专利名称：分化调节试剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及用于调节前脂肪细胞(preadipocyte)分化潜能和/或增殖的方法和试剂。本发明尤其涉及引起前脂肪细胞增殖和加强前脂肪细胞向脂肪细胞分化的成纤维细胞生长因子(FGF)信号传输，特别是FGF-1和FGF-2信号传输。更具体地说，本发明涉及包括Fgf或FGF受体(Fgfr)多核苷酸或其表达产物特异性拮抗剂分子在内的降低、削弱或阻断FGF信号传输的分子及其在脂肪形成的负调节(包括下调前脂肪细胞的分化潜能和/或增殖)中的应用。本发明也延伸到为提高前脂肪细胞的分化潜能和/或增殖而使用包括Fgf多核苷酸和FGF多肽及其具有生物活性的片段、变异体和衍生物在内的FGF或FGFR激动剂分子。此外，本发明延伸到筛选包括调节选自Fgf基因、Fgfr基因或与其属于同一生物合成或调控途径的基因的基因表达、或调节该基因表达产物水平或功能活性在内的激活或拮抗FGF信号传输的有用试剂的方法。此外，本发明涉及在用于治疗或预防包括但不仅限于肥胖、脂肪瘤、脂肪过多症、恶病质或脂肪营养不良等脂肪相关疾病或创伤或萎缩性疾病中的脂肪组织缺失的方法中这些调节试剂的应用。
背景技术：
肥胖随着传统“西方”国家的高脂肪饮食和缺乏运动的生活方式优于各种族传统生活方式被采纳，肥胖不再局限于传统上的“西方化”社会而成为一个全球性的健康问题(Doll等，Int J Obes Relat Metab Disord 26(1)48-57，2002；Fall，Br MedBull 6033-50，2001)。肥胖症的发病率，尤其是儿童肥胖症，正以比几乎其他任何医学疾病更快的速度上升。全球约有2千2百万5岁以下的儿童超重(Deckelbaum等，Obes Res 9增刊4239S-243S，2001)，全球7％以上的成人肥胖，此外还有约21％的成人被归为超重(Seidell，Acta Paediatr Suppl 88(428)46-50，1999)。世界卫生组织将成人中肥胖症的高发病率描述为“全球流行病”。
肥胖症与诸如心血管疾病和II型糖尿病(2001年秋，同上)等严重的并存病的关联是将其归为一种严重的医学疾病的原因(James等，Obes Res 9 Suppl 4228S-233S，2001)。肥胖症所引发的对卫生保健预算的明显财政影响使得肥胖症的治疗和预防已成为健康促进战略中一个主要的优先考虑问题。这些战略的目标是通过限制热量摄入和增加体育运动降低体重，这样的目标的前提是建立在即便是病态肥胖的个体，其体重降低能够导致肥胖相关病理状态的减退或好转这样的证据上的(Melissas等，Obest Surg 11(4)475-81 2001)。
不幸的是，这些策略只获得了有限的成功。不断增长的全球肥胖率已使这些肥胖症治疗和预防策略的焦点转向代谢和遗传治疗手段的介入。为了使得这样的介入获得成功，需要对脂肪沉积的细胞机理有详细的理解。
人体脂肪组织是贯穿生命历程的由胞内贮存的甘油三酯和脂肪细胞构成的具有恒定通量的动态器官。新的脂肪细胞由前脂肪细胞通过增殖和分化形成，这一过程称之为脂肪形成。前脂肪细胞是在脂肪组织的基质血管区发现的成纤维细胞类似细胞。抑制脂肪形成的治疗介入手段应该会在严重超重病人的治疗中具有深远的临床应用。
迄今为止，研究发现了一些能引起脂肪细胞大小和数量改变的细胞和分子事件的蛋白质、神经肽和转录调控因子。这些试剂的作用表明脂肪细胞数量和大小通过一种由激素和营养信号(它们通过以细胞-细胞或细胞-基质模式发生作用的分子触发下游信号传输)参与的、复杂的相互影响方式发生改变(Gregoire，Exp Biol Med(Maywood)226(11)997-1002 2001)。这些分子的完全功能及其相互作用以及对脂肪细胞的作用方式还未最终确定。
通过动物和人前脂肪细胞分离及其体外复制和分化技术的发展，脂肪形成的很多方面已经得到了认识。通过研究在体外分化成类脂肪细胞的小鼠前脂肪细胞细胞系(如3T3-L1)获得了更进一步的认识。
在人体组织中，前脂肪细胞通过采用胶原酶消化和在含血清培养基中培养的方式从脂肪组织中分离。在达到融合时(经过或未经过在先的次培养)细胞在不含血清的化学或激素改造过的培养基中分化。这一过程就所需时间和获得成熟脂肪细胞表型的细胞的低百分率而言是相对低效的。
促有丝分裂原和胰岛素能促进复制，这一过程需要血清。血清完全抑制分化期，而胰岛素、皮质类固醇、甲状腺激素和生长激素增强分化。最近的研究表明，噻唑烷二酮(TZD)类药物通过与PPARγ(在脂肪形成中居于中心地位的配基依赖型转录因子)结合激活分化。
在本发明前期的工作中，提出了血管细胞和脂肪细胞之间发生相互作用的假设。已知在脂肪形成之前，先形成了良好的血管网络(Hutley等，Am J PlaysiolEndocrinol Metab 281(5)E1037-1044，2001)，而前脂肪细胞和微血管内皮细胞之间的旁分泌相互作用也已被提出(Hutley等，如前文引用)(Varzaneh等，Metabolism 43(7)906-12，1994)。在分离侯选的旁分泌化合物的尝试中，本发明的发明人共培养了人前脂肪细胞和微血管内皮细胞(MVEC)并发现酸性成纤维细胞生长因子(aFGF，也称之为FGF-1)存在于培养基中。最初的研究意外地指出这一生长因子的来源主要是MVEC，与以前的研究结果相反，与FGF-1共培养的前脂肪细胞明显促进其生长与复制，并对细胞分化为成熟脂肪细胞具有重要的正向作用。鉴于FGF家族不同成员之间潜在功能的重复性，相信其他的一个或多个FGF可能也与直接或间接调节脂肪形成相关联。事实上，最初的研究指出碱性FGF(也称之为FGF-2)具有与FGF-1类似的促脂肪形成作用。
成纤维细胞生长因子(FGF)成纤维细胞生长因子家族是结构相关的多肽生长因子，包括20多种具有蛋白识别反应能力的成员。家族成员之间具有有限的直接编码序列同源性。由于刺激生长不是家族成员中普遍的特性，家族名称易于引起误解。但是，作为一个家族，FGF在生长发育、细胞复制、血管生成、细胞生存和凋亡、肿瘤发展和形态形成中具有关键作用。FGF属于更大的肝素结合生长因子家族，该家族包括大量生长因子，其中一些具有与FGF相似或互补的作用。
FGF由许多不同的基因编码并具有相似的内含子-外显子组织结构，在FGF1-6中有3个编码区。由120个氨基酸组成的中间核心区域高度保守(70-100％相同)，而其他区域则表现出显著的序列差异性。
成纤维细胞生长因子在信号肽或定位序列的存在、糖基化位点和翻译后修饰等方面存在差异。许多FGF在选择性启动子使用(如FGF-1)、选择性剪接(如FGF-1和-2)和选择性多聚腺苷化位点的使用上(如FGF-1和FGF-2)表现出差异。使用组织特异性启动子是提供特异性功能的一种机制(如FGF-1)。
所有FGF都能从细胞中释出，但有些也在产生细胞和靶细胞的细胞核或胞质中积累。此外，分泌的FGF贮存在胞外基质中，其进一步的释放受蛋白酶控制。FGF通过以下两种机制中的一种从胞外基质中释放。第一种，胞外基质成分通过蛋白酶或肝素酶的酶裂解导致FGF释放。第二种，FGF能与担体蛋白(FGF-BP)结合，而后者能运送FGF至其受体。目前公认，肝素或乙酰肝素类糖胺聚糖是实现有效FGF信号传输的基础。一些FGF表达的组织特异性和/或分化阶段特异性已有报道。
FGF家族与胞外基质成分的结合被认为产生两个效果a)保护FGF免受循环的蛋白酶降解；b)形成生长因子的局部贮存库。由于只有与胞外基质接触的细胞易于接受FGF信号，上述第二个特点允许对FGF信号传输实现严格的空间调节。
成纤维细胞生长因子受体(FGFR)与其配体类似，FGF受体(FGFR)包括一个编码至少5种结构上相关联的蛋白的基因家族。它们是酪氨酸激酶类受体成员并广泛表达。5种受体的氨基酸序列具有60-95％的同源性，其中最保守的区域与信号转导密切相关。FGF与受体的结合具有不同的特异性，这一特点结合受体的细胞特异性表达及其不同剪切形式，提供了信号传输的进一步差异性。除了定位于细胞膜，FGFR也在核膜内和细胞质基质中表达。针对FGF的信号转导通过受体的二聚化及与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)形成复合物的方式发生。随后，FGFR胞内结构域上多位点的磷酸化引发多种下游信号转导分子和信号途径的募集和/或磷酸化。FGFR包含最多3个典型的类免疫球蛋白(Ig)胞外结构域，这将FGFR归于Ig受体超家族(还包括PDGFR和IL-1R)。
FGF信号传输的差异性归结于受体组合的细胞特异性表达、受体异构体组合的细胞特异性表达、多种异源二聚体组合以及FGF的不同组成。
硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)HSPG是与核心蛋白共价结合的硫酸化的糖胺聚糖，能促进FGF-FGFR的相互作用。这可能是由于HSPG引起FGF和FGFR的构形改变，使其分别二聚化并互相结合，或是由于HSPG与FGF和FGFR形成具有活性的信号传输复合物的一部分。实验证据支持上述两种模型的存在，很可能这两种机制均存在。一些FGF早期反应可能在无HSPG参与的情况下被引发，但HSPG似乎是持续的信号传输所必需的。
HSPG同时也保护FGF，使其在胞外基质中免受降解。目前，参与FGF信号传输的HSPG包括多配体蛋白聚糖(多配体蛋白聚糖)(细胞关联的跨膜蛋白聚糖)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖(磷脂酰肌醇蛋白聚糖)(通过糖基磷脂酰肌醇基团锚定在质膜上的蛋白聚糖)和基底膜蛋白聚糖(基底膜蛋白多糖)(胞外基底膜蛋白聚糖)。HSPG参与FGF信号传输的调控的证据来自于体外研究和对HSPG突变的个体的研究。例如，这些研究表明，磷脂酰肌醇蛋白聚糖(磷脂酰肌醇蛋白聚糖)能促进FGF-2诱导的促有丝分裂但抑制FGF-7反应。
富含半胱氨酸的FGFR富含半胱氨酸的FGFR(CFR)是不含硫酸乙酰肝素链的、与FGF结合的、整合在细胞膜上的唾液酸糖蛋白。FGF以互相排斥的方式与CFR和FGFR结合。CFR可能在将FGF定位于胞内位点和调节胞内FGF浓度中发挥作用。
FGF信号传导途径1.FGFR依赖的细胞内信号传输如上文所描述，并参照图1所示的FGF信号传输途径的示意性表示，配体的结合导致受体的二聚化和自我磷酸化。突变分析显示，仅二聚化便足以促进信号转导。FGFR含有多个磷酸化位点(如FGFR-1含7个磷酸化位点)而磷酸化位点突变的、激酶失活的受体不能传导多种FGF的生物信号。然而，一些作用得到了保留，这表明非受体介导的信号传输途径是重要的考虑因素。
已知的FGF/FGFR采用的信号传输途径有(1)SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK途径和(2)PLCγ□□、PKC、Ca2+途径。
a)SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK途径随着受体磷酸化，含src同源(SH-2)结构域和磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域的蛋白与FGFR胞内的特异磷酸酪氨酸结合。这些蛋白包括PLCγ、SHC和FRS2(FGFR底物2)，这些分子中的一些是FGFR特异的(如FRS2)，而其他一些则是更为随意的(如SHC)。随着磷酸化，这些“船坞蛋白”(docking protein)直接与GRB2-SOS复合物结合，该复合物的功能是作为与RAS结合的连接物。膜结合的RAS随后募集并激活MAPK转导途径。
值得注意的是，MAPK途径中多个激酶中的每一个均受FGF(及其他)受体下游信号分子的调控，这样的“互相交谈”为应答的更高特异性提供了可能。
b)PLCγ、PKC、Ca2+途径PLCγ是含SH-2结构域的、与FGFR的特异磷酸酪氨酸(FGF-1中的Y766)结合并将磷酸肌醇水解成1，4，5三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DAG)的蛋白。IP3诱导Ca2+从胞内储备中释放，而DAG激活丝/苏氨酸特异性激酶PKC。
总体来说，FGF刺激的生物学结果取决于FGF、FGFR、HSPG和细胞内信号中间体的数量、组合及其亚细胞定位，以及来自其他信号传输分子和途径的调控。
