Baxtei等1999)，或者借助于计算机演绎法来解释，并且经常不能预测治疗结果(Piketty等1999)。
表型药物敏感性分析法可直接测定并定量分析病毒在存在药物时的复制能力。最初的表型试验需要长时间的病毒培养，因而是缓慢，费劳力的，并且不容易实现自动化而提高效率(Japour等1993)。从而认为这种早期的表型试验对于病人治疗运用是不合实际的。重组病毒分析法的建立(Shi和Mellors 1997；Hertogs等1998)简化了表型试验，并提高了效率。但是，这种分析法的主要缺点是4-8周的漫长试验周期。较近期已经建立了几种重组病毒分析法以及能够在单一复制循环过程中测定药物敏感性的另一些分析法(Zemnou等1998，Petropoulos等2000)，致使试验周期引人注目地减少至8-10天。抗反转录病毒活性失败的病人可以从表型分析法得到好处，这种分析法对于病人的治疗是一种诱人的工具，因为它们可提供对药物敏感性的直接和快速的测定。
本发明的分析法可以被用于由于此病毒家族内的其它病毒引起的病毒感染，以及由其它病毒家族的病毒引起的病毒感染。此外，本发明的药物敏感性试验的抗性试验还可用于筛选治疗目的尚不能治疗的病毒疾病的化合物。
病毒的结构，生命周期和遗传成分，这些在本发明的药物敏感性试验和抗性试验中可被测定的信息是本领域普通的技术人员熟知的。例如，理解反转录病毒的生命周期，以及反转录病毒解救(rescue)和侵染性所需要的病毒基因，对于实践本发明是有用的。反转录病毒感染的细胞放出包含二陪体RNA基因组的具膜病毒。这种镶嵌有被膜蛋白(此糖蛋白负责确定侵染性的宿主细胞范围)的病毒附着于被感染细胞质膜中的细胞受体。在与受体结合之后，病毒侵入细胞内，并在通过宿主细胞的细胞质时脱去外膜。在进入细胞核的途中或者在细胞核内，处于病毒核心中的反转录酶分子驱动对双链DNA前病毒的合成，通过被tRNA分子结合于病毒基因组RNA为此合成作好了准备。随后双链DNA前病毒被整合进入宿主细胞的基因组，在此它可以作为转录模板，既可用于编码病毒蛋白质的mRNA，又可用于将被包装成病毒核心颗粒的病毒粒子基因组RNA。在从被感染细胞出来的途中，核心颗粒通过细胞质移动，附着于新感染细胞质膜的内侧，并出芽，它们携带有包含病毒编码的被膜糖蛋白基因产物的膜片。这种感染-反转录，转录、翻译，病毒粒子装配和出芽的循环过程，在感染蔓延时一次又一次地重复进行。
病毒RNA以及作为其结果的前病毒DNA，可编码几种对于成功地完成病毒生命周期所必需的顺位作用成分(cis-acting elements)。病毒粒子RNA在其3′末端携带有病毒启动子。当基因组被反转录时，复制的特技将病毒启动子安置在前病毒基因组的5′末端。3′至5′反转录病毒LTR正好位于病毒外层包被部位。反转录病毒的生命周期需要有病毒编码的反式作用因子存在。病毒-RNA依赖的DNA聚合酶(pol)-反转录酶也被包含在病毒核心，并且对于病毒的生命周期是必不可少的，在其中它负责使基因组RNA转变成整合的中间体前病毒DNA。病毒附着于未感染的细胞以及病毒传播需要病毒被膜糖蛋白env。还存在通常被称为反式激活子的转录反式激活因子，它负责调整被整合的亲本前病毒的转录水平。一般情况下，复制胜任的(未缺陷的)病毒自身包含了这种因子，其中它们可编码所有的这些反式作用因子。它们的有缺陷对应部分则不被自身包含。
在DNA病毒的情况下，例如hepadvirus，了解其生命周期以及感染所需要的病毒基因，对于实践本发明是有用的。HBV侵入的过程还没有被充分地确定。HBV的复制可使用RNA中间体模板，在被感染的细胞，复制过程的第一个步骤是将不对称的松环DNA(rc-DNA)转变成共价闭环DNA(cccDNA)。发生在被感染肝细胞核中的这一过程包括完成DNA正链合成和DNA末端连接。在第二个步骤，cccDNA被宿主细胞RNA聚合酶转录，产生3.5KB RNA模板(前基因组)。在病毒核心，此前基因组与蛋白质形成络合物。第三个步骤包括通过使用病毒编码的P蛋白反转录酶拷贝前基因组RNA，来合成第一负向DNA链。此P蛋白也可用作负链DNA引物。最后，利用P蛋白DNA聚合酶活性，并用病毒RNA的寡聚体作引物，通过拷贝第一DNA链进行第二正向DNA链的合成。前基因组也转录mRNA，用于形成主要的结构核心蛋白。
设计和方法(1)构建用于病毒被膜蛋白的表达载体，此载体能够接受病人来源的编码此被膜蛋白的片段。
在一个实施方案中，构建了能够在被转染的细胞内表达HIV-1被膜蛋白的被膜表达载体。类似的表达载体已被描述，包括如在美国专利No 5,837,464和(petropoulos等2000)中描述的，为了表达兼性向性鼠白血病病毒(A-MLV)被膜蛋白构建的质粒(pAmphoEnv)。在被转染的细胞中，pAmphoEnv载体可利用人细胞肥大病毒(CMV)的立即早期基因启动子以及SV40聚腺苷酸化信号序列，产生A-MLV被膜mRNA。通过缺失A-MLV被膜基因和导入限制酶切割位点使其可以插入来自各种分离物如HIV-1的病毒被膜片段，对pAmphoEnv质粒进行修饰。在HIV-1的情况下，被膜开放读框跨度为大约2600个核苷酸，编码被膜多蛋白gp160。gp160多蛋白被细胞furin一样蛋白酶切割产生二个亚单位gp41和gp120。可以按如下方法逐步构建HIV-1被膜表达载体(a)以多克隆位点多接头替换来自被膜表达载体(pAmphoEnv)的A-MLV被膜核酸序列借助于限制酶的消化作用，可以使pAmphoEnv载体缺失A-MLV被膜核酸序列。通过连接于双螺旋寡核苷酸多接头，可以使被消化的载体重新环化，此多接头包含用于插入被膜序列的四个独特的内丰限制性酶切位点。此连接反应可以被用于转化大肠杆菌(E.Coli)，而对于包含正确多接头序列的分子克隆可分别通过限制性酶切作图和DNA测序进行鉴定和确认。将多个独特的克隆位点导入此载体可有利于HIV-1被膜序列的插入。基于它们在HIV-1被膜序列(LANL HIV-1数据库，www.lanl.gov)中频繁地出现，可以对多接头中的限制性酶切位点进行选择。这种载体可被称为pCX。通过将报导基因或指示核酸如萤火虫萤光素酶插入pCX的多克隆位点，并测定被感染的细胞中来自指示核酸或报导基因活性的信号，可以证明pCX载体的功能度。在此使用的“指示核酸”是指编码蛋白质的核酸，DNA或RNA结构，这些核酸结构可直接地或者通过某一反应产生可检测的或引人注目的信号如颜色或可测定波长的光，或者产生用作指示的特殊DNA或RNA结构，应用众多定量扩增分析法中的任何一种都可以扩增这种特殊DNA或RNA结构。
(b)将病毒被膜序列插入pCX被膜表达载体将诱变引物用于PCR扩增，可产生包含二个独特限制性位点(分别为a，b和c，d)的病毒被膜片段，此限制性位点与例如HIV-1被膜开放读框的起始如终止密码子相邻。在被膜开放读框的二端导入二个独特的限制性位点，对于在pCX载体的多克隆位点发现的任何一种酶，都可以提高克隆包藏内在限制性位点的HIV-1被膜片段的机会。
在HIV-1的情况下，在被膜基因中带有已知差异的二个被明确鉴定特征的HIV-1分子克隆NL4-3(诱导合胞体的T-细胞向性实验室株)和JR-CSF(非诱导合胞体的，巨噬细胞向性初始分离物)，可以被用作PCR扩增的模板。可以用二个限制性酶消化其2600个核苷酸的扩增产物(每个酶在片段的一端切开，例如a和c或b和d)，随后通过连接反应和转化大肠杆菌(E.Coli)被插入进pCX载体中。对含有合适被膜序列的分子克隆可以通过限制性酶切作图进行鉴定，并通过DNA测序证实。所形成的质粒pHIVenv(NL4-3)和pHIVenv(JR-CSF)可被用于在转染被的细胞中表达HIV-1被膜蛋白(图1A)。通过测定被转染的细胞中病毒被膜蛋白的合成(蛋白质印迹分析)，以及根据它们模拟被膜缺陷反转录病毒载体的能力，可以证明被膜表达载体如pHIVenv载体的功能度。已经证明使用人胚胎肾293细胞系可获得高滴的病毒原种(petropoulos等2000)，但是本发明不局限于这种细胞系。为了转染从病人得到的，编码病毒被膜蛋白的核酸，其它适合用作第一种细胞的细胞系包括5.25；HOX；U87；MT2；PM1；CEM等，这些仅作为实例，不是对本发明的限制。为了表达一个或几个共受体，最佳的细胞系将通过细胞工程构建。
(c)修饰pCX载体以便提高克隆病毒被膜序列的效力为了提高对病毒被膜片段的克隆效力，可以通过在E.coli lac启动子的控制下，将细菌杀伤基因盒(例如细胞死亡控制b基因(ccdB)或hok杀伤基因家庭成员)插入多克隆位点中(crerdes等1990；Bernard和Counturier1992；Bernard等1993)。这种被修饰的载体被称为pCXccdB。在表达laci抑制剂的细菌株如JM109，对ccdB杀伤基因的转录被抑制。这种或等价的细菌株可以被用繁殖携带在lac启动子控制下的ccdB杀伤基因的质粒。相反地，在此系统中不过度表达laciq抑制剂的细菌株如DH5a和Top10，也不能保存表达ccdB基因的质粒。由于ccdB的活性可杀死转化体。可以从n家供货商(Life Technologies或Invirogen)获得DH5a和Top 10细胞。应用这种选择性克隆手段，可在laiq细菌株繁殖亲本表达载体。用二个限制性酶消化此载体，这二个酶都能除去ccdB基因盒，并且对于HIV-1，它们在插入HIV-1被膜序列(a，b，c，d)不矛盾。在连接载体和被膜片段之后，缺乏laciiq的细菌株被转化。一旦被转化，包含细菌的质粒可以生长，此质粒中病毒被膜插入片段已取代了ccdB杀伤基因。保留了或室建了ccdB杀伤基因的包含细菌的质粒则不能存活。以这种方法，由于质粒中包含病毒被膜插入片段，被转化细菌的总数逐渐增加。而含有ccdB基因的亲本载体逐渐减少。构建pCXccdB载体对于实现本工程的第1步骤不是必不可少的，但是预期它将显著地提高克隆来源于病人样品的HIV-1被膜序列的效力，因此，可以增加保持病毒序列异质性的可能性。通过限制性酶切作用和DNA测序可以证实此pCXccdB载体的结构。
(d)将病毒被膜序列插入pCXccdB表达载体中通过产生包含病毒被膜序列和不完全消化的pCXccdB载体DNA的连接反应，可以评估pCXccdB载体的功能度。在细菌转化之后，质粒DNA可以从单一的细菌克隆中制备，并且可通过限制性消化作用分析它存在病毒被膜片段，而不存在ccdB序列。通过扩增来自总共13个可获得的HIV-1克隆的被膜区，可测试这种方法的可行性，(这些HIV-1克隆为pCRII91US005.11，pCRII-91006.10，pCRII-92US657.1，pCRII-92US711.14，pCRII-91US712.4，PcRII-92US714.1，pCRII-91HT651.11，PCRII-92BR020.4，PCRII-91HT651.1A，pCRII-92HT593.1，pCRII-92HT594.10，pCRII-92HT596.4，pCRII-92HT599.24，可通过AIDS研究试剂参考计划(ARRRP)，Rockville，Maryland，获得)。每个片段都可以被插入pCXccdB中，并且通过限制性酶切作图和/或DNA测序可以证实所形成的pHIVenv表达载体的结构。通过测定被转染细胞中HIV-1被膜蛋白的合成(蛋白质印迹分析)以及通过它们模拟被膜缺陷反转录病毒载体的能力，可以证明每个pHIVenv载体的功能度。