2.FGF靶基因FGF处理改变多种基因的表达，并能通过非FGFR介导的机制实现。推测这是一种直接作用，许多FGF含有核定位基序并发现位于细胞核及核仁中并与染色质结合。FGF对基因转录的作用是细胞类型特异的。此外，已经证明FGF能保持其初始诱导依赖于其他因子的基因的表达。除了转录调控，FGF也影响mRNA的稳定性以及蛋白的翻译和翻译后修饰。
3.与其他生长因子信号途径的相互作用FGF能对许多其他生长因子产生拮抗或强化。FGF与转化生长因子(TGF)、类胰岛素生长因子1(IGE-1)和WNT信号传输协同作用是常见的现象。
由前文所述，依照本发明，我们提出，FGF信号途径(特别是FGF-1或FGF-2信号途径)中的分子除其他用途以外，如下文所述，可被用于提供促进或抑制脂肪相关疾病中脂肪形成的药物靶点和调控剂，也可用于提供肥胖敏感体质的诊断标记。
发明概述因此，本发明的一个方面是提供了调节脂肪形成的方法，这些方法尤其有助于脂肪相关疾病的治疗和预防。这些方法通常包括细胞与一种试剂在足以调节FGF信号途径的条件下接触一段时间。在一些实施方案中，FGF信号途径选自FGF-1信号途径和FGF-2信号途径。这些途径的典型成员包括但不仅限于FGFR，HSPG，SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK途径成员，PLCγ-PKC-Ca2+途径成员，FGF-1核转移途径成员以及诸如P34和FIF(FGF互相作用因子)等细胞内结合伴侣。如这里进一步所述的，合适试剂的实例包括但不仅限于诸如核酸、肽、多肽、拟肽、糖类、脂类或其他有机(含碳的)或无机分子的小分子。
在一些实施方案中，细胞与调节基因表达或基因表达产物的水平或功能活性的试剂接触，这里所述的基因选自Fgf基因(如Fgf-1或Fgf-2)和与Fgf基因同属相同的调控或生物合成途径的基因(如P34和FIF)。在这些实施方案中，所述细胞是适当的微血管内皮细胞或其前体。
在其他实施方案中，细胞与调节基因表达或基因表达产物的水平或功能活性的试剂接触，这里所述的基因选自Fgfr基因(如Fgfr-1，Fgfr-2，Fgfr-3，Fgfr-4，Fgfr-5，特别是Fgfr-1，Fgfr-2，Fgfr-3，Fgfr-4)，与Fgfr基因同属相同的调控或生物合成途径的基因(如通过Ras-Raf-MAP激酶途径和/或通过磷酸酯酶C途径参与信号传输的基因)，其表达直接或间接受Fgf基因表达产物调节的基因(如PPARγ，IGFBP-3，IGFBP-6，IGF-2，IRS-2，PI3激酶，PKCθ)，或激活或拮抗与一种FGF(如FGF-1或FGF-2)相互作用的FGFR功能的基因。在这些实施方案中，所述细胞是适当的前脂肪细胞或其前体。
在一些实施方案中，所述试剂降低基因(如Fgfr-1，Fgfr-2，Pparγ，C/Ebpα，Plcγ2，Igfbp3，Igfbp6)的表达或该基因表达产物(如FGFR-1，FGFR-2，PPARγ，C/EBPα，PLCγ2，IGFBP3，IGFBP6)的水平或功能活性。在其他实施方案中，所述试剂提高基因(如Fgf-1，Fgfr-3，Igf-2，Irs-2，Pi3激酶，Pkcθ)的表达或该基因(如FGF-1，FGFR-3，IGF-2，IRS-2，PI3激酶，PKCθ)表达产物的水平或功能活性。在另外其他实施方案中，所述试剂拮抗一种FGFR的功能，包括降低或阻断FGFR和FGF之间的相互作用。在这些实施方案中，所述试剂拮抗一条FGF信号途径，从而有助于直接或间接降低或阻断前脂肪细胞的分化潜能和/或增殖。
在一些实施方案中，所述试剂降低基因(如Fgf-1，Igf-2，Irs-2，Pi3激酶，Pkcθ)的表达或该基因表达产物(如FGF-L，IGF-2，IRS-2，PI3激酶，PKCθ)水平或功能活性。在其他实施方案中，所述试剂提高基因(如Fgfr-1，Fgfr-2，Pparγ，C/Ebpα，Plcγ2，Igfbp3，Igfbp6)的表达或该基因表达产物(如FGFR-1，FGFR-2，PPARγ，C/EBPα，PLCγ2，IGFBP3，IGFBP6)水平或功能活性。在还有其他实施方案中，所述试剂激活一种FGFR的功能，包括增强、促进或其他方式赋予FGFR和FGF之间相互作用的能力。在这些实施方案中，所述试剂激活一条FGF信号传输途径，从而有助于直接或间接提高前脂肪细胞的分化潜能和增殖。
因此，相对于不存在所述试剂时基因的表达或该基因表达产物的水平或功能活性，所述试剂至少提高或降低所述基因表达或该基因表达产物的水平或功能活性10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％。
另一方面，本发明提供了鉴别调节FGF信号途径的试剂的方法。这些方法通常包括将一种制品与一种待测试剂接触，这里所述的制品包括(1)一条包含对应于FGF信号途径的一个多肽组分的至少一个具备生物活性的片段或其变异体或衍生物的氨基酸序列的多肽；或(2)一条至少包含调节FGF信号途径多肽组分的遗传序列的一部分的多核苷酸，该多核苷酸以可操作方式与一条报道基因相连。相对于没有待测试剂时的正常或参照水平和/或功能活性，检测到的多肽组分或报道基因表达产物的水平和/或功能活性的变化表明所述试剂调节FGF信号途径。
再一方面，本发明提供了鉴别调节FGF信号途径的试剂的方法。这些方法通常包括将第一个表达FGFR的细胞样本与FGF接触并检测标记物；将第二个表达FGFR的细胞样本与FGF和一种试剂接触并检测标记物；以及将第一细胞样本的标记物与第二细胞样本的标记物进行比较。在多种实施方案中，这些方法检测与前脂肪细胞增殖和/或分化相关的多种标记物(如甘油3-磷酸脱氢酶，G3PDH及FGF途径中的胞内组分)或标记物组合的水平。
按照本发明所述，前文广泛描述的试剂有助于调节脂肪相关疾病中的脂肪形成。脂肪相关疾病包括但不仅限于肥胖、脂肪瘤、脂肪过多症、恶病质或脂肪营养不良或创伤或萎缩性疾病中的脂肪组织缺失。因而，本发明的另外一个方面包括为抑制或降低脂肪形成，或为在肥胖或脂肪形成局部异常增加疾病中控制脂肪形成，使用与药学上可接受的载体或稀释剂随意配伍的试剂，其中，如前文广泛描述的，所述试剂拮抗FGF信号传输途径。
再另一方面，本发明包括为在恶病质或局部脂肪不足的疾病的治疗或预防中刺激脂肪形成，使用与药学上可接受的载体或稀释剂随意配伍的试剂，其中，如前文广泛描述的，所述试剂激活FGF信号途径。
上述方法中所用试剂的特征在于，它与如前文广泛描述的基因表达产物或与调节该基因表达的遗传序列(如转录元件)相结合。这样的结合通过以下方式测定至少包含如前文广泛描述的基因表达产物一部分或其变异体或衍生物的，或调节该基因表达的遗传序列的制品与所述试剂接触，并检测至少是表达产物一部分的或其变异体或衍生物的，或所述遗传序列所表达的产物的水平或功能活性的变化。
在一些实施方案中，抑制或以其他方式降低脂肪形成的试剂与FGF或FGFR或调节Fgf或Fgfr基因表达的遗传序列(如转录元件)相结合。这样的结合通过以下方式测定包含FGF或FGFR多肽或其生物活性片段或其变异体或其衍生物的，或调节Fgf或Fgfr基因表达的遗传序列的制品与所述试剂接触；并检测FGF或FGFR多肽或其生物活性片段或其变异体或其衍生物，或所述遗传序列所表达的产物的水平或功能活性的降低。
在其他实施方案中，抑制或以其他方式减少脂肪形成的试剂拮抗FGF信号途径，这是通过以下方式测定的FGFR和FGF与所述试剂接触并检测FGFR与FGF的结合。在这些实施方案中，所述试剂能与FGF或FGFR结合，当其降低或阻断FGFR与FGF的结合时，该试剂检测为阳性。所述试剂可以是小分子或针对FGF或FGFR的特异性抗原结合分子。
在其他实施方案中，抑制或以其他方式减少脂肪形成的试剂拮抗FGF信号途径，这是通过以下方式测定的FGFR和HSPG与所述试剂接触并检测FGFR与HSPG的结合。在这些实施方案中，所述试剂可以与FGF或HSPG结合，当其降低或阻断HSPG与FGFR的结合时，该试剂检测为阳性。所述化合物可以是小分子或针对FGFR或HSPG的特异性抗原结合分子。
在其他实施方案中，抑制或以其他方式减少脂肪形成的试剂拮抗FGF信号途径，这是通过以下方式测定的FGF和CFR与所述试剂接触并检测FGF与CFR的结合。在这些实施方案中，所述试剂可以与FGF或CFR结合，当其降低或阻断CFR与FGF的结合时，该试剂检测为阳性。所述化合物可以是小分子或针对FGF或CFR的特异性抗原结合分子。
在另外其他实施方案中，抑制或以其他方式减少脂肪形成的试剂拮抗FGF信号途径，这是通过以下方式测定的将选自前脂肪细胞或其前体的第一细胞样本与FGF接触并检测细胞的分化和/或增殖；将选自前脂肪细胞或其前体的第二细胞样本与一种试剂和FGF接触并检测细胞的分化和/或增殖；比较第一细胞样本的分化和/或增殖与第二细胞样本的分化和/或增殖。在这些实施方案中，所述试剂通过干扰FGF和FGFR的结合、通过干扰FGFR磷酸化、通过干扰FGF/FGFR相互作用的上游或下游信号途径组分、通过干扰FGFR和HSPG的结合、通过干扰FGF和CFR的结合或通过干扰FGFR的二聚化拮抗FGF信号途径。在有些实施方案中，拮抗FGF信号途径干扰信号途径的试剂选自TGF、IGF-1和WNT信号途径的一条信号途径。
在进一步的实施方案中，抑制或以其他方式减少脂肪形成的试剂拮抗FGF信号途径，这是通过以下方式测定的用拮抗该信号途径的试剂对动物模型或人给药，并检测动物对该试剂的反应。在这些实施方案中，所述方法可采用如上所述的试剂，动物可检测肥胖症或脂肪形成局部异常增加疾病中脂肪形成的抑制或降低。
在另外其他实施方案中，刺激脂肪形成的试剂与FGFR或与调节Fgfr基因表达的遗传序列(如转录元件)结合，这是通过以下方式测定的包含FGFR多肽或其生物活性片段或其变异体或其衍生物，或调节Fgf或Fgfr基因表达的遗传序列的制品与一种试剂接触；并检测该FGFR多肽或其生物活性片段或其变异体或其衍生物，或由该遗传序列所表达的产物的水平或功能活性的提高。
在其他实施方案中，刺激脂肪形成的试剂激活FGF信号传输途径，这是通过以下方式测定的FGFR和FGF与所述试剂接触并检测FGFR与FGF的结合。在这些实施方案中，所述试剂能与FGF或FGFR结合，当其刺激FGFR与FGF的相互作用时，该试剂检测为阳性。所述试剂可以是小分子或针对FGF或FGFR的特异性抗原结合分子。
在其他实施方案中，刺激脂肪形成的试剂激活FGF信号传输途径，这是通过以下方式测定的一种FGFR和一种HSPG与所述试剂接触并检测FGFR与HSPG的结合。在这些实施方案中，所述试剂能与FGFR或HSPG结合，当其刺激HSPG与FGFR的相互作用时，该试剂检测为阳性。所述化合物可以是小分子或针对FGFR或HSPG的特异性抗原结合分子。
在其他实施方案中，刺激脂肪形成的试剂激活FGF信号传输途径，这是通过以下方式测定的一种FGF和一种CFR与所述试剂接触并检测FGF与CFR的结合。在这些实施方案中，所述试剂能与FGF或CFR结合，当其刺激CFR与FGF的相互作用时，该试剂检测为阳性。所述化合物可以是小分子或针对FGF或CFR的抗原结合分子。
在还有其他实施方案中，增强脂肪形成的试剂激活FGF信号传输途径，这是通过以下方式测定的将选自前脂肪细胞或其前体的第一细胞样本与一种FGF接触并检测细胞的分化和/或增殖；将选自前脂肪细胞或其前体的第二细胞样本与一种试剂和所述FGF接触，并检测细胞的分化和/或增殖；比较第一细胞样本的分化和/或增殖与第二细胞样本的分化和/或增殖。在这些实施方案中，化合物通过刺激FGF与FGFR的结合、通过刺激FGFR的磷酸化、通过刺激FGFR和HSPG的结合、通过刺激FGF与CFR的结合、通过刺激FGFR二聚化或通过刺激FGF/FGFR相互作用的上游或下游信号途径激活FGF信号途径。
在还有其他实施方案中，刺激脂肪形成的试剂激活FGF信号传输途径，这是通过以下方式测定的用一种激活该信号途径的试剂对动物模型和人给药，并检测动物对该试剂的反应。在这些实施方案中，所述方法可采用前文所述的试剂，可检测动物在恶病质或局部脂肪缺乏疾病的治疗和预防中刺激脂肪形成的情况。
本发明还有另外一个方面提供了生产在脂肪相关疾病中调节脂肪形成的试剂的方法。这些方法通常包括如上文广泛描述的，测试一种可能能调节FGF信号途径的试剂；在调节能力检测呈阳性的基础上合成所述试剂。相应的，所述方法进一步包括衍生该试剂并将衍生物与药学上可接受的载体和/或稀释剂任意配伍，以提高所述试剂治疗或预防肥胖相关疾病的功效。
本发明的另一个方面，提供了为患者检测脂肪相关疾病或诊断其风险的方法。这些方法通常包括测定来自患者的生物样本中参与FGF信号途径的异常基因或参与FGF信号途径的基因的异常表达产物的存在，其中所述异常基因或异常表达产物与疾病的存在或患病风险相关。