(2)构建包含指示核酸来代替编码被膜蛋白的生物安全性病毒表达载体为了评价病毒侵入抑制剂，按照在美国专利No 5,837,464和Petropouloe等2000中所述的用于评价抑制剂PR和RT的类似途径和方法，构建了一种生物安全性病毒载体。可以将本发明的这种病毒表达载体与被膜表达载体(上述的)一起共转染进入细胞内，产生高滴度的病毒原种。可以评价这种病毒原种对病毒侵入抑制)包括抗病毒药物和中和抗体的敏感性。在HIV-1的情况下，可以从被明确鉴定特征的HIV-1感染性分子克隆NL4-3产生病毒表达载体。控制病毒基因表达的5′末端重复序列(LTR)可以被修饰，以致在被转染的细胞中病毒基因的转录被CMV立即早期启动子驱动(Naviaux等，1996)。大部分被膜基因都可以缺失)但是重要的控制成分如rev应答成分(RRE)和辅助蛋白编码区(rev，tat)被保留。代替缺失的被膜序列，插入了指示核酸，例如在CMV启动子-增强子序列控制下的萤火虫萤光素酶报导基因盒(图1B和3)。通过测定感染细胞中萤光素酶的活性可以对病毒的感染进行监测。虽然不可能发生，但是可以想像，在反转录病毒载体与例如被转染细胞中的pHIVenv序列之间的质粒相互重组可能导致产生感染性HIV-1。在为产生生物安全性载体的努力中，可以在HIV基因组中导入几个基因改变。例如缺失大部分被膜基因而保留重要的控制序列RRE，而且还可以实现在载体3′LTR的U3区缺失转录增强子序列(图2)。在反转录病毒基因组的复制过程中，位于病毒基因组3′末端的U3区对于被感染细胞中前病毒5′LTR的U3区起模板作用。这种前病毒在其5′LTR的U3区缺少启动子成分，因此在被感染的细胞中不能产生反转录病毒RNA。这种自我失活(SIN)的策略已被成功地用于几个包括HIV-1的反转录病毒载体系统，(Hwang等1997；Miyoshi等1998)。在本发明的分析法中，不需要在感染细胞中进行病毒基因表达，因为是通过由指示核酸产生的可检测信号来测定病毒感染作用，例如由其各自的启动子驱动产生萤光素酶活性(图1B)。借助于标准的分子克隆程序可以实现缺失被膜序列和转录增强子区(U3)，通过DNA序列分析可以证实每种缺失。
通过以上述的pHIVenv载体共转染293细胞，可以证实这种载体的功能度例如对于HIV-1这种载体被称为pHIVlueΔU3。由被转染细胞中二种载体产生的病毒蛋白质有效的反式互升作用，可以导致产生病毒颗粒。可以从培养上清液中收获病毒颗粒，并通过蛋白质印迹试验进行分析。通过常规地应用p24 ELISA，定量PCR或TaqMan分析法，可以定量测定病毒的滴度。
为了实施本发明不必要产生自我失活的病毒表达载体，但是希望提高分析法的可重复性和生物安全性。
(3)鉴别适合于表达受体和共受体，并支持病毒感染的细胞系可以对以前所述的并已知支持特定病毒感染的不同哺乳动物细胞进行评价。如在此对关于HIV-1的一个实施方案所论述的，通过如下步骤可以实施此分析法(a)以pHIVenv和pHIVlueΔU3共转染第一种细胞，(b)转染之后收获病毒，(c)在存在和不存在病毒侵入抑制剂的情况下用这种病毒感染第二种细胞，以及(d)测定被感染细胞中萤光素酶的产生。
表1列举了评价HIV-1感染的这种细胞系的代表性例子，包括细胞系和共相关的受体/共受体。这些细胞系中的几个可以从公共细胞库中获得。
从被转染的293细胞培养物中收获的病毒颗粒，可以被用于感染各种不同的细胞系。在HIV-1的情况下，如上所述pHIVlueΔU3载体在被膜基因和U3启动子-增强子中含有缺失，因此，以内此载体产生的病毒颗粒感染许可的细胞系被限制于单一复制循环。此循环包括(a)病毒附着和侵入，如上所述，是由pHIVenv载体以反式产生的病毒被膜蛋白所介导的，(b)借助于RT将单链病毒RNA转变成双链DNA，以及(c)将病毒DNA整合进入宿主细胞的基因组中(前病毒形成)。通过在pHIVlueΔU3载体中缺失必需的病毒启动子-增强子序列，可以限制通过RNA聚合酶II病毒基因的活跃转录作用，正常情况下，在感染的细胞内，前病毒整合之后发生这种转录作用。但是，这种限制作用可以不干扰感染细胞内萤光素酶基因表达，因为此基因使用内在的CMV启动子，而不依赖于病毒基因表达所驱动(图1B)。感染后产生的萤光素酶活性数量可以被用作对病毒侵染性的测量。
HIV-1附着和侵入宿主细胞需要与初级受体(CD4)和几个共受体中的一个最通常是CCR5或CXCR4相互作用。可以筛选已知表达CD4，CCR5和CXCR4不同组合的细胞系。具体地说，可测定列举在表1中的细胞系，这些细胞表达(a)CD4加CCR5，(b)CD4加CXCR4，以及(c)CD4加CCR5或CXCR4。只表达CD4受体的，或者只表达CCR5或CXCR4共受体的细胞系可作为有用的对照，并可以被用于鉴定不需CD4结合的或利用共受体，而不是CCR5和CXCR4的HIV-1分离物。用于判断细胞系适合性的主要标准可以是通过萤光素酶产生所测定的侵染性(104-106相对光单位)。此外，还可以根据生长速度，稳定性命力，生和其它作为必要的参数对细胞系进行鉴定。可以选择容易保存的，并且例如感染之后可产生大量萤光素酶活性的细胞系，这种细胞还可以被不同被膜受体向性如CD4/CXCR4和CD4/CCR5病毒感染。通过公共细胞库如ARRRP还可获得另外几种支持例如HIV复制和表达HIV-1受体及共受体的被明确鉴定特征的细胞系(例如CEM-NKr-CCR5释放种类a)。
进而使用标准的程序例如通过对细胞加入聚卤化季铵盐(polybrene)修进感染(porter等1998)还可以增强细胞系。例如，对于HIV，为使用本发明，通过以HIV-1实验室株感染，并将重组病毒侵染性滴定与用感染性HIV-1得到的侵染性滴度相比较，或者通过以在此所述的病毒表达质粒直接转染细胞，并对病毒的产生评分，可以鉴别其它潜在的细胞系。通过应用定量RT-PCR分析法可以对病毒转录物的积累进行检查。以类似方式可以鉴别适合于其它病毒的细胞系。
可以优化本发明的分析法条件，使之能够自动化高效率地检测病人样品。还可以优化样品制备方法，以便有效地捕获病毒基因组RNA和被膜RNA。被优化的RT-PCR条件使之能够扩增病人来源的被膜序列，例如低病毒含量(500拷贝/ml)的HIV-1被膜序列(2600碱基对)。
(4)对本分析法实用性的证明通过如下测定获得的结果可证明本发明分析法的实用性(1)在有明确特征的抑制剂存在时测定对病毒侵入的剂量-依赖性抑制作用；以及(2)在有明确特征的HIV-1和抗体存在时测定对感染的剂量-依赖性抑制作用。
对本发明病毒侵入分析法的如下应用进行了评价(i)检测病毒附着和侵入抑制剂(包括对融合，受体和共受体的抑制剂)对HIV-1复制的抑制作用；(ii)测定对HIV-1附着和侵入抑制剂敏感性的改变；以及(iii)检测抗体的中和作用活性，此抗体是在对针对HIV-1被膜蛋白的疫苗应答反应中产生的。
在优选的实施方案中，可通过如下步骤实施本分析法(a)以pHIVenv和pHIVlueΔU3载体共转染第一种细胞，(b)在转染后大约48小时后收获病毒，(c)在存在和不存在病毒侵入抑制剂时用这种病毒感染第二种细胞，以及(d)在感染后大约48-72小时测定萤光素酶的产生。使用96孔排列方式，可以对较宽浓度范围的病毒侵入抑制剂测定对HIV-1复制的剂量-依赖性抑制作用。根据对每种抑制剂的经验，可以确定适合的浓度范围。可以以对萤光素酶活性的百分数抑制作用数据对药物浓度(log10)作曲线。可以使用计算机软件进行数据分析。抑制作用曲线被用于确定对特定药物或抗体的50％抑制浓度(IC50)(图6)。
使用如上述构建的pHIVenv载体，对来源于各种被明确鉴定的HIV-1分离物的被膜蛋白进行了鉴定。对于HIV-1，为了确定被膜共受体向性，如上所述可测定对所使用的表达CD4加CXCR4以及CD4加CCR5的细胞的感染作用。已知抑制HIV-1侵入的广泛多种化合物(表2)包括非特异性作用剂如磺酸化聚阴离子(葡聚糖硫酸酯和肝素)，都可使用本发明的分析法。化学因子(Chemokine)如Rantos和SDF-1，分别是CCR5和CXCR4化学因子受体的天然配体(见Alklatib等1996，Belul等1996)，也适合于使用本发明。进而，还使用了病毒侵入抑制剂如T20和T1249(Trimeris公司)，PRO542(Progenics)，5a8(Tanox)来评价本发明分析法的实用性。
应用标准的生命力或细胞毒性分析法(例如染料排出，MTS，ATP)可评价药物对靶细胞的毒性。
表现出对融合抑制剂T20敏感性降低的HIV-1突变株(Rimsky等1998)，以及使这种病毒能够在有药物存在时复制被膜蛋白(gp41-TM)基因图)的遗传决定簇(突变因子)已被描述。
为了证明本发明的分析法能够测定药物敏感性(即抗性)改变，(a)产生了携带这种突变型被膜基因的pHIVenv载体，(b)用这种载体和pHIVlueΔU3载体共转梁第一种细胞，(c)收获带有这种突变型被膜蛋白的病毒，以及(d)测定此病毒存在T20时的侵染性。通过将带有突变型被膜蛋白病毒的IC50与缺乏这种明确的药物抗性突变的IC50相比较，发现对T20的药物敏感性降低了。与携带缺乏药物抗性突变的被膜蛋白的病毒相比较，携带具有药物抗性突变的被膜蛋白的病毒可表现出较高的IC50值，也就是说，抑制作用需要较高的药物浓度(相当于图8中显示的数据)。按照标准的程序，应用标准的定位诱变技术，可以将药物抗性突变导入被膜表达载体(pHIVenv)(petropoulos等2000；Ziermann等2000)。
被普遍接受的观点是，对防止HIV-1感染的有效疫苗，应该诱发出以广泛交叉反应中和抗体为特征的强烈体液免疫应答。因此，按常规是检测被接种疫苗的个体血清中是否存在针对其免疫原的高滴度中和抗体。最近Mascola和Colleagues应用HIV-1/猴免疫缺损病毒(SIV)嵌合病毒恒河猴模型(SHIV)，已显示出粘膜接种之后被动转移这种中和抗体将导致病毒数量减少(Mascola等2000)。本发明的分析法可被用于快速准确地测定抗体中和病毒的活性，此抗体是在应答针对被膜抗原如HIV-1被膜抗原的的疫苗中产生的。例如，本发明的分析法可以(a)产生了表达多种已明确特征的被膜蛋白的pHIVenv载体，(b)用这种载体和pHIVlueΔU3载体共转染第一种细胞，(c)收获病毒，并以序列稀释的抗体制备物或疫苗接种后的血清温育此病毒，(d)测定这种病毒对第二种细胞的侵染性。可以如以前所述和按照文献进行数据分析和确定IC50。在HIV-1的情况下，可以选择代表不同HIV-1基因背景(例如分化体A，B，C，D，E，F)的，不同细胞和共受体向性(巨噬细胞/CCR5，T细胞/CXCR4)的，以及不同被膜蛋白(诱导合胞体和不诱导合胞的，实验室改造的或原始分离物)的病毒(表2)。有效的方式是通过使用加入大约20-100TCID50/孔病毒并必要时作些调整，从每种病毒制备出具有规定滴度的原种，以便最优化分析法的灵敏度和可重复性。根据以前证实的中和使用特性可以对抗体制备特性可以对抗体制备物进行选择，这些特性是功能性的，例如它们中和和初始分离物的能力，或者是物理性的，例如它们结合特异性和gp120或gp41抗原表位的能力(表2)按照科学文献中所述的常规性病毒中和作用分析法，对比这些明确特征的抗体制剂的活性，可以对本发明分析法的效能进行判断。使用来自HIV-1感染的广泛代表性个体种类的血清，可以确立能使分析法具有最大灵敏度，并使细胞毒性最低的血清稀释度的适当范围。细胞毒性可应用标准的活力分析法或细胞毒性分析法进行测定(例如染料排出，MTS，ATP)。
提供下面的实施例以便对本发明作进一步说明和解释，不应看作是对任何方面的限制。
实施例1测定表型药物对HIV-1侵入抑制剂的敏感性此实施例提供了一种方式和方法，用于准确并可重复地测定对HIV-1附着和侵入(此后统称为侵入)抑制剂的敏感性。根据本实施例，可以使测定对HIV-1抑制剂敏感性的方式和方法适合于其它病毒，包括但不限于其它的lentiviruses(如HIV-2)，其它的反转录病毒(如HTLV-1和2)、hepadnaviruses(人乙型肝炎病毒)，黄病毒(人丙型肝炎病毒)以及疱疹病毒(人细胞肥大病毒)。此实施例还进一步提供了一种方式和方法，用于测定对侵入抑制剂敏感性的改变(增加或降低)。
采用这种方式和方法适合于在美国专利No.5,837,464(国际专利申请号WO 97/27319)中所述的表型药物的敏感性和抗性试验的途径，进行侵入抑制剂敏感性测定，此专利在此被引入作为参考。
为了表达由病人来源的HIV被膜序列所编码的被膜多蛋白(gp160)，设计了一个载体(pHIVenv)，作为被膜表达载体的一个实例(图1)。随后借助于细胞蛋白酶切开gp160，产生表面亚单位(gp120SU)和跨膜亚单位(gp41TM)，在HIV-1病毒颗粒的表面包含这种被膜蛋白。为了表达基因组和亚基因组病毒RNA和除了膜多蛋白以外的所有HIV蛋白，设计了作为病毒表达载体实例的第二个载体(pHIVluc或pHIVlucΔU3)(图1A和1B)。
在本申请中，病人来源的片段相当于HIV-1被膜多蛋白(gp160)的编码区(～2.5KB)，并且代表(a)使用病毒RNA，借助于反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)扩增的被膜序列，此病毒RNA是从来源于被HIV感染个体的病毒中分离出的；或者代表(b)来源于HIV-1分子克隆的被膜序列，此序列包含有通过亲分子克隆(典型地是NL4-3)定位诊复所导入的特定突变。
应用标准的程序实施病毒RNA的分离(例如RNAgets总RNA分离系统，Promega Madison WI或RNAzol，Tel-试验，Friendswood，TX)。RT-PCR过程被分为二步。使用反转录病毒的反转录酶[例如Superscript II(Initrogen，生命技术公司)，Moloney鼠白血病病毒反转录酶(Roche Molecnlar Systems公司Branchburg.NT)或者禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶(Boehringer Mannheim，IndianapohI，IN)将病毒RNA拷贝成为单链cDNA。然后使用热稳定性DNA聚合酶[例如Tag(Rocle Molecwlar Systems公司，Brawchbwrg.NS)，Tth(RoeheMolacnlar Systenvs公司，Branehbarg WJ)，Primezyme(从栖热brockianms菌分离出的，Biometra，Goteingen，德国)]，或者热稳定性聚合酶的组合，如被描述用于实施“长PCR”(long PCR)(Barnes.W.M.(1994).Pruc.Natl.Acad.Sci.USA 91.2216-2220)的酶组合[例如高保真PCR延伸系统(Taq+pwo)，(Boehringer Mannheim，Indianapolis.IN)，或者Gene Amp XLPCR试剂盒(Tth tVent)，(Rocke分子系统公司，Branchbarg NJ)，Adnantage-2(CloneTech)]，将此cDNA扩增至高拷贝数。
寡-dT(寡脱氧胸苷酸)被用于将病毒RNA反转录成为单链cDNA。被膜PCR引物，正向引物Xho/pm和反向引物Mlu/Xba(表3)被用于扩增病人来源的片段。设计这些引物，以便扩增编码gp160被膜多蛋白的～2.5KB被膜基因，同时在PCR扩增产物的5′末端导入Xho I和PinAI识别位点，在PCR扩增产物的3′末端导入Mlu I和Xba I位点。
应用在美国专利No.5,837,464(国际专利申请号WO97/27319)中所述，稍加修改的限制性内切核酸酶消化，DNA连接以及细菌转化方法，将病人来源的片段(25KB被膜序列扩增产物)插入HIV-1被膜表达载体中。用XhoI或Pin AI在其5′末端，以及用Mlu I或Xba I在其3′末端，消化此～2.5KB扩增产物。用DNA连接酶将形成的消化产物连接，成为被修饰pCXAS或pCXAT表达载体如5′XhoI/Pin AI位点和3′Mlu I/Xba I位点。对pCXAS和pCXAT载体的构建已有描述(在基本专利的CPT中，我认为它是美国专利No.5,837,464(国际专利申请号WO 97/27319)的实施例6)。除了存在于pCXAS和pCXAT中的Xho I，Mlu I和Xba I限制性位点之外，被修饰为pCXAS和pCXAT载体还包含Pin AI限制性位点。通过定位诱变将Pin AI位点导入Xho I和Mlu I位点之间，以致四个位点以如下顺序定位于5′至3′末端Xho I，Pin AI，Mlu I和Xba I。在优选的实施方案中，同Pin AI和Mlu I消化此2.5KB扩增产物，并连接成为被修饰pCXAS表达载体的5′Pin AI位点和3′Mlu I位点。连接反应产物被用于转化E.Coli。在30-37□培育24-36小时之后，从E.Coli培养物中分离纯化出表达载体质粒DNA。为了确保表达载体制备物可充分地代表存在于指定病人血清中的HIV准种，将许多(＞100)无关的E.Coli转化体集中在一起，用于制备pHIVenv质粒DNA。为了表达病人病毒来源的被膜蛋白，以这种方式装配的载体被统称为pHIVenv(图1和3)。
为了转录HIV基因组RNA和亚基因组mRNA，并且表达除被膜多蛋白之外的所有蛋白质，设计了基因组HIV表达载体pHIVluc和pHIVlucΔU3(图1B)。在这些载体中，已使一部分被膜基因缺失，以便接纳功能性指示基因盒，在本方案中，“萤火虫萤光素酶”被用于监测在存在或不存在抗病毒药物时病毒复制的能力。在pHIVlucΔU3中，已使一部3′U3区缺失，以便在被感染的细胞中，阻止病毒RNA从5′LTR转录。
使用如下细胞实施对HIV-1侵入抑制剂的敏感性分析由人胚肾细胞系293组成的包装(packqging)宿主细胞(细胞培养器材，UC旧金山，SF，CA)以及由表达CD4(HT4)加CCR5，及CXCR4的人骨肌瘤(HOS)细胞系，或者表达CD4和CCR5或CD4和CXCR4的星形胶质细胞瘤(U-87)细胞系组成的靶宿主细胞。
使用pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucΔU3进行药物敏感性测定。通过以抗性试验载体DNA转染色装的(Packaging)宿主细胞(HEK293)，产生了包含被膜蛋白的拟型HIV颗粒，此被膜蛋白是由病人来源的片段编码的。在转染后(大约48小时)收集病毒颗粒，用于感染表达HIV受体(即CD4)和共受体(即CXCR4，CCR5)的靶细胞(HT4/CCR5/CSCR4，或U-87/CD4/CXCR4，或U-87/CD4/CCR5)。感染后(大约72小时)，使靶细胞裂解，测定萤光素酶活性，为了成功地感染靶宿主细胞并产生萤光素酶活性，HIV必须完成一个复制循环。在感染细胞中检测的萤光素酶活性数量被用作“侵染性”的直接测定值(图1和2)。如果由于任何一种原因(例如缺乏适当的受体或共受体，抑制性药物活性，中和抗体结合)，病毒则不能进入靶细胞，萤光素酶活性被削弱。通过将存在药物时的侵染性与不存在药物时的侵染性相比较，来测定药物敏感性。通过将“待测”病毒的敏感性与明确特征的参照病毒(野生型)的敏感性相比较，可以定量测定相对药物敏感性，此参照病毒是来源于HIV-1的一个分子克隆，例如NL4-3或HXB2。
将包装的宿主细胞接种在10cm直径的平皿内，平板后1天用pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucΔU3转染此宿主细胞。应用磷酸钙共沉淀技术实施转染。转染后从1小时到24小时，以新鲜的培养基替换含有DNA沉淀的细胞培养基。一般在转染后2天收获含有病毒颗粒的细胞培养基，并使此细胞培养基通过0.45mm的滤器过滤。在感染之前，将靶细胞在细胞培养基中作平板接种。一般在感染时(偶尔在感染前1天)将侵入抑制药物加入靶细胞。典型地是在感染后3天用steady-Glo试剂(Promega)和光度计测定靶细胞的萤光素酶活性。
在一个实施方案中，证实了对融合抑制药物(T-20，也被称为DP178，Trimeris，Research Triangle Park.NC)的敏感性(图4)。在不存在T-20时，以及存在T20宽浓度范围(X、轴、log10分度)时，感染表达CD4、CCR5和CXCR4的靶细胞(HT4/CCR5/CXCR4)。通过将存在T-20时感染细胞中产生的萤光素酶数量与不存在T-20时产生的萤光素酶数量相比较确定了对病毒复制的百分数抑制作用(y-轴)。对R5向性的(JRCSF，91US005.11)，X4向性的(NL4-3，92HT599.24)和双向性的(92HT593.1)病毒进行了测定。通过确定抑制病毒复制作用50％所需要的T-20浓度来定量测定药物敏感性(IC50，图4中纵虚线所显示的)。与具有较高IC50值的病毒相比，具有较低IC50值的病毒对T-20比例敏感。
在还有的另一实施方案中，可以对广泛的多种侵入抑制剂的敏感性进行测定。这些抑制剂包括但不限于表4(抗-HIV药物表)中列举的药物和化合物。
在第二个实施方案中，证实了对属于4-(哌啶-1-基)丁烷类化合物Dorn C.D等2001，Finke P.E.等2001；Merck，west Point.PA)的CCR5抑制剂的敏感性。在不存在CCR5抑制剂时，以及存在CCR5抑制剂宽浓度范围(X-轴，log10分度)时，感染表达CD4和CCR5(R5细胞)的靶细胞(U87/CD4/CCR5)。通过将存在CCR5抑制剂进感染细胞中产生的萤光素酶数量与不存在CCR5抑制剂时产生的萤光素酶数量相比较，确定了对病毒复制的百分数抑制作用(Y-轴)。对R5向性(JRCSF)，X4向性(NL4-3)和双向性的(92HT593.1)病毒进行了测定。通过确定抑制病毒复制作用50％所需要的CCR5抑制剂的浓度来定量测定药物敏感性(IC50，如图8中纵虚线所显示的)。与具有较高IC50值的病毒相比，具有较低IC50值的病毒对CCR5抑制剂比较敏感。X4向性病毒不感染U-87/CD4/CCR5靶细胞。