在有些实施方案中，异常基因选自异常的Fgf基因和异常的Fgfr基因。在其他实施方案中，异常表达产物选自异常的Fgf表达产物和异常的Fgfr表达产物。
本发明还有另外一个方面包括为患者检测脂肪异常增生相关疾病或诊断其发病风险。这些方法通常包括测定来自患者生物样本中的参与FGF信号途径的异常基因或参与FGF信号途径的基因的异常表达产物的存在，其中所述的异常基因或异常表达产物与疾病的存在或发病风险相关。与脂肪异常增生相关的疾病包括但不仅限于肥胖症或诸如脂肪瘤和脂肪过多症的脂肪形成局部异常增加疾病。
本发明的另外一个方面提供了为患者检测脂肪异常增生相关疾病或诊断其患病危险度的方法。这些方法通常包括测定细胞内参与FGF信号传输途径的基因表达产物的水平或功能活性，这些指标与该表达产物的正常(如不肥胖的)参照水平或功能活性存在差异。在有些实施方案中，所述方法包括测定一条选自Fgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpa、Plcγ2、Igfbp-3和Igfbp-6的基因表达产物的水平或功能活性的提高或加强。在其他实施方案中，所述方法包括测定一条选自Fgf-1、Fgfrγ-3、Igf-2、Irs-2、Pi3激酶和Pkcθ的基因表达产物的水平或功能活性的降低。在这些实施方案中，所述细胞是前脂肪细胞或其前体。
在其他实施方案中，所述方法包括测定一条选自Fgf-1和Fgf-2基因表达产物的水平或功能活性的提高或加强。在这些实施方案中，所述细胞是微血管内皮细胞。
本发明的另外一个方面包括肥胖症或脂肪形成局部异常增加疾病中抑制或降低脂肪形成的方法。这些方法通常包括在需要此类治疗时给患者服用抑制脂肪形成有效剂量的、如前文广泛描述的削弱或干扰FGF信号途径的试剂和任意药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明还有一个方面包括治疗或预防恶病质或局部脂肪缺乏疾病的方法。这些方法通常包括在需要此类治疗时给患者服用增强脂肪形成有效剂量的、如前文广泛描述的刺激FGF信号途径的试剂和任意药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明还有一个方面提供了如前文广泛描述的试剂在制备用于治疗或预防脂肪相关疾病的药物方面的应用。
图1.FGF信号途径示意图。
图2.从人体脂肪组织中分离微血管内皮细胞(MVEC)和前脂肪细胞(PA)的方法的示意图。DPBS去离子化的磷酸盐缓冲液；RT室温；HBSSHank平衡盐溶液；FCS胎牛血清；EC内皮细胞；PECAM-1血小板-内皮细胞黏附分子1。
图3.脂肪组织来源的微血管内皮细胞(MVEC)形态照片。A分离自人体脂肪组织的MVEC相差显微照片。注意细胞典型的鹅卵石形态及显著的、中央分布的细胞核。B血管性假血友病因子(von Willebrand’s因子，vWF)免疫细胞化学染色显示显著的核周边细胞质染色。CPECAM-1(血小板-内皮细胞黏附分子1)免疫细胞化学染色显示与胞质膜表达相一致的交接区染色(junctional staining)。B和C中细胞核用碘化丙啶对比染色。(图中比例尺代表10μm，原始放大倍数为200倍)。
图4.免疫印迹分析照片显示，FGF-1在脂肪来源的微血管内皮细胞(MVEC)和3T3-L1脂肪细胞中(3T3-L1成纤维细胞中的表达也得到显示)高表达。在人前脂肪细胞(PAs)(+/-FGF-1)和脂肪细胞中未检测到FGF-1蛋白。RT-PCR分析验证了这些表达图谱。
图5.以图表形式显示人前脂肪细胞(PA)在FGF-1和FGF-2应答中增殖水平的明显提高(FGF-1对细胞增殖的影响大于FGF-2)。
图6.以图表形式显示人前脂肪细胞(PA)在FGF-1和FGF-2应答中分化水平的明显提高(FGF-1对细胞分化的影响大于FGF-2)。
图7.以图表形式显示了FGF-1和FGF-2组合作用的效果。结果显示，无论FGF-1还是FGF-2，在复制或分化过程中均能促进脂肪形成，且FGF-1在复制和分化中的促脂肪形成作用是独立的和累加的。BRL是指罗格列酮；括号表示重复处理。
图8.照片显示采用含血清培养基(SCM)(添加了胰岛素，并在前3天添加了地塞米松和罗格列酮)的采用3T3-L1分化方案的人前脂肪细胞(PAs)的分化。A栏显示在分化之前的增殖过程中未与FGF-1接触的前脂肪细胞。B栏和C栏分别表示在已存在FGF-1的情况下增殖6周并随后在SCM中分化的皮下(S)和网膜(0)前脂肪细胞。这是人前脂肪细胞在血清存在的情况下分化的首次报道。(比例尺代表10μm)。
图9.用表格表示2个独立的基因芯片实验结果。这些基因芯片实验比较了在包含和不含FGF-1的含血清培养基中生长至融合浓度的人前脂肪细胞中的基因表达。如果表达水平始终(CV＜5％)提高或降低至少50％，就认为基因表达受FGF-1的影响。
图10.照片显示PLCγ2是FGFR信号转导中重要的胞内分子。免疫印迹分析和免疫荧光均证实，相对于未与生长因子接触的细胞，在FGF-1存在情况下，生长至融合浓度的人前脂肪细胞中PLCγ2的表达得以提高。免疫荧光数据同时表明，PLCγ2的表达在融合浓度(分化诱导发生阶段)下基本不受调控。(比例尺代表10μm)。
图11.以图表形式显示了抑制PLCγ2明显降低FGF-1诱导的前脂肪细胞的分化。
图12.以图表形式显示了抗FGF-1中和抗体阻断FGF-1诱导的人前脂肪细胞复制。
图13.以图表形式显示FGFR信号转导途径的抑制对FGF-1介导的人脂肪形成具有显著影响。
发明内容
1.定义除另有定义，这里采用的所有科技术语与本发明所属领域一般技术人员所通常理解的具有相同意义。虽然任何与这里描述的相似或等价的方法和材料均可用于本发明的实行或测试，对优选的方法和材料进行了描述。为了说明本发明的意图，下面对下述术语进行定义。
这里所用的“一种”、“一个”和“一条”是指一个或一个以上(即至少一个)语法对象。举例来说，“一个元件”指一个或一个以上元件。
“一条属于相同调控或生物合成途径的基因”是指一条基因，其表达产物能调节或以其他方式影响FGF或FGFR蛋白水平和/或Fgf或Fgfr转录水平。例如，一条与Fgf属于相同调控途径的基因可以编码一个Fgf/FGF的上游调控物，或一个Fgf/FGF的下游调控标靶，而不是Fgf/FGF。除此之外，一条与Fgfr基因属于相同调控或生物合成途径的基因包括直接或间接调节Fgfr基因表达的基因以及作为FGFR激活的信号转导分子的基因。本领域内所公知的，这些信号分子参与FGFR激活过程的信号传递或介导FGFR激活的效应。它们与其他分子一起参与磷脂酶C(PLC)-γ、Crk、SNT-1/FRS2和/或Src信号途径。
这里所采用的术语“异常的多核苷酸”是指一条通过至少一个核苷酸的置换、删除或添加而区别于“正常”参照的，并与包括与非肥胖的基准值相比脂肪形成速度有所提高在内的脂肪形成缺陷或其风险相关联的多核苷酸。
术语“异常多肽”是指一条通过至少一个氨基酸残基的置换、删除或添加而区别于“正常”参照的，并与包括与非肥胖的基准值相比脂肪形成速度有所提高在内的脂肪形成缺陷或其风险相关联的多核苷酸。
“扩增产物”是指通过核酸扩增技术产生的核酸产物。
“抗原结合分子”是指具有针对靶抗原的结合亲和力的分子。需要理解，这一术语延伸至免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和具有抗原结合活性的非免疫球蛋白来源的蛋白质结构。
“抗原性或免疫原性活性”是指将按照本发明的多肽、片段、变异体或衍生物对动物(适宜地是哺乳动物)给药后，在动物体内产生抗原性或免疫原性反应的能力，其中反应包括产生与所述多肽或其片段特异性结合的成分。
“生物活性片段”是指保留了亲本多肽活性的全长亲本多肽的一个片段。如这里所采用的，术语“生物活性片段”包括缺失变异体和构成亲本多肽活性的小肽，例如包含至少6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，45，50个相连的氨基酸残基的小肽。此类肽可以通过采用常规的核酸重组技术获得或通过常规的液相或固相合成技术合成。例如，可以参考关于液相合成或固相合成的描述，如Blackwell ScientificPublications出版的Nicholson主编的《合成疫苗》(Synthetic Vaccines)一书中由Atherton和Shephard撰写的第9章《肽的合成》(Peptide Synthesis)。除此以外，肽可以通过诸如内切蛋白酶Lys-C、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Glu-C和葡萄球菌V8蛋白酶等蛋白酶消化本发明中的多肽获得。消化后的片段可以通过如高效液相(HPLC)技术等进行纯化。
这里所用的术语“生物样本”是指来自患者的可以是经提取的、未经处理的、经过处理的、稀释的或浓缩的样本。适宜的生物样本是组织的活体切片，更优选的是来自皮下或网膜的组织活体切片。
“恶病质”是指低于正常脂肪标准的临床状况，可能伴有或不伴有营养不良或普通的健康状况不良，并可能是一种或多种病理的继发状态。术语恶病质延伸包括但不仅限于以下疾病癌症恶病质、氟中毒恶病质、垂体性恶病质、垂体功能缺失性恶病质、疟疾恶病质、汞中毒恶病质、垂体恶病质、铅中毒恶病质、肾上腺机能障碍恶病质、尿毒症恶病质或局部脂肪缺失症状。
在本说明书全文中，除了上下文另有要求以外，“包括”、“包含”应理解为意味着包含指明的步骤或元素或步骤或元素的组合，但不排除任何其他步骤或元素或步骤或元素的组合。
这里所用的短语“脂肪形成局部异常增加”包括其特征在于和/或导致有限范围内脂肪组织堆积的、与解剖学意义上的局部非受控脂肪形成相关的病理。这样的病征包括但不仅限于脂肪瘤和脂肪过多症。
“局部脂肪组织缺乏”是指解剖学意义上限制的脂肪组织不足，可以由引起皮下脂肪组织缺失的身体创伤、热烧伤或化学烧伤、脂肪营养不良或萎缩性病症与其他因素引起。这里所采用的术语“脂肪营养不良”是指任何与导致先天或后天获得的部分或全部皮下脂肪缺失的脂肪营养不良相关的或以之为特征的病理状态。这样的病理状态包括先天性一般脂肪营养不良、先天进行性脂肪营养不良、普通脂肪营养不良、惠普尔病(Whipple’s disease)、局部脂肪营养不良、进行性脂肪营养不良和全身性脂肪营养不良。这里所采用的术语“萎缩性病症”是指与包括脂肪组织在内的身体组织的解剖学上的局部或全身性的减少或消耗相关的，和/或以之为特征的病症。除其他因素以外，其原因可能包括中枢和/或周围神经系统的损伤、静止和/或无能力。这样的萎缩性病症包括但不仅限于浆液性萎缩、脊髓性肌萎缩、关节周肌萎缩、压迫性萎缩、神经性萎缩、废用性萎缩、内分泌性萎缩和老年萎缩。
“相应”是指(a)具有与参照多核苷酸序列的全部或部分充分相同或互补序列的或编码的氨基酸序列与一条肽或蛋白的氨基酸序列相同的多核苷酸；或(b)具有与参照肽或蛋白的氨基酸序列充分相同的氨基酸序列的肽或多肽。
“衍生物”是指源自基础序列的、通过修饰(如通过与其他化学成分结合或形成复合物，或通过如本领域已知的翻译后修饰技术)的多肽。术语“衍生物”在其范围内也包括在亲本序列上已作出的包括提供功能等同分子的添加或缺失的改造。
这里所用的术语“分化潜能”是指前脂肪细胞针对能促进其功能成熟为脂肪细胞的信号的反应能力或反应强度。可以观察到一种待测分子使“分化潜能提高”，例如，在充足时间和适宜条件下前脂肪细胞与所述待测分子共培养导致该前脂肪细胞对分化诱导剂的反应增强，这可以由正在分化的前脂肪细胞数量的增加或前脂肪细胞分化速度的提高及其他方式进行观察。
“有效剂量”在活性调节或治疗或预防一种病症的上下文中是指该剂量的活性组分以单一剂量或系列给药的一部分给需要这样的调节、治疗或预防的个体服用，对于该作用的调节或对该症状的治疗、预防或改善是有效的。对于受脂肪形成局部异常增加病症困扰的个体而言，这样的改善的非限制性的实例包括脂肪堆积降低、无脂肪增加、体重减轻及心血管疾病和糖尿病相关症状的改善。对于受恶病质和局部脂肪缺失病症困扰的个体而言，这样的改善的非限制性的实例包括脂肪堆积增加、体重增加及萎缩性病症相关症状的改善。有效剂量随着所针对个体的健康和生理状况、所针对个体的分类学组、组分的配方、药物状况的评估及其他相关因素而改变。预计该剂量值处于可通过常规实验测定的相对宽泛的区间内。
如这里所采用的，术语“功能”是指生物的、酶的或治疗的功能。
“功能性Fgf多核苷酸”或“功能性FGF多肽”是指不含结构或功能缺陷的、并与包括提高或削弱脂肪形成在内的脂肪形成缺陷或其风险无关的Fgf多核苷酸或FGF多肽。