在第三个实施方案中，证实了对CXCR4抑制剂(AMD3100；AnorMED)的敏感性。在不存在CXCR4抑制剂时，以及存在CXCR4抑制剂宽浓度范围时(X-轴，log10分度)时，感染表达CD4和靶细胞(U-87/CD4/CXCR4，)。通过将存在CXCR4抑制剂时感染细胞中产生的萤光素酶数量与不存在CXCR4抑制剂时产生的萤光素酶数量相比较，确定了对病毒复制的百分抑制作用(y轴)。对R5向性的(JRCSF)，X4向性的(NL4-3)和双向性的(92HT593.1)的病毒进行了测定。通过确定抑制病毒复制作用50％所需的CXCR4抑制剂的浓度来定量测定药物敏感性(IC50，如图9中纵虚线所显示出)。与具有较高IC50值的病毒相比，具有较低IC50值的病毒对CXCR4抑制剂比较敏感。
还可以测定对CD4抑制剂(例如鼠单克隆抗体5A8，Tamox，Houston.TX)的敏感性。可在不存在CD4抑制药物时，以及存在CD4抑制药物宽浓度范围时(X-轴，log10分度)，感染表达CD4和一个或二个共受体的靶细胞(例如HT4/CCR5/CXCR4，U-87/CD4/CXCR4，或U-87/CD4/CCR5)。通过将存在CD4抑制剂时感染细胞中产生的萤光素酶数量与不存在CD4抑制剂时产生的萤光素酶数量相比较，可以确定对病毒复制的百分抑制作用(y轴)。可以对R5向性的(例如JRCSF)，X4向性的(例如NL4-3)和双向性的(例如92HT593.1)病毒进行了测定。通过确定抑制病毒复制作用50％所需的CD4抑制剂的浓度(IC50)，可以定量测定药物敏感性。与具有较高IC50值的病毒相比，具有较低IC50值的病毒对CD4抑制剂比较敏感。
实施例2发现、优化和鉴定新型和新颖的病毒侵入抑制剂在一个实施方案中，本发明的病毒侵入分析法可被用于鉴别抑制病毒侵入的新型化合物/化学物质。可以在存在大化学文库(高效率筛选的，HTS)中的某一成员时，感染表达CD4和一个或二个共受体的靶细胞(例如HT4/CCR5/CXCR4，U-87/CD4/CXCR4，或U-37/CD4/CCR5)。通过将存在特定化合物时被感染靶细胞中产生的萤光素酶数量与不存在此化合物时产生的萤光素酶数量相比较，可以确定化合物抑制病毒复制(“击中”)的能力。
在进一步的实施方案中，本发明的病毒侵入分析法可被用于优化通过HTS鉴别的导向性化合物的抗病毒活性。可以测定被化学修饰的导向性化合物的衍生物，以便发现具有病毒侵入抑制活性增强的特定衍生物。可在没有候选抑制剂存在时，以及存在候选抑制剂的宽浓度范围(X-轴log10分度)时，感染表达CD4和一个或二个共受体的靶细胞(例如HT4/CCR5/CXCR4，U-87/CD4/CXCR4，或U-87/CD4/CCR5)。通过将存在候选抑制剂时的感染细胞中产生的萤光素酶数量与不存在候选抑制剂时产生的萤光素酶数量相比较，可以确定对病毒复制的百分数抑制作用(y-轴)。通过确定抑制病毒复制作用50％所需的候选抑制剂浓度(IC50)，可定量测定药物敏感性。与具有较高IC50值的衍生物相比，具有较低IC50值的衍生化合物是比较有效的病毒侵入抑制剂(具有比较高的抗病毒活性)。
还有另一实施方案中，本发明的病毒侵入分析法可以被用于鉴定候选的新型病毒侵入抑制药物的作用机制，以及对抗可能具有不同敏感性的各种病毒的抗病毒活性。可以在没有候选的新型侵入抑制药物存在时，以及存在侵入抑制药物的宽浓度范围时(X-轴log10分度)，感染表达CD4和一个或二个共受体的靶细胞(例如HT4/CCR5/CXCR4，U-87/CD4/CXCR4，或U-87/CD4/CCR5)。通过将存在新型侵入抑制剂时感染细胞中产生的萤光素酶数量与不存在新型侵入抑制剂时产生的萤光素酶数量相比较，可以确定对病毒复制的百分数抑制作用(y轴)。R5向性(例如JRCSF)，X4向性(例如NL4-3)和双向性的(例如92HT593.1)病毒都可以被测定。通过确定抑制病毒复制作用50％所需的新型侵入抑制剂浓度(IC50)，可以定量测定药物敏感性。
为了确定此新型侵入抑制剂是否通过阻断CCR5或CSCR4共受体而起作用，以U-87/CD4/CCR5细胞对此新型抑制剂测试R5向性病毒，用U-87/CD4/CXCR4细胞对此新型抑制剂测试X4向性病毒。对R5病毒感染的抑制作用指示CCR5共受体拮抗作用，而相反地，对X4病毒感染的抑制作用指示CXCR4共受体拮抗作用，对R5和X4病毒感染的抑制作用可能指示CD4拮抗作用，或者是对膜融合的抑制作用。
为了鉴定新型抑制剂对抗某一类病毒的活性，这类病毒表现出对其它相同种类式不同种类的病毒侵入抑制剂具有抗性，或者具有敏感性降低，可以使用此新型侵入抑制药物，以本发明的病毒侵入分析法测试从药物抗性病毒名单中选取的病毒。选取的病毒可包括对CCR5抑制剂，CXCR4抑制剂，CD4抑制剂或膜融合抑制剂具有不同敏感性水平的病毒。选取的病毒还可包括具有一个或几个特异性突变的病毒，这些突变与对于一种或几种侵入抑制剂敏感性降低成具有抗性有关。
实施例3鉴别导致改变对病毒侵入抑制剂敏感性的被膜氨基酸取代/突变本实施例提供了一种方式和方法，用于鉴别HIV-1被膜中赋予对病毒侵入抑制剂敏感性降低/抗性的突变。本实施例还提供了一种方式和方法，用于定量测定特异性被膜突变赋予的对侵入抑制剂敏感性降低的程度。
以本发明的侵入分析法测定了来源于病人样品的被膜序列，或来源于病人样品的单一克隆，或通过定位诱变工程构建含有特定突变的被膜序列，以便根据明确鉴定的参照标准(例如NL4-3，HXB2)定量测定药物敏感性。
在一个实施方案中，对于演变中的病人样品(从相同病人在不同时间点收集的病毒)测定了其敏感性。例如，在治疗开始之前，在改变药物治疗之前或之后，或者在疾病进程的病毒学(RNA拷贝数)，免疫学(CD4 T-细胞)，或临床(机遇性感染)标志改变之前或之后，测定对侵入抑制剂的敏感性。
对病人HIV样品的基因型分析可以借助于任何一种广泛可利用的DNA序列法，分析代表病人样品集合体的被膜序列，或者来源于病人集合体的克隆。在本发明的一个实施方案中，应用病毒RNA纯化法，RT/PCR和二脱氧核苷酸链末端化学测序以及毛细管凝胶电泳技术(应用生物系统，Foster City，CA)，确定了病人样品的HIV序列。将病人病毒集合体或克隆的被膜序列与参照序列，其它病人的样品相比较或者如果可能与开始治疗之前从相同病人获得的样品相比较。测定此基因型的序列，此序列可能不同于参照序列或治疗前的序列，并且与侵入抑制剂敏感性改变有关。定位突变体的侵入抑制剂敏感性通过构建一种被膜表达载体(pHIVenv)，对于与适应性改变相关的基因型改变进行了检测，此表达载体在规定的，药物敏感性基因背景上(例如NL4-3参照株)包含特定的突变。突变可以被单独掺入，和/或以同其它被认为将调节侵入抑制剂敏感性的突变组合的形式被掺入。应用任何一种广泛可利用的定位诱变法，将被膜突变导入pHIVenv载体中。在本发明的另一个实施方案中，为了定位诱变使用了mega引物PCR法(Sarkar G.和Summer.S.S 1990)。应用实施例1中所述的病毒侵入分析法，对含有特异性被膜突变或突变组和PHIVenv载体进行了测定。将含有被膜突变病毒的药物敏感性与遗传确定的药物敏感性病毒的药物敏感性相比较，此敏感性病毒缺少被测试中的特异性突变。侵入抑制剂敏感性的明显改变可归因于被导入PHIVenv载体中的特异性突变。
在本发明的一个实施方案中，证明对融合抑制剂T-20的敏感性降低，是由gp41被膜蛋白中特异性药物抗性突变引起的(图7)。在不存在T-20时，以及存在T-20宽浓度范围时(X-轴，log10分度)，感染表达CD4，CCR5和CXCR4的细胞。通过将存在T-20时感染细胞产生的荧光素酶数量与不存在T-20时产生的荧光素酶数量相比较，确定了对病毒复制的百分数抑制作用(Y-轴)。测试了其gp41跨膜被膜蛋白中含有一个或二个特异性突变的等基因病毒(在图例中发红光的)Rimsky等；J.Viyol.72986-993)。通过确定抑制病毒复制作用50％所需要的T-20浓度(IC50，以纵虚线所显示的)对药物敏感性作定量测定。与具有较高IC50值的病毒相比具有较低IC50值的病毒对T-20比较敏感。
在一个实施方案中，药物抗性突变被导入被明确鉴定的X4向性(NL4-3)和R5向性(JRCSF)的病毒中。应用本发明的病毒侵入分析法测定3了T-20敏感性(图7)。通过以HIV-1 HXB2株的IC50除待测病毒的IC50，对每种病毒确定了其T-20敏感性改变倍数(FC)。在科技文献中对类似突变型病毒的T-20敏感性已有报导(Rimaky等)。在本实施方案中，与野生型病毒(GIV)相比，在gp41的GIV基元序列中(DIV，GIM，SIV)带有一个突变的病毒对T-20敏感性比较低。与GIV基元序列中带有一个突变或不带有突变的病毒相比，在GIV基元序列中(DIM，SIM，DTV)带有二个突变的病毒对T-20敏感性比较低。
在另一实施方案中，通过对敏感性和抗性病毒的被膜基因进行测序，鉴别了可能赋予对侵入抑制剂敏感性降低(或提高)的突变。将对敏感性病毒和抗性病毒推论的氨基酸序列进行比较，以便发现侯选的药物抗性突变。通过将这种突变导入药物敏感性病毒，并且以本发明的病毒侵入分析法测定此突变病毒的敏感性，此特定突变致使药物敏感性改变的能力可被证实或被否定。在此所述的实施例中，对于表现出不同的T-20敏感性的病毒将其HIV-1 gp41跨膜被膜蛋白的第一组七个重复序列(HR-1)中的一小段氨基酸序列排列成一线。最显著的氨基酸表示已知引起对T-20敏感性降低的突变。
类似的表型和基因型分析可被用于鉴别具有如下功能的被膜氨基酸序列(a)改变/影响对CCR5或CXCR4抑制剂的敏感性，(b)规定X4，R5和双向，以及(c)诱发中和抗体。
在一个实施方案中，证实了由特定的氨基酸序列/突变引起的对共受体(CCR5，CXCR4)抑制剂敏感性降低。
在另一实施方案中，证实了由特定的氨基酸序列/突变引起的对受体(CD4)抑制剂敏感性降低。
实施例4确定HIV-1的共受体和受体向性本实施例提供了用于确定HIV-1的共受体向性的方式和方法。本实施例还提供了用于确定HIV-1的受体向性的方式和方法。
在一个实施方案中，鉴别了利用CCR5共受体的病毒。在相关的实施方案中，鉴别了利用CXCR4共受体的病毒。在另一相关的实施方案中，鉴别了利用CCR5和CXCR4的病毒。在另一相关的实施方案中，鉴别了利用共受体而不是CCR5或CXCR4的病毒。
在另一实施方案中，鉴别了利用CD4受体的病毒。在相关的实施方案中，鉴别了利用CD8的病毒。在另一相关的实施方案中，鉴别了不需要CD4或CD8感染细胞的病毒。