这里所用的术语“基因”是指细胞基因组任何全部离散的编码区域及与之相连的非编码和调控区域。基因也用于表示编码特定多肽的开放读框、内含子及参与表达调控的邻接的5’和3’非编码核酸序列。在这一点上，基因可以进一步包括诸如启动子、增强子、终止和/或多聚腺苷化信号等与所述基因相连的天然控制信号或外源控制信号。DNA序列可以是cDNA或基因组DNA或它们的片段。基因可以导入适当的载体用以游离保存于染色体外或用以整合入宿主。
这里所用的“杂交”表示互补核酸序列的配对以形成DNA-DNA杂合体或DNA-RNA杂合体。互补碱基序列是指那些通过碱基配对原则联系起来的序列。在DNA中，A与T配对，C与G配对。在RNA中，U与T配对，C与G配对。在这一点上，这里所用的术语“匹配”与“错配”是指互补核酸链中配对核苷酸的杂交潜能。配对核苷酸有效地杂交，如上面提到的经典的A-T和G-C碱基对。错配指不能有效杂交的其他核苷酸组合。
这里提及的“免疫相互作用”包括涉及的任何相互作用、反应或其他形式的分子间联合，尤其是其中一种分子是(或者模拟)免疫系统的一个组分。
“分离的”是指充分地或基本地与其天然状态下通常伴随的组分分开了的材料。
“调节”是指或直接或间接地提高或降低靶分子的水平或功能活性。例如，一种试剂可以通过与不同于靶分子的一种分子相互作用间接地调节靶分子的水平/活性。在这一点上，编码目标多肽的基因的间接调节在其范围内包括第一个核酸分子表达的调节，这一核酸分子的表达产物调节编码目标多肽的核酸分子的表达。
这里所用的术语“肥胖症”包括体内脂肪组织过度积累所导致的超出生理需求的体内脂肪的增加的病症。术语肥胖症包括但不仅限于下列病症成年期肥胖症、食饵性肥胖症、内源性或代谢肥胖症、内分泌肥胖、家族性肥胖、胰岛功能亢进性肥胖、脂肪细胞增殖型-肥大型肥胖症、性腺机能减退型肥胖、甲状腺机能减退型肥胖、终身肥胖、病态肥胖和外源性肥胖。
术语“肥胖的治疗”包括治疗由肥胖引发的病症，包括但不仅限于心血管病、动脉硬化、高血压、肥胖性心肺功能不全综合征(Pickwickian syndrome)以及糖尿病。
“取自”是指诸如多核苷酸提取物或多肽提取物的样本分离自或源自宿主的独特的来源。例如，提取物可取自直接分离自宿主的组织或体腔。
这里所采用的术语“寡核苷酸”是指由多样的核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或相关的结构变异体或它们的合成类似物)通过磷酸二酯键(或相关的结构变异体或其合成类似物)相连构成的聚合体。因而，虽然术语“寡核苷酸”通常是指由核苷酸残基及其联接天然形成的核苷酸聚合体，应该理解该术语在其范围内也包括包含但不仅限于肽核酸(PNAs)、氨基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、2-0-甲基核糖核酸及其他不同的类似物。所述分子的确切大小可以随具体应用而改变。寡核苷酸通常相对较短，通常包含10到30个核苷酸残基，该术语可以表示任意长度的分子，虽然一般采用术语“多核苷酸”或“核酸”来表示大的寡核苷酸。
“以可操作方式连接”是指转录和翻译调控多核苷酸相对于多肽编码多核苷酸的这样一种定位方式，这种方式可以转录所述多核苷酸及翻译所述多肽。
术语“患者”是指人或其他动物来源的患者并包括任何需要用本发明所述的方法进行检测或治疗的个体。然而需要理解，“患者”并不意味着症状已经显现。本发明的范围所包括的动物包括但不限于灵长类、家畜(如绵羊、奶牛、马、驴、猪)、实验室实验动物(如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、宠物(如猫、狗)和捕获的野生动物(如狐狸、鹿、野狗、鸟类和爬行动物)。
“药学上可接受的载体”是指固体或液体填充剂、稀释剂或胶囊包被的、可以对哺乳动物局部或全身安全给药的试剂。
这里所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语通常指长度大于30个核苷酸残基的寡核苷酸。
术语“多核苷酸变异体”和“变异体”是指与一个参照多核苷酸序列具有充分序列相同性的多核苷酸或能在如本领域所知的严格条件下(参见Sambrook等所著《分子克隆实验手册》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Press，1989)与一个参照序列杂交的多核苷酸。这些术语还包括添加了或删除了或用不同的核苷酸替代了一个或多个核苷酸的多核苷酸。在这一点上，本领域内熟知的是，对一条基准多核苷酸可以进行包括突变、添加、删除和置换在内的某些改变，而改变后的多核苷酸保持该基准多核苷酸的生物功能或活性。术语“多核苷酸变异体”和“变异体”还包括自然产生的等位基因变异体。
这里可交替使用的“多肽”、“肽”和“蛋白”是指氨基酸残基的聚合体及其变异体和合成类似物。因而，这些术语用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的、非天然生成的氨基酸(如相应的天然氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合体以及天然存在氨基酸的聚合体。
术语“多肽变异体”是指其中一个或多个氨基酸被不同的氨基酸取代的多肽。本领域内所熟知的是，如这里随后所描述的，一些氨基酸可以替换为其他性质大体相似的氨基酸而不改变所述多肽的活性本质(保守性置换)。这些术语还包括其中添加了或删除了或以不同氨基酸替代了一个或多个氨基酸的多肽。
“引物”是指当其与单链DNA配对时，能够在合适的聚合化试剂存在的情况下启动引导延伸产物合成的寡核苷酸。所述引物为实现最高扩增效率优选单链，但也可以是双链的。为在聚合化试剂存在的情况下引导延伸产物的合成，引物必须足够长。引物长度取决于许多因素，包括具体应用、所用温度、模板反应条件、其他试剂和引物来源。例如，依赖于靶序列的复杂程度，寡核苷酸引物通常包含15到35个或更多的核苷酸残基，虽然也可能包含更少的核苷酸残基。引物可以是巨大的多核苷酸，如包含从大约200个核苷酸至几千个碱基或更多。可以选择为与模板杂交设计的、与模板上的序列“充分互补”的引物并作为合成的启动位点。“充分互补”是指引物充分互补以与目标多核苷酸杂交。优选的引物不包含与设计与之杂交的模板的错配，但这不是必需的。例如，可以在引物的5’末端附加非互补核苷酸残基，其余的引物序列与模板互补。作为另一种选择，非互补核苷酸残基或一段非互补核苷酸残基可能散布在引物中，假如引物序列同与其杂交的模板序列充分互补并从而形成该引物延伸产物的合成所需的模板。
“探针”是指与特异性序列或亚序列或其他分子的一部分相结合的分子。除另有指示以外，术语“探针”通常是指通过互补碱基配对与通常称为“靶多核苷酸”的另一条多核苷酸结合的多核苷酸探针。取决于杂交条件的严格程度，探针能同与其并不完全序列互补的靶多核苷酸结合。能直接或间接对探针进行标记。
这里所用的术语“重组多核苷酸”是指通过将一条多核苷酸处理为通常自然界中未被发现形式的手段在体外形成的多核苷酸。例如，重组多核苷酸可以是表达载体的形式。通常，这样的表达载体包含以可操作方式与多核苷酸连接的转录和翻译调控多核苷酸。
“重组多肽”是指运用重组技术(如通过重组或合成多核苷酸表达)获得的多肽。
本说明书中所用的“报道分子”是指这样一种分子，按其化学性质提供可供分析的可辨识信号，该信号可用于检测包含抗原结合分子及其目标抗原的复合物。术语“报道分子”还延伸至使用细胞凝集或凝集抑制(如乳胶珠上的血红细胞)及其他方式。
“载体”是指能在其中插入或克隆多核苷酸的多核苷酸分子，优选的是DNA分子来源的，例如，来源于质粒、噬菌体、酵母或病毒的。载体优选地包含一个或多个唯一的限制性位点并能在限定的、包括靶细胞或组织或祖细胞或其组织在内的宿主细胞中自主复制，或可与限定宿主的基因组整合，这样，克隆的序列可被复制。因而，载体可以是自主复制载体，也就是载体以游离于染色体外的实体形式存在，其复制独立于染色体复制，例如，线性或闭合的环状质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含任何用以确保自我复制的工具。作为另外一种选择，载体可以在导入宿主细胞时整合入基因组并与整合后的染色体共同复制。载体系统可以包括单独的载体或质粒、两个或更多载体或质粒，它们共同包含导入宿主细胞基因组的总DNA或转座子。载体的选择通常取决于载体与载体所导入的宿主细胞的兼容性。在本发明中，载体优选地是病毒的或病毒来源的载体，其在动物细胞和优选的哺乳动物细胞中以可操作方式发挥功能。这样的载体可以来源于痘病毒、腺病毒或酵母。所述载体可以还包含如可用于挑选合适的转化株的抗生素抗性基因的选择性标记。这样的抗性基因的例子是精通本领域的技术人员所知的，包括具备抗生素卡那霉素和G418(Geneticin)抗性的nptll基因和具备抗生素潮霉素B抗性的hph基因。
可交替使用的术语“野生型”和“正常的”是指物种的大部分成员中天然存在的特有的表现型，并例如与突变型的表现型形成对照。
如这里所采用的，下划线或斜体的基因名称表示基因，与其蛋白产物形成对比是，蛋白产物用不加任何下划线或斜体的基因名称表示。例如，“Fgf-1”表示Fgf-1基因，而“FGF-1”表示“Fgf-1”基因的蛋白产物或由“Fgf-1”基因的转录和翻译和选择性剪接生成的产物。
2.调节脂肪形成的方法本发明是部分建立在前脂肪细胞复制过程中MVEC在培养基中的存在能增强体外的前脂肪细胞分化成脂肪细胞(脂肪形成)，并能通过在不含MVEC的培养基中添加FGF-1或FGF-2重复这一效果这样的发现基础上的。不希望束缚于任何具体的理论或作用模式，本发明发明人认为，通过MVEC(或者可能其他细胞类型)的FGF-1和FGF超家族其他成员的体内生成激活邻近前脂肪细胞上的FGF受体，这一过程直接或间接地促进细胞分化成为脂肪细胞。此外，本发明的发明人发现了FGF-1促进人前脂肪细胞的复制(比IGF-1、FGF-2或血清单独作用更有效)以及在复制阶段中用FGF-1处理人前脂肪细胞显著提高其随后的分化潜能(亦即“引发”作用)。本发明人进一步证实了在分化过程中用TZD(噻唑烷二酮)处理能显著提高这种FGF-1的“引发”作用，这说明FGF-1不是PPARg(过氧化物酶体增生物激活受体g)配体。还发现人前脂肪细胞不生成FGF，FGF的中和抗体能阻断FGF-1的促增殖作用。因此可以认为，FGF信号途径(特别是FGF-1或FGF-2信号途径)的调节物可与其他试剂一同用于包括但不限于肥胖症、脂肪形成局部异常增加症、恶病质和局部脂肪缺失症等脂肪组织相关病症的治疗或预防以及过度脂肪形成和脂肪形成不足的研究。
因此，本发明提供了调节脂肪形成的方法，该方法包括在足以调节FGF信号途径(特别是FGF-1或FGF-2信号途径)的条件下将细胞与一种试剂接触一段时间。FGF信号途径的代表成员包括FGF(特别是FGF-1和FGF-2)、FGFR(如FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4和FGFR-5，特别是FGFR-1，FGFR-2，FGFR-3和FGFR-4)，HSPG(如多配体蛋白聚糖-1，多配体蛋白聚糖-2，多配体蛋白聚糖-3，多配体蛋白聚糖-4，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6，基底膜蛋白多糖和β-glycan)、CFR、SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK途径成员(如SHC，Crk，FRS2(FGFR底物2，也被称为SNT-1)，Src，FAK，Nek，Shb，SHP2，GRB-2，SOS，80K-H，pp66，Gab1，P38 MAPK(ERK)，PI3K，AKT，PKB，RAS，RAF，ERK1，2，MAPKKK(RAF-1)，MAPKK(MEK)，MAPK，Jun，Fos，FPPS(法呢基焦磷酸合成酶))，PLCγ-PKC-Ca2+途径成员(如PLCγ(磷脂酶Cγ)，Fes，PIP2，DAG(甘油二酯)，花生四烯酸，Ca2+离子通道，Ca2+离子，IP3(1，4，5三磷酸肌醇)，CaM激酶(Ca2+/钙调素依赖型激酶)，PKC(蛋白激酶C)，PKA(蛋白激酶A)，cAMP，CREB，CBP(CREB结合蛋白)，FGF-1核转移途径成员(如STAT-1和STAT-3)，FGF的细胞内结合伴侣(诸如但不限于P34和FIF(FGF相互作用因子))和FGFR细胞内结合伴侣(诸如STN-2以及包括剪接体在内的其变异体)。
按照本发明，一种试剂能以产生FGF(特别是FGF-1和/或FGF-2)的细胞或作为FGF信号目标的细胞作为目标。因而，在一些实施方案中，所述细胞是MVEC或MVEC前体，而在其他实施方案中，所述细胞是前脂肪细胞或前脂肪细胞前体。
在以FGF生成细胞作为所述试剂的作用对象的实施方案中，所述试剂相应地调节Fgf基因(如Fgf-1，Fgf-2)的表达或其表达的上游调控子或这些基因表达产物的水平或功能活性。在这些实施方案中，通过增强Fgf基因表达或其表达产物的水平或功能活性，或取决于调控子是否是Fgf基因或其表达产物的抑制子或激活子，通过增强或降低调控子基因的表达或其表达产物的水平或功能活性，刺激脂肪形成。相反的，通过降低或阻断Fgf基因表达或其表达产物的水平或功能活性，或取决于调控子是否是Fgf基因或其表达产物的抑制子或激活子，分别通过增强或降低调控子基因的表达或其表达产物的水平或功能活性，降低或阻断脂肪形成。
在以FGF靶细胞作为所述试剂作用对象的实施方案中，所述试剂调节Fgfr基因(如Fgfr-1，Fgfr-2，Fgfr-3，Fgfr-4，Fgfr-5，特别是Fgfr-1，Fgfr-3，Fgfr-4)，或与该Fgfr基因属于相同调控或生物合成途径的基因(例如，如以上所述的属于FGF信号途径的基因)，或其表达受Fgf基因表达产物直接或间接调节的基因(如PPARγ，IGFBP-3，IGFBP-6，IGF-2，IRS-2，PI3激酶，PKCθ)的表达，或激活或刺激与FGF(如FGF-1或FGF-2)相互作用的FGFR或CFR的功能。在这些实施方案中，通过增强Fgfr基因的表达或其表达产物的水平或功能活性，或通过增强FGF信号途径组分的表达，或通过增强、促进或以其他方式使FGFR和FGF之间或CFR和FGF之间相互作用，或通过刺激FGFR的二聚化和/或磷酸化，刺激脂肪形成。相反的，通过拮抗FGFR或CFR的功能，包括抑制或阻断FGFR和FGF之间或CFR和FGF之间的相互作用，或通过抑制或阻断HSPG和FGFR之间的相互作用，通过阻碍FGFR磷酸化，通过干扰FGF/FGFR或FGF/CFR相互作用的上游或下游信号途径组分，或通过阻碍FGFR二聚化，降低或抑制脂肪形成。
因此，当需要降低脂肪形成时，所述试剂用于降低或削弱前脂肪细胞的脂肪形成潜能，例如，包括在肥胖症或脂肪形成局部异常增加症的治疗中降低或削弱脂肪细胞的形成。这样的治疗方法所关注的病症包括与肥胖相关的或肥胖引起的病理，例如动脉硬化、高血压、糖尿病和其他内分泌或代谢疾病或病症。脂肪形成局部异常增加症可以包括脂肪肿块(脂肪瘤和脂肪肉瘤)和脂肪过多症。作为另外一种选择，当需要提高脂肪形成时，所述试剂用于增强脂肪形成，例如，包括在与恶病质相关病症或局部脂肪缺失症中提高脂肪沉积。
降低或阻断基因表达的合适的试剂包括但不限于寡核糖核苷酸序列，包括反义RNA和DNA分子和酶性核酸，其作用在于抑制例如编码FGF或FGFR的mRNA的翻译。反义RNA和DNA分子的作用是通过与目标mRNA结合并阻碍蛋白翻译的方式直接妨碍mRNA的翻译。关于反义DNA，优选的是来源于翻译起始位点的(例如位于-10和+10区域之间的)寡脱氧核糖核苷酸。
酶性核酸是具有酶活性的RNA分子，能催化RNA的特异性裂解。酶性核酸的作用机理包括酶性核酸分子与互补的靶RNA序列特异性杂交，随后发生内切核苷酸裂解。遗传工程改造的、特异高效地催化靶序列内切核苷酸裂解的锤头状酶性核酸分子包含在本发明范围以内。任何可能的RNA靶分子中的酶性核酸特异性裂解位点最初通过对靶分子上酶性核酸切割位点的扫描进行鉴别，这些切割位点包括下列序列GUA、GUU和GUC。一旦完成鉴别，对应于靶基因包含切割位点的区域的介于15到20个核糖核苷酸的短RNA序列可进行预测结构特征(诸如可能造成寡核苷酸序列不合适的二级结构)的评估。候选靶基因的合适性也可以采用核糖核酸酶保护检测法通过检测其与互补的寡核苷酸的杂交可达性进行评估。
反义RNA和DNA分子和酶性核酸均可用任何RNA合成领域内所知的方法制备。这些方法包括本领域内所熟知的诸如固相亚磷酰胺化学合成等化学合成寡脱氧核糖核苷酸技术。作为另一种选择，RNA分子可以通过编码反义RNA分子的DNA序列的体内或体外转录产生。这样的DNA序列可以组合入多种包含合适的RNA聚合酶启动子(如T7或SP6聚合酶启动子)的载体中。作为另一种选择，组成型或诱导型(取决于所用的启动子)合成反义RNA的反义cDNA结构可以稳定地导入细胞系中。
可以采用多种DNA分子的修饰手段，作为提高细胞内稳定性和半衰期的方法。可能的修饰包括但不限于在所述分子的5’或3’末端添加核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸构成的侧翼序列，或在寡脱氧核糖核苷酸骨架中采用硫代磷酸或2-O-甲基而不是磷酸二酯酶联接。
作为另一种选择，介导靶基因或基因转录本的RNA干扰(RNAi)的RNA分子可用于降低或阻断基因表达。RNAi是指通过引入与靶基因转录本同源的单链的、通常是双链的RNA(dsRNA)干扰或破坏靶基因产物。因而，在一些实施方案中，对应于至少一部分靶基因的dsRNA本身、特别是产生dsRNA的结构可被用于降低或阻断靶基因的表达。RNAi介导的基因表达抑制可以采用本领域所报道的任何技术实现，例如通过将编码茎-环结构或发夹结构RNA的核酸结构转染进入靶细胞基因组，或通过从收敛的启动子之间表达转染的具有与靶基因同源性的核酸结构，或从一个单独启动子后以头部对头部或尾部对尾部方式重复。可以采用任何类似结构，只要其产生具备自身折叠能力并形成双链RNA(dsRNA)的单独RNA，或只要产生两个独立的、随后退火形成与靶基因具有同源性的dsRNA的RNA转录本。
RNAi并不要求绝对同源性，其已有描述的较低的临界值对于约由200个碱基对组成的dsRNA而言约为85％同源性(Plasterk和Ketting，2000，Current Opinion inGenetics and Dev.10562-67)。因此，取决于dsRNA的长度，RNAi编码核酸所包含的针对靶基因转录本的同源水平可以发生改变，也就是说，对于100到200碱基对的dsRNA而言，具备与靶基因至少85％同源性，而更长的dsRNA，亦即由300到400碱基对的，具备与靶基因至少75％同源性。表达针对与分别表达的RNA退火而设计的单一RNA转录本的RNA编码结构，或从收敛的启动子表达单独转录本的单个结构优选地至少包含100个核苷酸。表达针对通过内部折叠形成dsRNA而设计的单一RNA的RNA编码结构优选地至少包含200个核苷酸。
为表达dsRNA形成结构所采用的启动子可以是任何类型的启动子，只要最终的dsRNA特异性针对所需破坏细胞系中的基因产物。作为另一种选择，启动子可以是谱系特异性的，亦即其只在特殊发育谱系的细胞中表达。这在与非目标细胞谱系中表达的基因具有一些同源性重迭的情况下可能具有优势。启动子还可以是由外界控制因素或细胞内环境因素诱导的。
在其他实施方案中，如Tuschl等在申请号为No.20020086356的美国专利中所述，约21到约23个核苷酸的、直接裂解与其相应的特异mRNA的RNA分子可被用于介导RNA干扰。这样的21-23核苷酸的RNA分子可以包含3’羟基基团，可以是单链或双链的(两条21-23核苷酸的RNA)，这里的双链RNA分子可以是平末端的或含粘性末端的(如5’，3’)。
按照本发明，FGF信号途径的多个阶段可以作为调节脂肪形成的目标。在一些实施方案中，FGF的水平或浓度是目标作用对象。因此，通过采用例如R&D systems公司的AF232(R&D Systems Inc.Minneapolis，MN)等商业提供的或如Cancer Res 1988.484266中所公开的抗FGF抗原结合分子(如中和抗体)，可以降低FGF(特别是细胞外FGF)的水平或功能活性。
在其他实施方案中，FGF-FGFR结合或激活是目标作用对象。例如，通过FGFR的过量表达、或通过促进FGFR在没有配体存在条件下二聚化/寡聚化并随之组成型活化的突变，可以实现FGFR信号的激活。作为另外一种选择，可以采用能诱导受体二聚化的非配体分子以产生类似的效果。受体突变还可以引起生物效果的分离，可用于“剪裁”FGF反应。
在其他实施方案中，FGFR信号传输的抑制或阻断通过降低FGFR表达、FGFR突变(尤其是磷酸化位点的突变，但不排除其它位点)、防止受体聚合、或采用通过阻断活性位点或相关基序干扰配体-受体相互作用的方法实现。这样的策略包括受体的封闭抗体和结合的小分子抑制剂。削弱受体磷酸化的药理学方法也可以是有效的。典型的FGFR拮抗剂包括可溶形式的FGFR，包括但不限于，例如，如在Oncogene 1991，61195和FASEB J 1992，63362中所公开的可溶的重组FGFR-1(IIIc)/Fc嵌合体、可溶的重组FGFR-2/Fc嵌合体和可溶的重组FGFR-3/Fc嵌合体。本发明也包括采用例如如Cancer Res 1988.484266中所公开的，具有不同阻断能力的FGFR拮抗的抗原结合分子。在其他实施方案中，例如如J Biol Chem 1992.26711307中所公开的，金属螯合剂(如EDTA或EGTA)可用于阻滞FGFR二聚化，FGFR结合肽可用于拮抗FGFR的活性或其活化(如Cell Growth and Diff.2001中所公开的FGFR730(p)Y)，以及IUBMB Life 2002.5467中公开的合成肽Ac-ValTyrMetSerProPhe-NH2。本发明也包括使用如TMPP(Cardiovascular Res 2002.53232)的FGF-2抑制剂和如PD161570(Life Sciences 1998.62143)的FGFR1酪氨酸激酶抑制剂。
在其他实施方案中，目标的作用对象是HSPG。在这一点上，已知的是，HPSG表达或类型的改变影响FGF信号传输，HPSG突变体(天然的或人工的)与FGF信号传输的调节相关联。例如，如在Simpson-Golabi-Behmel症中所观察到的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3上的突变与FGF-1信号传输上调相关联。多种非特异和特异的药理学方式可以降低HPSG表达，导致FGF信号传输的改变。这样的策略已在降低脂肪形成和肿瘤发育的努力中得到了发展。功能类似于HSPG(亦即能调控配体-受体复合物或其活性)的其他分子也能调节FGF信号传输。典型的HSPG拮抗剂包括但不限于八硫酸蔗糖(Mol Cell Biol 2002.227184)、苏拉明(J Mol Biol 1998.281899)、suradistas(J Mol Biol 1998.281899)、TNP-470(PNAS 2002.9910730)、血管抑素(PNAS 2002.9910730)、内皮抑素(PNAS 2001.9812509和Human Gene Therapy.2001.12347)、诸如PI-88的乙酰肝素酶抑制剂(Cancer Research 1999.593433)、硫酸麦芽六糖(Cancer Research 1999.593433)、肝素酶(J.Biol Chem 1997.27212415和J.Biol.Chem 1994.26932279)、类肝素酶(J.Biol.Chem 1994.26932279)和氯酸钠(J.Biol.Chem 1994.26932279)。
在还有其他实施方案中，目标的作用对象是FGF信号转导受体下游的组分。FGFR下游信号传输的调控能提高或降低FGF的特异性生物学作用。这样的策略也具备获得细胞特异性或组织特异性作用的潜力。同时，如上文所指出的，FGFR所利用的信号转导途径中的配体或受体经常不是唯一的，通过调节信号通路调控FGF信号传输已经得到了证实。SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK途径的典型的拮抗剂包括但不限于诸如calphostin C(Cal C)(J Biol Chem.1999 27418243)的PKC抑制剂、诸如PD 98059(PD)(Diabetes 2003.5243和JBC 1998.27332111)的MEK抑制剂、如Ly 294002(LY)(Cellular Signalling 2001.13363和J.Neurochem.2002.81365)的PI3-K抑制剂、如SB 202474(SB 474)(JBC 1998.27332111)的SB190对照化合物、SB203580(Diabetes 2003.5243和JBC 1998.27332111)、SB 202190(JBC1998.27332111)、12-0-十四烷酰佛波醇13-醋酸盐(TPA)(Oncogene 2002.211978)以及PD98059。作为另外一种选择，在这一点上，PLCγ-PI3K-PKC-Ca2+途径可以作为作用目标，许多研究工作支持这一途径上任何水平的抑制能干扰包括FGF信号传输在内的生长因子信号传输这一假设。本发明实际应用中所采用的典型抑制剂包括但不限于如U-73122(Calbiochem)的磷酯酶C抑制剂。