在本实施方案中，使用了二户细胞系实施本分析法。一个细胞系表达CD4加CCR5(U87/CD4/CCR4)，在本申请中也被称为R5细胞。另一细胞系表达CD4和CXCR4(U87/CD4/CCR5)，在本申请中也被称为X4细胞。通过用重组病毒原种感染单一的细胞培物来进行本发明的病毒侵入分析法，此重组病毒原种来源于用pHIVenv和pHIVlnc或pHIVlncΔU3载体转染的细胞。pHIVenv载体包含病人病毒来源的序列，并表达HIV-1被膜蛋白(gp120SU，gp41 TM)。在本实施方案中，使用在96孔培养板中培养的R5和X4靶细胞对病毒进行测定(图3A)。一般情况下，是在感染之前1天平板接种R5和X4细胞。在下列情况下实施以每种病毒原种感染细胞。不存在药物(没有任何药)时，存在抑制浓度优先抑制R5向性病毒的药物(CCR5抑制剂，如哌啶乙烷化合物)时，以及存在抑制浓度的优先抑制X4向性病毒的药物(CXCR4抑制剂，如AMD3100)时。通过比较在存在和不存在药物时，每种细胞类型中产生的萤光素酶活性数量来确定共受体向性。在此实施方案中，是通过比较每种病毒优先感染(产生萤光素酶活性)R5细胞或X4细胞的能力，或者如果病毒是双向性则是感染X4和R5的能力，来说明此分析法的结果。还测定了CCR5或CXCR4抑制剂特异性阻断感染(抑制萤光素酶活性)的能力(图3B)。在此实施方案中，X4向性病毒感染X4细胞，但不感染R5细胞，并且对X4细胞的感染作用可被CXCR4抑制剂(AMD3100)阻断。在此实施方案中，R5向性病毒感染R5细胞，但不感染X4细胞，并且对R5细胞的感染作用可被CCR5抑制剂是(哌啶-1基丁烷化合物)阻断。在此实施方案中，双向性或X4和R5混合向性病毒感染X4细胞和R5细胞，并且对R5细胞的感染可被CCR5抑制剂阻断，对X4细胞的感染可被CXCR4抑制剂阻断。在此实施方案中，无存活力的病毒在X4细胞或者在R5细胞中都不能复制(不产生萤光素酶活性)。
在另一实施方案中，使用3个或更多的细胞系实施本分析法。-3细胞系表达CD4加CCR5(U87/CD4/CCR5)，在本申请中也被称为R5细胞。另一细胞系表达CD4和CXCR4(U87/CD4/CCR4)，在本申请中也被称为X4细胞。附加的细胞系表达CD4加其它候选的HIV-1共受体，包括但不限于BONID，BOB等，见表1。这些附加的细胞系表达其它的侯选共受体，但不表达CCR5或CXCR4。通过用重组病毒原种感染单一的细胞培养物来进行本发明的病毒侵入分析法，此重组病毒原种来源于用pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucΔU3载体的转染的细胞。pHIVenv载体含有病人病毒来源的序列，并表达HIV-1被膜蛋白(gp120SU，gp41 TM)。在此实施方案中，使用在96孔培养板中培养的细胞对病毒进行测定，对R5细胞，X4细胞，以及表达CD4加候选共受体的细胞系以每种病毒原种实施感染。通过比较每种细胞类型中产生的萤光素酶活性数量来确定共受体向性。在此实施方案中，是通过比较每种病毒优先感染(产生萤光素酶活性)R5细胞或X4细胞的能力，或者感染表达候选共受体的细胞系的能力来说明分析试验的的结果，在此实施方案中，X4向性病毒感染X4细胞但不感染R5细胞。在此实施方案中，R5向性病毒感染R5细胞但不感染X4细胞。在此实施方案中，双向性或X4和R5向性混合病毒既感染X4细胞又感染R5细胞。在此实施方案中，对表达另外候选共受体(不是CCR5或CXCR4)的细胞系的感染，归因于对另一共受体的向性。在此实施方案中，无活力的病毒在X4或R5细胞中不能复制。
在另一实施方案中，使用了四种细胞系进行分析试验，第一种细胞系表达CD4加CCR5(U87/CD4/CCR5)在本申请中也被称为R5细胞，第二种细胞系表达CD4和CXCR4(U87/CD4/CCR4)，在本申请中也被称为X4细胞。第三种细胞系表达CD8加CCR5(U87/CD8/CCR5)，在本申请也被称为CD8/R5细胞。第四种细胞系表达CD8 goCXCR4(U87/CD8/CCR4)，在本申请中也被称为CD8/X4。通过以重组病毒原种感染单一的细胞培养出来实施病毒侵入分析，此重组病毒原种是来自用pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucΔU3载体的转化的细胞。pHIVenv载体包含病人病毒来源的序列，表达HIV-1被膜蛋白(gp120SU，gp41 TM)。在此实施方案中，使用在96孔培养板中培养的细胞对病毒进行测定。用每种病毒原种对R5细胞，X4细胞，CD8/R5细胞和CD8/X4细胞实施感染。通过比较每种细胞类型中产生的萤光素酶活性数量来确定共受体向性。在此实施方案中，是通过比较每种病毒优先感染(产生萤光素酶活性)R5细胞，X4细胞，CD8/R5细胞，或CD8/X4细胞的能力来说明分析试验的的结果，在此实施方案中，CD4向性病毒感染X4细胞和/或R5细胞。在此实施方案中，CD8向性病毒感染CD8/R5细胞和/或CD8/X4细胞。在此实施方案中，双向性(CD4和CD8受体利用)病毒感染X4细胞和/或R5细胞加CD8/X4。和/或CD8/R5细胞。在此实施方案中，感染表达CD8的细胞素而不感染表达CD4的细胞系被归因于CD8受体向性。在此实施方案中，无活力的病毒在X4细胞或R5细胞中都不能复制。
在进一步的相关实施方案中，使用二种细胞系进行分析试验。第一个细胞系表达CD4加CCR5和CXCR4(HT4/CCR5/CXCR4)。第二种细胞系表达CD8加CCR5和CXCR4(HOS/CD8/CCR5/CXCR4)。通过用重组病毒原种感染单一的细胞培养物来实施病毒侵入分析试验，此重组病毒原种是来源于用pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucΔU3载体转染的细胞。pHIVenv载体包含病人病毒来源的序列，表达HIV-1被膜蛋白(gp120SU，gp41 TM)。在此实施方案中，使用在96孔培养板中培养的细胞对病毒进行测定。用每种病毒原种对HT4/CCR5/CXCR4细胞和HOS/CD8/CCR5/CXCR4细胞实施转染。通过比较每种细胞类型中产生的萤光素酶活性数量来确定共受体向性。在此实施方案中，是通过比较每种病毒优先感染(产生萤光素酶活性)HT4/CCR5/CXCR4细胞或HOS/CD8/CCR5/CXCR4细胞的能力来说明分析试验结果。在此实施方案中，CD4向性病毒感染HT4/CCR5/CXCR4细胞，但不感染HOS/CD8/CCR5/CXCR4细胞。在此实施方案中，CD8向性病毒感染HOS/CD8/CCR5/CXCR4细胞，但不感染HT4/CCR5/CXCR4细胞。在此实施方案中，双向性(CD4和CD8受体利用)病毒既感染HT4/CCR5/CXCR4细胞，又感染HOS/CD8/CCR5/CXCR细胞。在此实施方案中，感染表达CD8的细胞系但不感染表达CD4的细胞系，被归因于CD8受体的向性。在此实施方案中，无活力的病毒在X4和R5细胞中都不能复制。
在另一实施方案中，使用二种细胞系进行分析试验。第一种细胞系表达CD4加CCR5和CXCR4(HT4/CCR5/CXCR4)，第二种细胞系表达CCR5和CXCR4但不表达CD4或CD8产(HOS/CCR5/CXCR4)。通过用重组病毒原种感染第一细胞培养物来实施病毒侵入分析试验，此重组病毒原种来源于用在pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucΔU3载体转染的细胞。pHIVenv载体包含病人病毒来源的序列，表达HIV-1被膜蛋白(gp120SU，gp41 TM)。在此实施方案中，使用在96孔培养板中培养的细胞对病毒进行测定。用每种病毒原种对HT4/CCR5/CXCR4细胞和HOS/CCR5/CXCR4细胞实施感染。通过比较每种细胞类型中产生的萤光素酶活性数量来确定CD4和CD8无关性感染。在此实施方案中，是通过比较每种病毒优先感染(产生萤光素酶活性)HT4/CCR5/CXCR4细胞或HOS/CCR5/CXCR4细胞的能力来说明分析试验结果。在此实施方案中，CD4依赖性病毒感染HT4/CCR5/CXCR4细胞，但是不感染HOS/CCR5/CXCR4细胞。在此实施方案中，CD4无关的病毒感染HOS/CCR5/CXCR4细胞，又感染HT4/CCR5/CXCR4细胞。在此实施方案中，对缺乏CD4表达细胞系的感染被归因于CD4无关性感染，在此实施方案中，无活力的病毒在X4和R5细胞中都不能复制。
实施例5鉴别导致共受体和变体向性改变的HIV-1被膜氨基酸取代/突变本实施例提供了一种方式和方法，用于鉴别确定或改变共受体向性(X4对R5对双X4/R5)的HIV-1被膜氨基酸序列。此实施例还提供了一种方式和方法，用于鉴别确定除CXCR4或CCR5之外的共受体利用的HIV-1被膜氨基酸序列。本实施例还提供了一种方式和方法，用于鉴别确定变体向性(CD4对CD8)的HIV-1被膜序列。
以本发明的侵入分析法测定了来源于病人样品的被膜序列，或来源于病人样品的单一克隆，或通过定位诱变工程构建含有特定突变的被膜序列，以便如在实施例4中所述确定共受体向性。
在一个实施方案中，对于演变中的病人样品(从相同病人在不同时间点收集的病毒)测定了其共受体向性。例如，在治疗开始之前，在改变药物治疗之前或之后，或者在疾病进程的病毒学(RNA拷贝数)，免疫学(CD4 T-细胞)，或临床(机遇性感染)标志改变之前或之后，测定共受体向性。
在另一实施方案中，对于从大量不同病人收集的样品测定了其共受体向性。在进一步的实施方案中，对于从代表不同病毒和病人群的大量病人收集的样品，测定了其共受体向性。这种病人群可能包括但不限于新感染的病人，慢性感染病人，处于疾病发展的病人，以及正接受抗病毒治疗或免疫治疗的病人。这种病毒群可能包括但不限于具有不同遗传特征的病毒(分化体A，B，C，D，E，F，G)，对抗病毒药物敏感的病毒，具有对于抗病毒药物敏感性/抗性降低的病毒。对病人HIV样品的基因型分析可以借助于任何一种广泛可利用的DNA测序法，分析代表病人样品集合体的被膜序列，或者来源于病人集合体的克隆。在本发明的一个实施方案中，应用病毒RNA纯化法，RT/PCR和二脱氧核苷酸链末端化学测序，以及毛细管凝胶电泳技术(应用的生物系统，FosterCity.CA)，确定了病人样品的HIV序列。将病人病毒集合体或克隆的被膜序列与参照序列，其它病人的样品相比较，或者如果有可能与开始治疗之前从相同病人获得的样品相比较。确定此基因型的序列，此序列不同于参照序列或治疗前的序列，并且与侵入抑制敏感性改变有关。
遗传特征性病毒的共受体和受体向性通过构建被膜表达载体(pHIVenv)，对于与共受体向性相关的被膜氨基酸序列进行了测定，此表达载体在规定的基因背景上(例如NL4-3对应X4向性，JRCSF对应R5向性)包含特定的突变。突变可以被单独掺入，和/或以同其它被认为将调节共受体利用的突变组合的形式被掺入。应用任何一种广泛可利用的定位诱变法，将被膜突变导入pHIVenv载体中。在本发明的一个实施方案中，为了定位诱变使用了mega-引物PCR法(Sarkar Q，和Summer S.S.1990)。应用实施例1中所述的病毒侵入分析法，对含有特异性被膜突变或突变组的pHIVenv载体进行了测定。将含有被膜突变病毒的共受体向性与遗传确定的病毒的共受体向性相比较，此后者病毒缺少被测试中的特异性突变。通过将此突变导入明确鉴定的参照病毒，并以实施例4中所述的病毒侵入分析法测定此突变型病毒的共受体向性，此特定突变致使共受体向性改变的能力可被证实或被否定。明显的共受体向性改变被归因于导入pHIVenv载体中的特定突变。
在本发明的一个实施方案中，通过测定gp120表面被膜蛋白V3环内的氨基酸序列，鉴别了R5向性的遗传决定簇。通过比较大量X4向性病毒和R5向性病毒的氨基酸序列，对所测定的氨基酸序列进行鉴别。选择在X4与R5病毒之间的稳定差异进行测定。通过定位诱变构建了以明确鉴定的X4亲本克隆(如NL4-3，HXB2)为基础的等基因病毒，并如实施例4中所述测定其共受体向性，此X4亲本克隆在其gp120被膜蛋白的V3环中含有特异性“R5候选”突变。在不存在R5抑制剂(哌啶-1基乙烷化合物)和X4抑制剂(AMD3100)时，以及存在抑制浓度的R5和X4药物时，感染表达CD4加CCR5(如U-87/CD4/CCR5)或表达CD4加CXCR4(U-87/CD4/CCR4)的细胞。使X4向性病毒改变成R5向性病毒的氨基酸取代鉴定为R5向性的遗传决定簇。
在本发明的相关实施方案中，是通过测定gp120表面被膜蛋白V3环内的氨基酸序列，鉴别X4向性遗传决定簇。通过比较大量X4向性病毒和R5向性病毒的氨基酸序列，对所测定的氨基酸序列进行鉴别。选择X4与R5病毒之间的稳定差异进行测定。通过定位诱变构建了以明确鉴定的R5亲本克隆(如JRCSF)为基础的等基因病毒，并如实施例4中所述测定其共受体向性，此R5亲本克隆在其gp120被膜蛋白的V3环中含有特异性“X4候选”突变。在不存在R5抑制剂(哌啶-1基乙烷化合物)和X4抑制剂(AMD3100)时，以及存在抑制浓度的R5和X4药物时，感染表达CD4加CCR5(如U-87/CD4/CCR5)或表达CD4加CXCR4(U-87/CD4/CCR4)的细胞。使R5向性病毒改变成X4向性病毒的氨基酸取代鉴定为X4向性的遗传决定簇。
在本发明相关的实施方案中，是通过测定整个gp120表面膜蛋白中的氨基酸序列，鉴别X4或R5向性的遗传决定簇。
在本发明相关的实施方案中，是通过测定gp41跨膜被膜蛋白中的氨基酸序列，鉴别X4或R5向性的遗传决定簇。
在本发明相关的实施方案中，是通过测定gp120表面被膜蛋白V3环内的氨基酸序列，鉴定规定利用除CCR5和CXCR4之外的共受体的遗传决定簇。通过比较病毒的氨基酸序列对所测定的氨基酸序列进行了鉴别，这种病毒在不表达CXCR4或CCR5，但表达其它候选共受体的细胞内能够复制。选择在这些非-X4，非-R5病毒与X4和R5病毒之间，氨基酸序列的稳定差别进行测定。通过定位诱变构建了以明确鉴定的X4(如NL4-3)或R5(如JRCSF)亲本克隆为基础的等基因病毒，并且如实施例4中所述测定其共受体向性，这种X4或R5亲本克隆在其gp120被膜蛋白的V3环中含有特异性“非-X4，非-R5候选”突变。在不存在R5抑制剂(哌啶-1基乙烷化合物)和X4抑制剂(AMD3100)时，以及存在抑制浓度的R5和X4药物时，感染表达CD4加CCR5的(如U-87/CD4/CCR5)，表达CD4加CXCR4的(U-87/CD4/CCR4)和表达CD4加其它候选共受体的(U87/CD4/X)细胞。赋予对非-X4，非-R5共受体向性的氨基酸取代鉴定为对特定共受体向性的遗传决定簇。
在本发明相关的实施方案中，通过测定整个gp120表面被膜蛋白中的氨基酸序列，鉴别了对其它共受体向性的遗传决定簇。
在本发明相关的实施方案中，通过测定gp41跨膜被膜蛋白中的氨基酸序列，鉴别了对其它共受体向性的遗传决定簇。
在本发明的另一实施方案中，通过测定gp120表面被膜蛋白V3环内的氨基酸序列，鉴别了规定HIV-1利用CD8(除此之外还有CD4，或者代替CD4)作为受体的遗传决定簇。通过比较病毒的氨基酸序列对所测定的氨基酸序列进行鉴别，这种病毒在不表达CD4但表达CD8的细胞内能够复制。选择在这些CD4向性病毒与CD8向性病毒之间，氨基酸序列的稳定差异进行测定。通过定位诱变构建3以明确鉴定的CD4向性(如NL4-3，JRCSF)亲本克隆为基础的等基因病毒，并且如实施例4中所述测定其CD8受体向性，这种CD4向性亲本克隆在其gp120被膜蛋白的V3环中含有特异性“CD8候选”突变。感染表达CD4加CCR5(如U-87/CD4/CCR5)，CD4加CXCR4(U-87/CD4/CCR4)，CD8加CCR5(如U-87/CD8/CCR5)，CD8加CXCR4(U-87/CD8/CCR4)的细胞。使之能够在表达CD8但不表达CD4的细胞内复制的氨基酸取代被鉴定为CD8向性的遗传决定簇。
在本发明相关的实施方案中，通过测定整个gp120表面被膜蛋白内的氨基酸序列，鉴别了CD8向性的遗传决定簇。
在本发明相关的实施方案中，通过测定gp41跨膜被膜蛋白内的氨基酸序列，鉴别了CD8向性的遗传决定簇。
实施例6测定HIV-1抗体的中和作用本实施例提供了一种方式和方法，用于测定对HIV-1的抗体介导的中和作用，在本申请中也被称为病毒中和作用。本实施例还提供了一种方式和方法，用于测定HIV-1感染的病人体内抗体的病毒中和作用活性。本实施例还提供了一种方式和方法，用于测定以治疗性疫苗和候选疫苗接种的个人或动物体内抗体的病毒中和活性。本实施例还提供了一种方式和方法，用于测定以保护性(预防性)疫苗和候选疫苗接种的个人或动物体内抗体的病毒中和活性。
本实施例还提供了一种方式和方法，用于测定特异性单克隆或多克隆抗体的病毒中和活性，或者制备这种抗体。
为了评价抗体介导的中和作用，以本发明的侵入分析法测试了来源于病人样品的被膜序列，或来源于病人样品的单一克隆，或通过定位诱变而包含特定突变的工程构建的被膜序列。
在一个实施方案中，对演变的病人样品(从相同病人在不同时间点采集此病毒)的抗体介导的中和作用进行了评价。例如，在疫苗接种之前，在疫苗接种的过程中，以及在疫苗接种过程完成之后逐步增加的时间点检测病毒中和作用。在相关的实施方案中，在以侯选疫苗接种之前，在重复接种的过程中，以及在接种过程完成之后逐步增加的时间点，对动物的血清进行检测，所用动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、猪和牛。在一个实施方案中，对预防性疫苗和候选疫苗检测其病毒中和作用。在另一实施方案中，对治疗性疫苗检测了其病毒中和作用。
在另一实施方案中，对从大量不同的病人收集的样品检测其病毒中和作用。在进一步的实施方案中，对从大量代表不同病人群和不同病毒群的病人收集的样品检测其病毒中和作用。“病人群”可包括但不限于，新感染的病人。慢性感染病人，具有病情加深的HIV/AIDS病人。具有病情快速发展的病人，具有病情缓慢发展的病人(一般被称为长期无进展性病人)，正在接受抗病毒治疗或免疫治疗(如白介素-2或其它细胞因子)的病人，疫苗接种的和未疫苗接种的个体。“病毒群”包括但不限于，具有不同遗传特征和地区来源的病毒(分化体A、B、D、E、F、G)，对于抗病毒药物敏感性的病毒，对于抗病毒药物具有敏感性降低和抗性的病毒，初始分离物，适合于在培养的细胞中生长的分离物(通常被称为实验室适应病毒)，含胞体诱导(SI)病毒，非含胞体诱导(NSI)病毒，巨噬细胞(M)向性病毒，T-细胞(T)向性病毒和双向性(M和T)病毒。
对病人抗体的鉴定(病人抗体对标准病毒成员)在本实施方案中，使用表达HIV-1受体CD4-加HIV-1共受体CCR5和CXCR4的靶细胞系(HT4/CCR5/CXCR4)进行分析试验，这种细胞系能够既对R5向性病毒又对X4向性病毒检测抗体的中和活性。在相关的实施方案中，使用了二种靶细胞系进行分析试验，一种细胞系表达CD4加CCR5(U-87/CD4/CCR5)，被用于测试R5向性病毒。另一细胞系表达CD4加CXCR4(U-82/CD4/CXCR4)，被用于测试X4向性病毒。通过以重组病毒原种感染单一的靶细胞培养物进行病毒侵入分析试验，此病毒原种来源于用PHIVenv和PHIVlme或PHIVlmcΔU3载体转染的包装宿主细胞。在此实施方案中，PHIVenv载体包含确明鉴定的特定病毒的被膜序列，表达HIV-1被膜蛋白(gp120 SU，gp41TM)。这类病毒代表“标准的病毒成员”(见上面病毒群的叙述)，某些，但不是全部可能构成标准成员组的适当病毒的例子被列举在表4中，使用标准病毒成员是为了比较从许多不同的病人和/或动物(见上面病人群的叙述)得到的血清中和抗体活性。在本实施方案中，是使用在96孔培养板中培养的靶细胞对病毒进行测定。通常是在感染前一天平板接靶细胞。对于HT4/CCR3/CXCR4接种5000个细胞/孔，或者对于U-87/CD4/CCR5和U-87/CD4/CXCR4接种10000个细胞/孔。在感染靶细胞之前，将各种病毒原种与被检测的血清或抗体制备物予先共温育(一般是1小时)。对不稀释的和以逐步增加稀释度(通常是4-5个连续的10倍稀释)的血清或抗体制备物进行测试。也在不存在抗体(无抗体)时以各种病毒原种感染靶细胞。通过比较存在和不存在抗体时靶细胞内产生的荧光素酶活性数量来测定病毒中和作用。在本实施方案中，是通过比较各种抗体优先阻止靶细胞感染的能力(降低或消除荧光素酶活性)来说明分析试验的结果。可通过记录能够阻止靶细胞感染的最高抗体稀释度(最大稀释度)来定量病毒中和作用的活性(例如能够降低不存在抗体时所产生的荧光素酶活性50％的最高稀释度)。
对病人HIV-1的鉴定(病人病毒对标准抗体成员)本实施方案中，使用表达HIV-1受体CD4加HIV-1共受体CCR5和CXCR4的靶细胞系(HT4/CCR5/CXCR4)进行分析试验。这种细胞系能够即对R5向性病毒又对X4向性病毒检测抗体的中和活性。在相关的实施方案中，使用了二种靶细胞系进行分析试验，一种细胞系表达CD4和CCR5(U-87/CD4/CCR5)，被用于测试R5向性病毒。另一细胞系表达CD4加CXCR4(U-87/CD4/CXCR4)，被用于测试X4向性病毒。通过以重组病毒原种感染单一的靶细胞培养物进行病毒侵入分析试验，此病毒原种来源于用PHIVenv和PHIVlwe或PHIVlucΔU3载体转染的包装宿主细胞。在此实施方案中PHIVenv载体包含病人病毒来源的被膜序列，表达HIV-1被膜蛋白(gp120 SU，gp41TM)，在此实施方案中，使用了来自不同病人群(见上面病人群的叙述)的病毒，和/或来自不同的病毒群(见上面病毒群的叙述)的病毒来构建PHIVenv载体。以病毒侵入分析法测定来源于PHIVenv载体的拟型HIV，以便确定它们对明确鉴定的特异性抗体制物成员的中和作用是否敏感。这类抗体代表“标准抗体成员”。某些但不是全部可能构成标准成员的适当抗体的例子被列举在表4中。在本实施方案中，是使用在96孔培养板中培养的靶细胞对病毒中和作用进行测定。通常是在感染前一天平板接种靶细胞，对于HT4/CCR5/CXCR4接种5000个细胞/孔，或者对于U-87/CD4/CCR5和U-87/CD4/CXCR4接种10000个细胞/孔。在感染之前，将各种病人来源的病毒原种与标准抗体成员中的各种抗体制备物共同温育(通常是1小时)。对不稀释的和以不同稀释度(通常是4-5个连续的10倍稀释)的血清或抗体制备物进行测试。也在不存在抗体(无抗体)时以各种病毒原种感染靶细胞。通过比较在存在和不存在抗体时靶细胞内产生的荧光素酶活性数量来测定病毒中和作用。在本实施方案中，是通过比较各种抗体优先阻止靶细胞感染的能力(降低或消除荧光素酶活性)来说明分析试验的结果。可通过记录能够阻止靶细胞感染的最高抗体稀释度(最大稀释度)来定量病毒中和作用的活性(例如能够降低不存在抗体时所产生的荧光素酶活性50％的最高稀释度)。