在还有其他实施方案中，目标的作用对象是CFR。在这些实施方案中，CFR的过表达会导致FGF-1和FGF-2胞内累积的减少。这样的策略能调控FGF作用，尤其通过调控假设的直接转录作用。
本发明也包括按照下文第三部分实施例中所描述的方法所鉴定的基因或表达产物抑制剂在上述方法中的应用。
可用于增强目标多肽活性的试剂包括任何合适的、能以如下文第三部分实施例中所公开的常规方法或用非人类动物模型鉴别或产生的诱导剂或稳定/激活试剂。在这种情况下，所述试剂可以包含目标多肽的至少一个生物学活性片段或编码全长目标多肽或其生物学活性片段的多核苷酸。典型的此类试剂包括FGFR或FGF抗原结合激活分子、Fgf多核苷酸或FGF多肽或其表达产物增强、促进或以其他方式使FGF和FGFR之间发生相互作用的多核苷酸、或这一多核苷酸的多肽表达产物。产生Fgf多核苷酸和FGF多肽的序列信息可在如GenBank和EMBL等公共数据库中获得。这样的分子可由精通本领域的技术人员采用常规技术容易地进行制造。
本发明的调节试剂能合适地影响或调节脂肪形成。因此，优选的测试对象细胞是产生FGF的MVEC或其祖细胞、或可以表达能被FGF激活的FGF受体的前脂肪细胞。前脂肪细胞是通过脂肪形成过程分化产生新的脂肪细胞的细胞类型。脂肪细胞的积累导致先于肥胖的脂肪增加，相反地，在没有脂肪形成情况下的脂肪过度消耗导致过低的脂肪储备，就象在恶病质或局部脂肪缺失症中所发生的情况。测试调节试剂对MVEC的作用的合适的检测方法包括但不限于在假定的FGF调节试剂或FGFR调节试剂存在的情况下与前脂肪细胞共培养。调节试剂抑制或刺激前脂肪细胞分化潜能的能力可以用培养的前脂肪细胞或在活体内通过用本发明中的分子对合适的动物模型给药进行检测。本发明的发明人建立了从接受选择性腹部手术的个体中获得网膜和皮下脂肪组织活体样本并用来自这样的活体组织材料的前脂肪细胞和MVEC进行细胞培养的系统。检测增殖和分化潜能的检测方法是本领域内所公知的。培养皮下和网膜前脂肪细胞，随后在存在或不存在假设的FGF或FGFR调节试剂的情况下与MVEC条件生长培养基接触。检测前脂肪细胞增殖与分化的检测方法也是本领域内所公知的。例如，增殖检测方法包括如与促增殖生长培养基接触后用甲化合物比色法(Promega)对前脂肪细胞进行细胞计数。前脂肪细胞分化潜能通过检测3磷酸甘油脱氢酶(G3PDH)酶活和甘油三酯的积累进行评定。
从事本领域的人员所熟知的活体内的评价手段可用于评价如这里所述的FGF信号途径调节试剂对前脂肪细胞分化为脂肪细胞的潜能的影响。这样的分化导致脂肪组织积累，检测患者体内脂肪组织总量的检测手段包括用皮厚度计检测皮褶厚度。这一检测方法包括综合来自合适部位(如三头肌、二头肌、肩胛下及上髂骨区域的)的皮褶厚度以获得身体脂肪百分比数值。其他的活体检测方法包括水下称重、生物电阻抗、双能X射线吸收测定和放射学造影(如CT或核磁共振造影)。
如这里所述的FGF信号途径调节试剂也可用于在发生脂肪储备严重损耗的病症(这里通常用术语恶病质和恶病质相关病症表示)中增强脂肪形成。其他的应用包括存在局部脂肪形成缺陷的病症的临床治疗。这样的病症包括脂肪营养不良以及物理创伤、烧伤或萎缩性疾病引起的脂肪组织的局部缺失。除其他原因以外，这样的病症可以源自肿瘤、心脏病、疟疾和晚期肾衰竭。本发明的方法可以预防或延缓与此类病理状态相关的脂肪组织消耗。
3.目标调节分子的鉴定本发明也公开了筛选包括调节基因表达或该基因表达产物的水平和/或功能活性等的调节FGF信号途径的试剂的方法，其中，所述基因选自Fgf基因、Fgfr基因、与Fgf基因或Fgfr基因、属于相同调控或生物合成途径的基因、或其表达产物调节(如促进、增强或使之能够；或抑制或削弱)FGF和FGFR之间相互作用的基因、或其表达直接或间接受控于Fgf基因表达产物的基因、或激活或拮抗与FGF相互作用的FGFR功能的基因。
在一些实施方案中，所述方法包括(1)将一种制品与一种待测试剂接触，其中所述制品包括(i)一条包含对应于FGF信号途径中一个多肽组分的至少一个生物学活性片段或其变异体或衍生物的氨基酸序列的多肽；或(ii)以可操作方式与报道基因相连的一条包含至少部分调控该组分的一个遗传序列的多核苷酸；以及(2)探测相对于不存在该待测试剂时，正常或参照水平和/或功能活性的所述多肽组分或所述报道基因表达产物的水平和/或功能活性的改变，这可说明所述试剂调节FGF信号途径。
本发明包括任何合适的探测、测量或以其他方式确定脂肪形成的调节(例如，如探测前脂肪细胞增殖和分化潜能)的检测方法。具有合适性质的检测方法对于精通本领域的技术人员而言是已知的，这样的实例在前文第二部分中进行了描述。
在本发明范围以内的调节试剂包括FGF信号途径的激动剂和拮抗剂，拮抗剂包括了如第二部分实例中所描述的抗原结合拮抗分子、肽段抑制剂、反义分子、酶性核酸、RNA干扰分子和共抑制分子、磷脂酶C抑制剂和激酶抑制剂。激动剂包括抗原结合激活分子、FGF信号途径组分或其生物学活性片段、变异体和衍生物、提高启动子活性或干扰负调控机制的分子和克服任何负调控机制的分子。
侯选试剂包括许多类化合物，然而典型地是有机分子，优选地是分子量大于50并小于约2500Da的有机小化合物。侯选试剂包含与蛋白在结构上相互作用所必需的功能基团，尤其是氢键，典型地包含至少一个胺基、羰基、羟基或羧基，优选地包含至少两个所述功能化学基团。侯选试剂经常包含代替一个或多个上述功能基团的碳环或杂环结构或芳烃或聚芳烃结构。侯选试剂也可以是生物分子，包括但不限于肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、它们的衍生物、结构类似物或其组合。
特别优选地是FGF多肽或FGFR多肽的小分子(非肽类)调节物。在这一点上，特别优选小分子是因为这样的分子口服后更易于吸收，含有更少的抗原决定簇，或比更大的、以蛋白为基础的药物更可能通过细胞膜。有机小分子也可以具备进入适当的细胞并影响基因表达(例如通过与参与基因表达的调控区或转录因子相互作用)的能力；或通过抑制或增强辅助分子的结合影响基因的活性。
除此以外，可利用或可便利地产生细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库。而且，天然的或合成手段产生的化合物和库能通过常规的化学、物理和生化手段便利地进行改进，也可用于生成组合化合物库。对已知的药理学试剂可进行定向的或随机的化学修饰，如酰化、烷化、酯化、氨基化等等，以生成结构类似物。
筛选也可以针对已知具有药理学活性的化合物及其化学类似物。
可以采用任何合适的方法实现按照本发明的调节试剂的筛选。例如，所述方法可以包括将表达相应的Fgf基因或Fgfr基因或与Fgf或Fgfr基因属于相同调控或生物合成途径的基因的细胞与可能具有调节活性的试剂接触，并检查该多核苷酸所编码蛋白的水平或功能活性的调节，或该多核苷酸编码的转录本水平的调节，或所述蛋白或转录本(此后表示为靶分子)的下游细胞目标分子的活性或其表达的调节。检测这样的调节能够通过包括但不限于下列技术手段实现ELISA法、细胞ELISA法、抑制型ELISA法、免疫印迹法、免疫沉淀法、狭缝或点印迹法、免疫染色法、放射免疫法、亲近闪烁检测法(SPA)、采用抗原结合分子或抗原与诸如荧光素或罗丹明等荧光试剂结合的免疫荧光法、Ouchterlony双重扩散分析法、采用亲合素-生物素或链亲合素-生物素检测系统的免疫检测法以及包括RT-PCR在内的核酸检测方法。
需要理解的是，调控或表达关注的目标分子的多核苷酸可以是天然存在于作为测试对象的细胞中的，也可以出于测试的目的而事先导入宿主细胞。此外，天然存在的或导入的多核苷酸可以是组成型表达的，这样就提供了在筛选下调该序列编码产物表达的试剂中的有益的模型，其中下调可以发生在核酸水平或表达产物水平；天然存在的或导入的多核苷酸也可以是需要激活的，这样就提供了在筛选上调该序列编码产物表达的试剂中的有益的模型。此外，在多核苷酸导入细胞的情况下，该多核苷酸可以包含编码靶蛋白的完整编码序列，或可以包含这一编码序列的一部分(例如，FGFR的FGF结合结构域，或FGF的FGFR结合结构域，或FGFR的HSPG结合结构域)或调控该多核苷酸编码产物表达的部分(例如启动子)。例如，可以将天然与所述多核苷酸相联的启动子导入作为测试对象的细胞中。在这一点上，在只利用启动子的情况下，例如，可以通过以可操作方式将该启动子与合适的、包括但不限于绿荧光蛋白(GFP)、荧光素酶、β-半乳糖苷酶和乙酰儿茶酚胺(CAT)在内的报道多核苷酸连接实现对所述启动子活性的检测。表达调节可以通过检测与报道多核苷酸相关联的活性进行测定。
在另一个实施例中，检测目标可以是靶分子的下游调控目标而不是靶分子本身，或是以可操作方式与编码产物表达受靶蛋白调控的基因的启动子相连的报道分子。
这些方法提供了对推测的、诸如包括合成的、组合的、化学的和天然的化合物库在内的蛋白类或非蛋白类调节试剂进行高通量筛选的机制。这些方法也能简化检测与编码靶分子的多核苷酸结合的或调节上游分子表达、随后调节编码靶分子的多核苷酸表达的试剂。因而，这些方法提供了检测直接或间接调节按照本发明的靶分子的表达或活性的试剂的机制。
在一系列实施方案中，本发明提供了鉴别能诱导或抑制按照本发明的靶分子的水平和/或功能活性的小分子或其它化合物(即调节试剂)的检测方法。采用非转化细胞、永生细胞系或重组细胞系，这些检测方法可以在体外实行。此外，在mRNA表达提高或降低(例如，通过采用这里所公开的核酸探针)、蛋白产物提高或降低(例如，通过采用这里所公开的抗原结合分子)、或重组结构中以可操作方式与靶分子相关基因调控区相连的报道基因(例如，GFP、β-半乳糖苷酶或荧光素酶)表达水平提高或降低的基础上，这些检测方法可检测到基因或蛋白产物表达提高或降低的存在。
因而，例如，人们可以培养产生特定靶分子的细胞并向培养基中添加一种或多种待测化合物。在使所述化合物得以诱导或抑制靶分子的水平或功能活性的足够期间(如6-72小时)以后，靶分子水平相对于确定基线的任何变化可以用任何上述本领域内熟知的技术进行检测。在特别优选的实施方案中，所述细胞是前脂肪细胞或微血管内皮细胞(MVEC)。通过采用适当的核酸探针或抗原结合分子，仅需要常规的实验，就可以检测靶分子水平和/或功能活性的改变，并鉴定所述化合物是靶分子的激动剂或拮抗剂。
在一些实施方案中采用重组检测方法，在这种情况下，编码如GFP、β-半乳糖苷酶或荧光素酶的报道基因以可操作方式与靶分子相关基因的5’端调控区相连。通过本领域中普通技术可以容易地分离和克隆这样的调控区。所述报道基因和调控区连接在同一框架中(或在3种可能读框的任意一种中)，这样所述报道基因的转录与翻译可以在靶分子相关基因的调控元件的控制下发生。虽然优选的是哺乳动物细胞，最优选的是人的细胞，重组结构可以随后导入任何适当的细胞类型中。转化的细胞可以在细胞培养物中生长，并且在确定报道基因表达水平的基线值以后，可以向培养基中添加测试化合物。报道基因表达检测的简易性为鉴定本发明中靶分子的激动剂或拮抗剂提供了一种快速、高通量的检测方法。
通过这一方法鉴定的化合物能在改变体内靶分子相关基因的表达中具备潜在效用。可以进一步在动物模型中测试这些化合物以识别那些具备最佳体内效果的化合物。此外，如以上关于具备目标多肽结合活性的小分子的描述，这些分子可以作为“先导化合物”，通过如对化合物进行连续修饰、分子建模和其他药物设计中的常规操作，进一步发展为药物。
在其他实施方案中，提供了识别抑制FGF活性的试剂的方法，在这种情况下，纯化的FGF蛋白制品在存在和不存在候选试剂的情况下、在FGF保持活性的条件下温育，并用合适的检测方法测定FGF活性水平。例如，可以通过检测候选试剂降低细胞中(例如，MVEC和前脂肪细胞)FGF活性的能力来识别FGF抑制剂。
在该方法的一个实施方案中，能表达Fgf的MVEC与前脂肪细胞共培养，培养基中的细胞与候选试剂在保持细胞内FGF活性的条件下相接触(或在存在和不存在候选试剂的情况下培养)，并检测诸如前脂肪细胞分化潜能增强等脂肪形成相关的活性。如果抑制这一活性，则该候选试剂测试为阳性。
在还有其他实施方案中，提供了一种识别提高FGF活性的试剂的方法，在这种方法中，纯化的FGF蛋白制品在存在和不存在候选试剂的情况下、在保持FGF活性的条件下温育，并通过合适的检测方法测定FGF活性水平，例如，通过检测候选试剂在细胞中(例如，MVEC和前脂肪细胞)提高FGF活性或激活FGF的能力，可以识别FGF刺激物或活化剂。在这种方法的一个实施例中，能表达Fgf的MVEC与前脂肪细胞共培养，培养基中的细胞与候选试剂在保持FGF细胞内活性的条件下相接触(或在存在和不存在候选试剂的情况下培养)，并检测诸如前脂肪细胞分化潜能增强等与脂肪形成相关的活性。如果能提高该活性，则该候选试剂测试为阳性。
在还有其他实施方案中，提供了识别抑制或防止FGFR激活的试剂的方法，在这些方法中，纯化的FGFR蛋白制品在存在和不存在候选试剂的情况下、在保持FGFR结合FGF配体能力的条件下温育，并通过合适的检测方法检测FGFR激活水平。例如，通过检测在受体配体存在的情况下候选试剂相对基线值降低细胞中(如前脂肪细胞)FGFR活化的能力，可以识别FGFR拮抗剂。在该方法的一个实施例中，能表达Fgfr的前脂肪细胞与MVEC共培养，培养基中的细胞与候选试剂在保持FGF细胞内活性的条件下相接触(或在存在和不存在候选试剂的情况下培养)，并检测诸如前脂肪细胞分化潜能增强等与脂肪形成相关的活性。如果能抑制该活性，则试剂测试为阳性。
在其他实施方案中，提供了识别增强FGFR活化的试剂的方法，在这些方法中，纯化的FGFR蛋白制品在存在和不存在候选试剂的情况下、在保持FGFR结合FGF配体能力的条件下温育，并通过合适的检测方法检测FGFR激活水平。例如，通过检测在受体配体存在的情况下候选试剂相对基线值增强细胞中(如前脂肪细胞)FGFR基本活化作用的能力，可以识别FGFR激动剂。在该方法的一个实施例中，能表达Fgfr的前脂肪细胞与MVEC共培养，培养基中的细胞与候选试剂在保持FGF细胞内活性的条件下相接触(或在存在和不存在候选试剂的情况下培养)，并检测诸如前脂肪细胞分化潜能增强等与脂肪形成相关的活性。如果能增强或促进该活性，则该候选试剂测试为阳性。
在还有其他实施方案中，附着在固相支持物上的、由氨基酸所有可能的组合构成的随机肽库可用于识别能与靶分子或其功能结构域结合的肽。识别能与靶分子结合的分子可以通过用重组的可溶性靶分子筛选肽库得以实现。所述靶分子可以是纯化的、重组表达的或通过任何合适技术合成的。精通本领域的人员可以采用例如如Sambrook等的著作中(1989，同上)尤其是第16和17部分、Ausubel等的著作中(《分子生物学现行技术》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & SonsInc，1994-1998)尤其是第10和16章、Coligan等的著作中(《免疫学现行技术》(Current Protocols in Immunology)，John Wiley & Sons Inc，1995-1997)尤其是第1、5和6章所描述的常规实验方案方便地制备这些分子。作为另一种选择，按照本发明的目标多肽可以采用如Atherton和Shephard的著作(上文所述)的第9章和Roberge等的文章(1995，Science 269202)中所述的液相或固相合成方法进行合成。
为了识别并分离与靶分子(优选的是靶多肽)相互作用并形成复合物的肽/固相支持物，可能需要对靶多肽进行标记或“加上标签”。靶多肽可以与包括诸如碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶的酶及诸如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)和罗丹明的荧光报道分子结合。任何特定的报道分子与靶多肽的结合可以采用本领域内的常规技术得以实现。作为另外一种选择，可以对靶多肽表达载体进行改造使之表达包含针对商业提供的抗原结合分子的抗原决定簇的嵌和靶多肽。抗原决定簇特异性抗原结合分子可以采用包括酶标记、荧光染料标记或磁珠标记在内的本领域内熟知的方法进行标记。
例如，标记的靶多肽偶联物与随机肽库在22℃下温育30分钟到1小时，以使靶多肽与文库中的肽之间形成复合物。随后洗涤文库以除去未结合的靶多肽。如果靶多肽已与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶结合，则将整个文库注入含有相应的如5-溴-4氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)或3，3’-二氨基联苯胺(DAB)的碱性磷酸酶或过氧化物酶底物的培养皿中。几分钟温育后，肽/固相靶多肽复合物发生颜色改变，并能方便地在配有显微操纵器的解剖显微镜下识别并实体分离该复合物。如果采用了荧光标记的靶多肽，复合物可以用荧光激活筛选技术进行分离。如果采用了具备外源抗原决定簇的嵌合靶多肽，肽/靶多肽复合物的检测可以通过采用经标记的抗原决定簇特异性抗原结合分子得以实现。分离以后，附着于固相支持物上的肽的特征可以通过肽段测序进行测定。
4.参与FGF信号途径的基因表达检测方法由于FGF信号途径中的基因(例如，Fgf基因和Fgfr基因)被认为与脂肪形成，尤其是与引发前脂肪细胞分化相关联，可以推断这些基因的表达异常可能是脂肪形成机能障碍的基础或对脂肪形成机能障碍产生影响。脂肪形成机能障碍包括可能与发展成肥胖症或包括但不限于家族性肥胖、动脉硬化、高血压和糖尿病在内的肥胖相关疾病的诱因相关联的脂肪形成的提高。因此，本发明提供了一种在患者中检测肥胖症的存在或诊断肥胖症风险的方法，该方法包括测定取自患者的生物样本中参与FGF信号途径的异常基因(如异常的Fgf基因或Fgfr基因)或该基因异常表达产物的存在，其中异常基因或异常表达产物与肥胖症发展或肥胖相关疾病的存在或患病风险相关。
在一些实施方案中，所述方法包括检测所述基因表达产物与该表达产物的正常基准水平或功能活性不同的水平和/或功能活性。例如，当Fgf基因产物或Fgfr基因产物以比正常的、非肥胖症患者或未受肥胖影响的患者中的表达水平明显更高的水平表达时，诊断为存在肥胖症或可能患有肥胖症。作为另外一种选择，通过检测Fgf基因或Fgfr基因表达产物的水平或功能活性相对于该基因正常的、非肥胖基准水平或功能活性的增强或提高，来诊断肥胖症。
因而，需要定量或定性地测定FGF信号途径中的组分的蛋白水平或转录水平。另外或此外，需要寻找FGF信号途径的结构异常基因及其调控区。
所述生物样本可以是任何合适的组织(如皮下结缔组织或网膜组织的活体切片)或体液。
4.1遗传诊断本发明的一种实施方案包括一种用于检测参与FGF信号途径的基因表达增强的方法。例如，通过定量或定性地测定细胞中(如MVEC)Fgf基因转录本或细胞中(如前脂肪细胞)Fgfr基因转录本，可以检测Fgf基因或Fgfr基因的表达。本发明的另一种实施方案包括一种通过检查细胞(如MVEC)的基因和转录本而用于检测参与FGF信号途径的基因(如Fgf基因或Fgfr基因)表达或功能的增强的方法。在这些实施方案中，按照常规方法(Sambrook等著，《分子克隆实验手册》(Molecular CloningALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Press，1989；Ausubel等著，《分子生物学现行技术》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & SonsInc，1994-1998)可以从生物样本所含的细胞中分离核酸。所述核酸可以是基因组DNA或部分或总细胞RNA。在使用RNA的情况下，可能希望将RNA转换为cDNA。在一种实施方案中，RNA是总细胞RNA；在另一实施方案中，RNA是poly-A RNA。在一种实施方案中，所述核酸通过核酸扩增技术扩增。合适的核酸扩增技术是精通本领域的技术人员所熟知的，并包括如例如Ausubel等在其著作(上文所述)中所描述的聚合酶链式反应(PCR)；如例如美国专利No 5,422,252中所述的链替代扩增反应(SDA)；如例如Liu等(1996)、国际申请WO 92/01813及Lizardi等(国际申请WO 97/19193)所描述的滚环复制(RCR)；如例如Sooknanan等(1994，Biotechniques 171077-1080)所述的依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)；以及如例如Tyagi等(1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 935395-5400)所述的Qβ复制酶扩增系统。
取决于具体存在形式，待研究的特异核酸直接通过扩增或扩增后采用第二个已知的核酸在样本中进行鉴定。随后，对经鉴定的产物进行检测。在某些应用中，可以通过直接观察进行检测(如胶的溴化乙锭染色)。作为另外一种选择，检测可以包括通过放射性标记或荧光标记的化学发光、放射性闪烁成像或甚至通过采用电或热脉冲信号系统(Affymax Technology；Bellus，1994，J Macromol.Sci.Pure，Appl.Chem.，A31(1)1355-1376)的产物鉴别方法。
经过检测以后，人们可以将特定患者中发现的结果与对照反应或具有统计学意义的正常对象参照组的结果进行比较。通过这种方式，可能使检测到的表达产物量与肥胖症的进程或严重程度相关联。
除了测定转录本水平以外，检测多种类型的缺陷可能也是有用的。这些缺陷可能包括缺失、插入、点突变和重复。点突变导致形成终止密码子、移码突变或氨基酸置换。体细胞突变是存在于非胚系组织中的。胚系组织能存在于任何组织中并遗传获得。通过改变基因的转录或提高转录本(mRNA)或蛋白的稳定性或以其他方式改变它们的处理，编码区内或之外的突变也可以影响FGF信号途径组分产生的数量。
在这一点上包括多种不同的检测方法，包括但不限于荧光原位杂交(FISH)、直接DNA测序、脉冲场电泳(PFGE)分析、核酸印迹杂交(Southern或Northern印迹)、单链构象分析(SSCA)、核糖核酸酶保护分析、等位基因特异性寡核苷酸探针法(ASO)、斑点杂交、变性梯度凝胶电泳、核酸限制性片段长度多态性(RFLP)分析和聚合酶链反应-单链构象多态性分析方法(PCR-SSCP)。本发明也包括如Hacia等(1996，NatureGenetics 14441-447)和Shoemaker等(1996，Nature Genetics 14450-456)所述的DNA芯片技术。总而言之，这些技术包括了用于快速精确地对大量基因进行分析的定量方法。通过寡核苷酸标记基因或采用固定的探针阵列，可以运用如高密度阵列的芯片技术分离靶分子并在杂交的基础上筛选这些分子。也可参见Pease等(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.915022-5026)和Fodor等(1991，Science 251767-773)的著作。
4.2 基于蛋白的诊断4.2.1 抗原结合分子在检测FGF信号途径基因表达的提高或降低中，可以使用能与本发明中的靶分子免疫相互作用的抗原结合分子。因而，本发明也包括与参与FGF信号途径的基因表达产物(例如FGF或FGFR多肽或调控或以其他方式影响一个或多个FGF多肽或FGFR多肽的水平和/或功能活性的蛋白)特异性结合的抗原结合分子。例如，抗原结合分子可以包括全部多克隆抗体。这样的抗体可以通过例如将本发明中的靶分子注入可以包括小鼠或兔在内的生产物种体内以获得多克隆抗血清的方式制备。对于精通本领域的技术人员而言，生产多克隆抗体的方法是众所周知的。可以采用的典型的实验方案参见如Coligan等所著的《免疫学现行技术》(Current Protocols InImmunology)(John Wiley & Sons，Inc，1991)和Ausubel等的著作(1994-1998，上文所述)，尤其是第11章第3部分。
与从生产物种中获得多克隆抗体不同，单克隆抗体可以通过采用例如Kohler和Milstein(1975，Nature 256，495-497)所述的常规方法、或通过这些方法的最近的改良方案进行生产，例如Coligan等的著作中(1991，上文所述)所述的通过永生脾细胞或源自已接种了本发明中的靶分子的生产物种的其他抗体生成细胞进行生产。
本发明也包括作为抗原结合分子的Fv、Fab、Fab’、和F(ab’)2免疫球蛋白片段。此外，抗原结合分子可以是合成的稳定的Fv片段、单一可变区结构域(也称作dAbs)、“微型抗体”以及其他本领域内所知的形式。