对病人HIV-1的鉴定(病人病毒对病人抗体)；本实施例提供了一种方法，用于检测病人体内中和抗体应答反应的形成，以及可逃避中和应答反应的瘤病株的形成。在本实施方案中，使用表达HIV-1受体CD4加HIV-1共受体CCR5和CXCR4的靶细胞系(U87/CD4/CCR5/CXCR4或HT4/CCR5/CXCR4)进行分析试验。这种细胞系能够即对R5又对X4向性的病毒检测抗体的中和活性。在相关的实施方案中，使用了二种靶细胞系进行分析试验，一种细胞系表达CD4加CCR5(U-87/CD4/CCR5)被用于测试R5向性病毒。另一种细胞系表达CD4加CXCR4(U-87/CD4/CXCR4)，被用于测试X4向性病毒。通过以重组病毒原种感染单一的靶细胞培养物进行病毒侵入分析试验，此病毒原种来源于用PHIVenv和PHIVΔ或PHIVΔDU3载体转染的包装宿主细胞。在此实施方案中，PHIVenv载体包含病人病毒来源的被膜序列，表达HIV-1被膜蛋白(gp120SU，gp41TM)，在此实施方案中，使用了不同的病毒群来构建PHIVenv载体。此不同的病毒群来源于连续的(即演变的)血浆标本(即从相同病人在不同时间点采集的病毒)。以病毒侵入分析法测定来源于PHIVenv载体的拟型HIV，以便确定它们对来源于病人连续血浆标本的抗体成员的中和作用是否敏感。因此，在本实施方案中，相同的病人既是病毒群的来源，又是抗体的来源。在此实施方案中，是使用在例如96孔培养板中培养的靶细胞对病毒进行测定。通常对于靶细胞U-87/CD4/CCR5/CXCR4和U-87/CD4/CCR5和U-87/CD4/CXCR4细胞系以10000个细胞/孔作平板接种，或者对于HT4/CCR3/CXCR4细胞系5000个细胞/孔，作平板接种。在感染当天平板接种靶细胞。在感染靶细胞之前，将各种病毒原种与被测定的血清或抗体制备物共同预温育(一般是1小时)。对不稀释的和以逐步增加稀释度(通常是4-5个连续的10倍稀释)的血清或抗体制备物进行测试。也在不存在抗体(无抗体)时以各种病毒原种感染靶细胞。通过比较存在和不存在抗体时靶细胞产生的荧光素酶活性数量来测定病毒中和作用。在本实施方案中，是通过比较来源于病人不同时间点的抗体，优先阻止来源于病人不同时间点的拟型病毒感染靶细胞的能力(降低或消除荧光素酶活性)来说明分析试验的结果。可通过记录能够阻止靶细胞感染的最高抗体稀释度(最大稀释度)来定量病毒中和作用的活性(例如能够降低不存在抗体时所产生的荧光素酶活性50％的最高稀释度)。因此，本实施方案使研究人员能够分析病人体内不同免疫学特性的HIV株和中和抗体应答反应的随时间共同发展进程。
本方法被用于一组14个自然治疗的初期HIV感染病人。以2-4个月的间隔从每个病人抽取血浆样品，持续6-39个月的范围(平均跟踪18个月内)。将病毒与连续5倍稀释的抗体共温育，并用于感染表达CD4加CCR5和CXCR4共受体的靶细胞。发现14个病人中的12个对病毒产生了强中和抗体应答反应。来自代表性病人的数据被显示在图10中。但是，每种后续的病毒都一致并迅速地逃避了同时发生的中和抗体应答反应。峰值中和作用滴度(在1∶339-1∶4627的范围内平均1∶1497的稀释度)在病毒出现后持续发展了n个月。并且此后应答反应继续提高，持续数月至一年。与对于来自相同病人的晚期病毒相比较，对于早期病毒的中和抗体滴度一段都比较高。对于异源性R5初始病毒(JR-CSF)的中和作用应答反应弱而迟缓。对于X4实验室株(NL4-3)应答反应随时间增加，但是在不同病人中强度不同。对于自体病毒中和抗体应答反应的大小与血浆HIV RNA平均量或HIV感染的持续时间无关。因此，病毒逃避中和作用的比率是惊人的，并且表明中和抗体对于病毒晃进化可以发挥以前未被认识的选择性强制作用水平。这些数据对于自然界发史和疫苗的开发具有主要的启示。
实施例7鉴别诱发，改变或阻止中和抗体应答反应的HIV-1被膜氨基酸序列本实施例提供了一种方式和方法，用于鉴别对HIV-1感染诱发/促进或改变，或阻止抗体介导的中和作用(在本申请中也被称为病毒中和作用)的HIV-1被膜氨基酸序列。
为了如在实施例6中所述确定共受体向性，以侵入分析法测试了来源于病人样品的被膜序列，或来源于病人样品的单一克隆，或者通过定位诱变而包含特定突变的工程构建的被膜序列。
在一个实施方案中，对演变的病人样品(从相同病人在不同时间点采集的病毒)的抗体介导的中和作用进行评价。例如，在疫苗接种之前，在疫苗接种的过程中，以及在疫苗接种过程完成之后逐步增加的时间点检测病毒中和作用。在一个实施方案中，对预防性疫苗检测其病毒中和作用。在另一实施方案，对治疗性疫苗检测其病毒中和作用。
在另一实施方案中，对从大量不同的病人收集的样品检测其病毒中和作用。在进一步的实施方案中，对从大量代表不同病毒群和不同病人群的病人收集的样品检测其病毒中和作用。这种病人群可包括但不限于，新感染的病人，慢性感染病人，具有病情加深的病人，正接受抗病毒治疗或免疫治疗的病人，疫苗接种的和未疫苗接种的个体。这种病毒群可包括但不限于，贿不同遗传特征的病毒(分化体A、B、C、D、E、F、G)，对于抗病毒药物敏感性的病毒，对于抗病毒药物具有敏感性降低和抗性的病毒，初始分离物，或适合于在培养的细胞中生长的分离物(通常被称为实验室适应病毒)，中胞体诱导(SI)病毒或非合胞体诱导(NSI)病毒，巨噬细胞(M)向性病毒，T-细胞(T)向性病毒和双向性(M和T)病毒。
对病人HIV样品的基因型分析可以借助于任何一种广泛可利用的DNA测序法，分析代表病人样品集合体的被膜序列，或者来源于病人集合体的克隆。在本发明的一个实施方案中，应用病毒RNA纯化法，RT/PCR和二脱氧核苷酸链末端化学测序，以及毛细管凝胶电泳技术(应用生物系统，Foster Citg，CA)，确定了病人样品的HIV序列。将病人病毒集合体或克隆的被膜序列与参照序列，其它病人的样品相比较，或者如果有可能，与开始治疗之前从相同病人获得的样品相比较。确定比基因型的序列，此序列不同于参照序列或治疗前的序列，并且与侵入抑制剂敏感性改变有关。
遗传特征性病毒的抗体介导的中和作用通过构建被膜表达载体(pHIVenv)，对于与病毒中和作用相关的被膜氨基酸序列进行了测定，此表达载体在规定的基因背景上(例如NL43对应X4向性，JRCSF对应R5向性)包含特定的突变。突变可被单独掺入，和/或以同其它被认为将调节病毒中和作用的突变组合的形式被掺入。应用任何一种广泛可利用的定位诱变法，将被膜突变导入pHIVenv载体中。在本发明的一个实施方案中，为了定位诱变使用了mega-引物PCR法(Sarkar G，和Summer S.S.1990)。应用实施例6中所述的病毒侵入分析法，对含有特异性被膜突变或突变组的pHIVenv载体进行了测定。可以选择物异性抗体制备物(即明确鉴定的单克隆或多克隆抗体制备物)，来自HIV感染病人的血清，或来自已接种疫苗个体的血清，比较其中和性。将对含有被膜突变病毒的抗体中和作用与对遗传确定的病毒的抗体中和作用相比较，此遗传确定的病毒缺少被测试中的特异性突变。通过将此突变导入明确鉴定的参照病毒，并以实施例6中所述的病毒侵入分析法测定此突变型病毒的抗体介导的中和作用，此特定突变赋予、改变或阻止抗体中和作用的能力可被证实或被否定。明显的病毒中和作用改变被归因于导入pHIVenv载体中的特定突变。
在本发明的一个实施方案中，通过测定gp120表面被膜蛋白V3环内氨基酸序列，鉴别了病毒中和作用的遗传决定簇。通过比较大量病毒的氨基酸序列，对所测武的氨基酸序列进行鉴别，这些病毒能够或者不能够被各种明确鉴定的抗体制开物、病人血清或来自已疫苗接种个体的血清中和。选择在能够被中和与不能中和的病毒之间V3环内氨基酸序列的稳定差异进行测定。通过定位诱变构建了以明确鉴定的亲本克隆(如NL43，HXB2，JRCSF)为基础的等基因病毒，并如实施例6中所述测定其抗体介导的中和作用，此亲本克隆在其gp120被膜蛋白的V3环中含有特异性“病毒中和作用候选”突变。感染表达CD4加CCR5(如U-87/CD4/CCR5)，CD4加CXCR4(U-87/CD4/CCR4)，或CD4加CCR5和CXCD4(TH4/CCR5/CXCR4)细胞。可诱导，改变或阻止抗体中和作用的氨基酸取代被认为对病毒中和作用是重要的。
在本发明相关的实施方案中，是通过测定整个gp120表面被膜蛋白内的氨基酸序列，鉴别病毒中和作用的遗传决定簇。
在本发明相关的实施方案中，是通过测定gp41跨膜被膜蛋白中的氨基酸序列，鉴别病毒中和作用的遗传决定簇。
实施例8测定时病毒侵入抑制剂的敏感性，以便指导治疗决定。
本实施例提供了一种方式和方法，以便应用病毒侵入抑制剂敏感性指导对HIV-1的治疗。本实施例还进一步提供了一种方式和方法，以便应用病毒侵入抑制剂敏感性指导对病人的治疗，这些病人以前已接受病毒侵入抑制剂的抗病毒治疗。本发明还进一步提供了方式和方法以便应用病毒侵入抑制剂敏感性指导对病人的治疗，这些病人以前未接受过病毒侵入抑制剂的治疗。
在一个实施方案中，病人的病毒对病毒侵入抑制剂的敏感性被用于指导对病人的治疗，这些病人正处于抗病毒治疗失败的状况，包括使用了一种或几种病毒侵入抑制剂。治疗失败(也被称为病毒学失败)一般被定义为部分抑制性抗病毒治疗，导致通常在病人血浆中存可检测的病毒浓度。指导可包括但不限于，(a)指明可利用的药物治疗选择，(b)选择更积极的治疗方式，(c)澄清治疗的病人中病毒数量增加的病因学(即不良的附着，药物抗性)，以及(d)减少使用无活性潜在毒性的药物。在本实施方案中，抗性试验载体来源于病人的病毒样品，可应用表型病毒侵入分析法测定其对各种病毒侵入抑制剂的敏感性。病毒侵入抑制剂包括但不限于，融合抑制剂(如T-20，T-1249)，共受体拮抗剂(AMD3100，AMD8664，TAK779，PR0542，和哌啶-1基乙烷化合物)，以及CD4拮抗剂(MAb 5A8)。适合的治疗决定是基于病毒侵入分析试验的结果(例如见图4B)和补充的相关性实验室测试结果以及临床信息。
在另一实施方案中，病人的病毒对病毒侵入抑制的敏感性被用于指导对病人的治疗，这些病人以前示接受过用包括一种或几种病毒侵入抑制剂的抗病毒治疗方式。指导可包括但不限于(a)指明可利用的药物治疗选择，(b)选择更积极的治疗方式，(c)了解对病毒侵入抑制剂的基本敏感性，以及(d)减少使用无活性和潜在毒性的药物。基于二个原因，在病人的治疗中确定病毒侵入抑制剂的基本敏感性是重要的。第一，病毒对侵入抑制剂的天然敏感性可以广泛地改变(例如见图4A)。第二，病毒侵入抑制剂的使用增加将无凝会导致产生药物抗性变异体，这种变异体可被传播给新感染的个体。在此实施方案中，抗性试验载体来源于病人的病毒样品可应用表型病毒侵入分析法测定其对各种病毒抑制剂的敏感性。病毒侵入抑制剂包括但不限于融合抑制剂(如T-20，T-1249)，共受体拮抗剂(AMD3100，AMD8664，TAK779，PR0542，和哌啶-1基乙烷化合物)，以及CD4拮抗剂(MAb5A8)。适合的治疗决定是基于病毒侵入分析试验的结果和补充的相关性实验室测试结果以及临床信息。
实施例9测定HIV-1共受体向性，以便指导治疗决定本实施例提供了一种方式和方法，以便应用HIV-1共受体(CCR5，CXCR4)向性指导对HIV-1的治疗。本实施例还进一步提供了一种方式和方法，以便应用HIV-1共受体向性指导对病人的治疗，这些病人正处于抗病毒药物治疗失败中，本发明还进一步提供了应用HIV-1共受体向性，指导治疗被HIV-1新感染病人的方式和方法。
本实施例提供了应用病毒HIV-1共受体向性，指导治疗HIV-1的方式和方法。本实施例还进一步提供了应用HIV-1共受体向性指导治疗病人的方式和方法，这些病人以前已接受了用病毒侵入抑制剂的抗病毒治疗。本发明还进一步提供应用HIV-1共受体向性指导治疗病人的方式和方法，这些病人以前未接受用病毒侵入抑制剂的治疗。
在一个实施方案中，病人的病毒共受体向性被用于指导对病人的治疗，此病人正正处于抗病毒治疗失败的状况，包括使用了一种或几种共受体拮抗剂。治疗失败(也被称为病毒学失败)一般被定义为部分抑制性抗病毒治疗，导致通常在病人血浆中存在可检测的病毒浓度。指导可包括但不限于，(a)了解治疗的病人中病毒数量增加的病因学(即不良的附着，药物抗性，共受体细胞改变)，(b)指明可利用的药物治疗选择，(c)选择更积极的治疗方式，以及(d)减少使用无活性和潜在毒性的药物。对接受用CCR5拮抗剂治疗的病人监测共受体向性具有重要的临床价值，因为药物的压制可能导致转变为CXCR4共受体向性，与R5病毒(CCR5共受体向性)相比较，X4病毒(CXCR4共受体向性)与更不良的预后有关。在此实施方案中，抗性试验载体来源于病人的病毒样品，可应用表型病毒侵入分析法测定其对各种共受体拮抗剂的敏感性。适合的治疗决定是基于病毒侵入分析试验的结果(例如见图4B)和补充的相关性实验室测试结果以及临床信息。
在另一实施方案中，病人病毒的共受体向性被用于指导对病人的治疗，这些病人以前未接受过用包括一种或几种共受体拮抗剂的抗病毒治疗方式。指导可包括但不限于，(a)了解基本的共受体向性，(b)指明可利用的药物治疗选择，(c)选择更积极的治疗方式，(d)减少使用无活性和潜在毒性的药物。确定基本的共受体向性具有重要的临床价值。用适合的共受体向性具有重要的临床价值。用适合的共受体拮抗剂(R5对X4向性)治疗，或者用几种拮抗剂(双向性或混合向性)治疗，都很可能导致更有效的和特久的响应。在此实施方案中，抗性试验载体来源于病人的病毒样品，可应用表型病毒被侵入分析法测定其对各种病毒侵入抑制剂的敏感性。共受体拮抗剂包括但不限于(AMD3100，AMD8664，TAK779，PR0542，)，以及哌啶-1基丁8烷化合物。适合的治疗决定是基于病毒侵入分析试验的结果和补充的相关性实验室测试结果以及临床信息。
表1细胞
表2代表性病毒和药剂
aR5(CCR5共受体)，X4(CXCR4共受体)SI(诱导合胞体的)，NSI(非诱导合胞体的)，A，B，C，D，E，F(被膜分化体名称)bAIDS研究和参照药剂单目表3试验扩增HIV被膜的引物
表4(第1组)抗-HIV药物


FDA批准的药物以黑体字显示，红色＝中断开发，兰色＝开发前景不肯定表4(第2组)
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序列表<110>Richman，DouglasWrin，MaryPetropoulos，ChristosLittle，SusanHuang，WeiParkin，NeilWhitcomb，Jeanette<120>应用重组病毒分析试验评价病毒受体/共受体用途以及病毒侵入抑制剂的组合物和方法<130>11068-027-228<150>US10/077,027<151>2002-02-15<160>10<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1ggagcattta caagcagcaa cacagc 26<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2ttccagtcav acctcaggta c21
<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3agaccaatga cttayaagg 19<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4gggctcgaga ccggtcagtg gcaatgagag tgaag 35<210>5<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5gggctcgaga ccggtgagca gaagacagtg gcaatga 37<210>6<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>6gggctcgaga ccggtgagca gaagacagtg gcaatg36<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7gggtctagaa cgcgttgcca cccatcttat agcaa 35<210>8<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8gggtctagaa cgcgtccact tgccacccat bttatagc 38<210>9<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9gggtctagaa cgcgtccact tgccacccat btta 34<210>10<211>38<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10gatggtctaa gacgctgttc aatatccctg cctaactc 38
权利要求
1.一种用于检测在病毒感染的病人体内能够阻止感染的抗体应答反应形成的方法，此方法包括(a)使一种宿主细胞与来自病人的抗体制备物接触，其中该宿主细胞含有编码来自病人的病毒蛋白的核酸以及产生可检测信号的指示核酸，(b)测定宿主细胞所产生的可检测信号的数量，以及(c)将步骤(b)中测定的信号数量与不存在抗体制备物时产生的信号数量相比较，其中，存在抗体制备物时测定的信号数量减少，指示病人已经形成了能够阻止感染的对病毒蛋白质的抗体应答反应。
2.一种用于检测在病毒感染的病人体内能够阻止感染的抗体应答反应形成的方法，此方法包括(a)将如下二种成分转染进入第一种细胞i)编码来自病人的病毒蛋白质的核酸，和ii)缺少编码病毒蛋白质的核酸，而包含产生可检测信号的指示核酸的病毒表达载体，以致第一种细胞可产生包含病毒蛋白质的病毒颗粒，该病毒蛋白质是由从病人获得的核酸编码的；(b)使步骤(a)中产生的病毒颗粒与来自病人的抗体制备物接触；(c)使步骤(b)中的病毒颗粒和抗体制备物与第二种细胞接触，其中第二种细胞表达该病毒与之结合的细胞表面受体；(d)测定由第二种细胞所产生的可检测信号数量，以便确定此病毒颗粒的侵染性，以及(e)将步骤(d)中测定的信号数量与不存在抗体制备物时产生的信号数量相比较，其中存在抗体制备物时测定的信号数量减少，指示病人已经形成了能够阻止感染的对病毒蛋白质的抗体应答反应。
3.一种用于检测在病毒感染的病人体内能够阻止感染的抗体应答反应形成的方法，此方法包括(a)将如下二种成分转染进入第一种细胞i)编码来自病人的病毒蛋白质的核酸，和ii)缺少编码病毒蛋白质的核酸的病毒表达载体，以致第一种细胞可产生包含病毒蛋白质的病毒颗粒，该病毒蛋白质是由从病人获得的核酸编码的；(b)使步骤(a)中产生的病毒颗粒与来自病人的抗体制备物接触；(c)使步骤(b)中的病毒颗粒和抗体制备物与第二种细胞接触，其中第二种细胞表达该病毒与之结合的细胞表面受体，并且第二种细胞含有产生可检测信号的指示核酸；(d)测定由第二种细胞所产生的可检测信号数量，以便确定病毒颗粒的侵染性，以及(e)将步骤(d)中测定的信号数量与不存在抗体制备物时产生的信号数量相比较，其中存在抗体制备物时测定的信号数量减少，指示病人已经形成了能够阻止感染的对病毒蛋白质的抗体应答反应。
4.权利要求1，2或3的方法，其中的病毒蛋白质是被膜蛋白。
5.权利要求1，2或3的方法，其中的病毒蛋白质是衣壳蛋白。
6.一种用于检测在病毒感染的病人体内能够阻止感染的抗体应答反应形成的方法，此方法包括a)培育包含如下二种成分的第一种细胞i)编码来自病人的病毒蛋白质的核酸，和ii)缺少编码病毒蛋白质的核酸，而包含产生可检测信号的指示核酸的病毒表达载体，以致第一种细胞可产生包含病毒蛋白质的病毒颗粒，该病毒蛋白质是由从病人获得的核酸编码的；(b)使在步骤(a)中产生的病毒颗粒与来自病人的抗体制备物接触；(c)使步骤(b)中的病毒颗粒和抗体制备物与第二种细胞接触，其中第二种细胞可表达此病毒与之结合的细胞表面受体；(d)测定由第二种细胞产生的可检测信号数量，以便确定该病毒颗粒的侵染性，以及(e)将步骤(d)中测定的信号数量与不存在抗体制备物时产生的信号数量相比较，其中，存在抗体制备物时测定的信号数量减少，指示病人已经形成了能够阻止感染的对病毒蛋白质的抗体应答反应。
7.权利要求6的方法，其中(i)中的核酸是(ii)中病毒表达载体的组成部分。
8.权利要求6的方法，其中(i)中的核酸被整合进入第一种细胞的基因组中。
9.权利要求6的方法，其中(ii)中的病毒载体被整合进入第一种细胞的基因组中。
10.权利要求6的方法，其中(i)中的核酸和(ii)中的病毒载体被整合进入第一种细胞的基因组中。
11.权利要求6的方法，其中的病毒蛋白质是衣壳蛋白。
12.权利要求6的方法，其中的病毒蛋白质是被膜蛋白。
13.权利要求12的方法，其中(i)中的核酸是(ii)中病毒表达载体的组成部分。
14.权利要求12的方法，其中(i)中的核酸被整合进入第一种细胞的基因组中。
15.权利要求12的方法，其中(ii)中的病毒载体被整合进入第一种细胞的基因组中。
16.权利要求12的方法，其中(i)中的核酸和(ii)中的病毒载体被整合进入第一种细胞的基因组中。
全文摘要
本发明提供了一种用于鉴别化合物是否抑制病毒侵入细胞的方法，此方法包括(a)从被该病毒感染的病人获得编码病毒被膜蛋白的核酸；(b)将如下二种成分共转染进入第一种细胞；(i)步骤(a)中的核酸，以及(ii)缺少编码被膜蛋白的核酸，而包含产生不检测信号的指示核酸的病毒表达载体，以致第一种细胞可产生包含被膜蛋白的病毒颗粒，此被膜蛋白是由从病人获得的核酸编码的；(c)在有化合物存在时，使步骤(b)中产生的病毒颗粒与第二种细胞接触，其中此第二种细胞表达病毒与之结合的细胞表面受体；(d)测定由第三种细胞所产生的信号数量，以便确定此病毒颗粒的侵染性，以及(e)将步骤(d)中测定的信号数量与不存在此化合物时产生的信号数量相比较，其中，存在化合物时测定的信号数量减少，指示该化合物可抑制病毒侵入第二种细胞。
文档编号C12Q1/70GK1646706SQ03808536
公开日2005年7月27日 申请日期2003年2月14日 优先权日2002年2月15日
发明者D·里奇曼, M·T·林, S·利特尔, C·J·佩特罗普洛斯, N·T·帕金, J·M·怀特坎布, 黄微 申请人:瓦罗洛吉克公司