作为抗原结合分子也包括人源化抗体。人源化抗体是通过将非人源(如啮齿动物，优选的是小鼠)免疫球蛋白的轻链和重链可变区组成的决定簇互补区转移入人的可变区结构域进行生产的。随后对非人源的对应物的框架区中人源抗体的典型残基进行了置换。使用源自人源化抗体的抗体组分避免了与非人源抗体固定区的免疫原性相关连的潜在问题。文献中描述了克隆非人源(尤其是鼠源)免疫球蛋白可变区结构域的通用技术，例如Orlandi等在1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833中的描述。文献中描述了生产人源化单克隆抗体的技术，例如Jones等(1986，Nature321522)、Carter等(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894285)Sandhu(1992，Crit.Rev.Biotech.12437)、Singer等(1993，J.Immun.1502844)、Sudhir主编的《抗体工程技术方案》(Antibody Engineering Protocols，Humana Press，Inc.1995)、Kelly在《遗传工程治疗性抗体》(“Engineering TherapeuticAntibodies”)中(见Cleland等主编的《蛋白质工程原则与实践》(“ProteinEngineeringPrinciples and Practice”)一书399-434页，John Wiley & Sons，me.1996)和Queen等在美国专利No.5,693,762(1997)中所描述的。
4.2.2 免疫诊断检测通过诸如ELISA和免疫印迹杂交等技术，上述抗原结合分子可用于直接或间接检测在健康和疾病状态下FGF信号途径基因表达的调节。能用于检测本发明的靶多肽的示意性检测方法包括但不限于包括抗原结合分子与样本中的靶多肽(FGF多肽)结合并检测由抗原结合分子和靶多肽组成的复合物的免疫检测方法。典型的免疫检测是能检测本发明中靶分子的水平或功能活性的测定方法。通常，将能与本发明中靶分子免疫相互作用的抗原结合分子与可能含有靶多肽的生物样本接触。检测由抗原结合分子和靶多肽组成的复合物的浓度，随后建立测定的复合物浓度与样本中靶多肽的浓度之间的关联。与本发明相一致，靶多肽异常浓度的存在，尤其是其浓度的提高，表明包括肥胖在内的脂肪形成功能障碍的存在或患病的可能性。
可以采用任何适当的检测抗原结合分子-目标抗原复合物形成的技术手段。例如，按照本发明具备与之相连的报道分子的抗原结合分子可用于免疫检测。这样的免疫检测包括但不限于放射免疫检测(RIA)、酶联免疫吸附检测(ELISA)和免疫层析技术(ICT)及蛋白印迹杂交等精通本领域的人员所熟知的方法。例如，可以参见Coligan等的著作(1994，见上文所述)，其中公开了多种依照本发明可以采用的免疫检测方法。如本领域内所能理解的或如例如下文所述的，免疫检测方法可以包括竞争性检测方法。需要理解的是，本发明包括定量和定性的免疫检测方法。
合适的免疫检测方法在例如美国专利No.4,016,043，No.4,424,279和No.4,018,653中均有描述。这些方法既包括非竞争类的单一位点和双位点检测方法，也包括传统的竞争结合检测方法。这些检测方法也包括标记过的抗原结合分子与靶抗原的直接结合。
本发明尤其适合采用双位点检测方法。这些方法存在多种不同形式，所有这些形式包括在本发明范围以内。简单地说，在典型的正向检测方法中，诸如未标记抗体的未标记的抗原结合分子固定在固体基质上并通过与固定的分子的接触检验制品。经过合适的、足以形成抗体-抗原复合物的孵育期以后，加入另一种用能产生可检测信号的报道分子所标记的抗原结合分子(合适的是所述抗原的特异性二抗)并共同孵育足够长的时间，以形成另一抗体-抗原-标记抗体的复合物。洗去任何未反应的材料，通过观察报道分子产生的信号以确定抗原的存在。通过单纯观察可见信号，该结果可以是定性结果；或通过与含已知抗原量的对照制品相比较，该结果可以是定量的结果。所述正向检测方法的不同形式包括同步检测方法，在这种情况下向已结合的抗体同时添加制品与标记过的抗体。这些技术手段，包括显而易见的小变化，是精通本领域的技术人员所熟知的。依照本发明，所述制品是包括如上所述组织或体液在内的可能包含抗原的材料。
在典型的正向检测方法中，具备针对抗原或其抗原性部分的特异一抗共价或被动地连接在固体表面。所述固体表面通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以是管状、珠状、圆盘状或微平板状，或任何其他适于进行免疫检测的表面。结合过程是本领域内所熟知的，通常包括将聚合物-抗体复合物交连、共价结合或物理吸附到固体支持物上，然后进行洗涤以为测试制品作准备。需要测试制品的试样量随后添加到固相复合物中并在适合于任何存在的抗原与抗体结合的条件下孵育一段充分的时间。孵育期结束后，抗原-抗体复合物经洗涤、干燥并与针对所述抗原一部分的特异性二抗孵育。二抗通常含与之相连的用于指示二抗与抗原的结合的报道分子。借助于连接的报道分子测定的结合的标记抗体的数量与结合在固定化的一抗上的抗原数量成正比。
作为另一种选择的方法包括固定化生物样本中的抗原并随后将固定化的抗原与用报道分子标记或未标记的特异抗体接触。取决于目标数量及报道分子信号强度，结合的抗原可以通过直接标记抗体进行检测。作为另一种选择，针对一抗的特异性标记二抗与靶抗原-一抗复合物接触以形成靶抗原-一抗-二抗三联复合物。所述复合物通过报道分子激发的信号进行检测。
从前面的叙述中需要理解的是，所述与抗原结合分子相连的报道分子可以包括以下类型(a)报道分子直接与抗原结合分子相连；(b)报道分子与抗原结合分子间接相连，也就是报道分子与另一种检测试剂相连，后者随后与抗原结合分子结合；和(c)与抗原结合分子随后反应的产物相连。
报道分子可以从以下试剂中选择，包括发色团、催化剂、酶、荧光染料、化学发光分子、诸如铕(Eu34)的稀土元素离子、放射性同位素和直接可见的标记。
在直接可见标记的情况下，可以利用胶体金属或非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物、乳胶颗粒、脂质体或其他包含信号生成试剂的膜泡及其他。
美国专利说明书U.S.4,366,241，U.S.4,843,000和U.S.4,849,338中公开了大量适于用作报道分子的酶。适合用于本发明的酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶及其他酶。所述的酶可以单独使用或与溶液中第二种酶组合使用。
合适的荧光染料包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、R-藻红蛋白(RPE)和德克萨斯红(Texas Red)。其他典型的荧光染料包括Dower等(国际申请WO 93/06121)论述过的荧光染料。还可以参见美国专利No.5,573,909(Singer等)和No.5,326,692(Brinkley等)中描述的荧光染料。作为另一种选择，可以参见美国专利No.5,227,487、No.5,274,113、No.5,405,975、No.5,433,896、No.5,442,045、No.5,451,663、No.5,453,517、No.5,459,276、No.5,516,864、No.5,648,270和No.5,723,218中所描述的荧光染料。
在酶免疫检测中，酶通常通过戊二醛或高碘酸盐与二抗偶联。然而，需要理解的是，对于精通本领域的技术人员而言，存在多种不同的偶联技术可供采用。通常选择那些被相应酶水解后产生可检测的颜色变化的与特异的酶配合使用的底物。合适的酶的实例包括上文所述那些酶。也可以采用产生荧光产物的荧光底物而不是前面提到的产生颜色的底物。在所有情况下，向一抗-抗原复合物添加酶标抗体，随后让其结合，并洗去多余的反应物。然后向抗体-抗原-抗体复合物中添加含适当底物的溶液。底物能与同二抗相连的酶发生反应，产生定性的可见信号，该信号可以进一步进行定量分析(通常用分光光度法)，以指示样本中存在的抗原数量。
另外，诸如荧光素、罗丹明和稀土元素铕(EU34)的荧光化合物可以化学手段与抗体相连而不改变后者的结合能力。被特定波长的光通过照射而激活时，荧光染料标记的抗体吸收光能，这一过程诱导分子内可激发状态，随后发生特征颜色光的发射，发射光可用光学显微镜进行观测。使荧光标记抗体与一抗-抗原复合物结合，洗去未结合的反应物后，保留的三联复合物随后暴露于适当波长的光源下。观测到的荧光表明待研究的抗原的存在。免疫荧光检测法(IFMA)是本领域内通用的。然而，也可以采用其他报道分子，如放射性同位素、化学发光或生物发光分子等。
需要充分理解，存在其他检测靶多肽(如FGF或FGFR)水平的方法，这样的方法包括，例如，涉及检测FGF与FGFR结合活性变化水平的方法，或采用抗FGF或抗FGFR抗原结合分子对组织、细胞或体液中的FGF或FGFR蛋白水平的免疫印迹杂交分析，或检测其他未与样本结合的FGF或FGFR结合伴侣的抗原结合分子数量，并将其从抗原结合分子或添加的结合伴侣的总数中扣除。
5.治疗和预防应用按照本发明，可以认为拮抗FGF信号途径的试剂是作为治疗或预防包括肥胖症、肥胖相关疾病、脂肪瘤和脂肪过多症在内的过度脂肪形成的有效手段。也可以认为激活FGF信号途径的试剂是在例如恶病质和恶病质相关疾病中增强脂肪形成的有效手段。这样的药物能单独地或与合适的药学上可接受的载体混合后以药物组合物的形式给患者服用。
本发明中的脂肪形成调节试剂可以与能将其活性限制于特定细胞类型的生物学靶向试剂偶联。这样的生物学靶向试剂包括与细胞特异表面抗原发生免疫相互作用的试剂。例如，调节FGFR活性的试剂可与同诸如脂肪分化相关蛋白(ADRP)的前脂肪细胞特异蛋白发生免疫相互作用的试剂偶联。这一免疫相互作用偶联的存在使所述FGFR调节试剂的作用具有前脂肪细胞特异性。
取决于需要治疗的具体疾病，所述药物可以进行配方设计及全身或局部给药。配方设计及给药的技术可以参见最新版的《雷明顿制药科学》(“Remington’sPharmaceutical Sciences”)，Mack Publishing Co.，Easton，Pa一书。例如，适当的给药途径可以包括口服、直肠给药、穿粘膜给药或小肠给药；不经肠道给药，包括肌肉注射、皮下注射、脊髓注射，以及胸腔注射、直接心室注射、静脉注射、腹膜注射、鼻内注射或眼内注射。
为了用于注射，本发明中的药物可以配方在水溶液中，优选的是在诸如Hank溶液、林格溶液或生理盐水缓冲液等与生理条件一致的缓冲液。为了用于穿粘膜给药，在配方中使用了适于穿透屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域内所知的。肌肉注射和皮下注射适于如免疫原性成分、疫苗和DNA疫苗的给药。
通过采用药学上可接受的、本领域内所熟知的载体，所述药物可以容易地配方成适于口服的剂量。这样的载体能将本发明中的化合物配方成如片剂、药丸、胶囊、液体、胶体、糖浆、药浆、悬浮液及其他适于被治疗的患者口服摄取的用药形式。这些载体可以选自食糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石粉、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、褐藻酸、磷酸盐缓冲液、乳化剂、等压盐溶液和不含热源的水。
本发明中适用的药物组合物包括其中包含能达到预期效果的有效量的活性组分的成分。对患者的给药剂量应当足以随时间推移引起患者体内诸如提高或减少脂肪形成的有益反应。给药量可以取决于治疗对象包括其年龄、性别、体重和综合健康状况等情况。在这一点上，精确的给药量将取决于医师的判断。在决定调节脂肪形成中有效给药量时，医师可以对FGF信号途径组分的组织水平及肥胖程度进行评估。无论如何，精通本领域的人员能够容易地决定本发明中药物的合适剂量。
非经肠道给药的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介包括如芝麻油的脂肪油，或如油酸乙酯或甘油三酸酯的合成的脂肪酸酯，或脂质体。水性注射悬浮液可以包含提高悬浮液粘性的试剂，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。悬浮液也可以随意地包含合适的稳定剂或提高所述化合物溶解性的试剂以制备高浓度溶液。
用于口服的药物制品能通过下述方式获得活性化合物与固体赋形剂结合，任选研磨获得的混合物，并对颗粒混合物进行处理，在需要的情况下，添加合适的助剂以获得药片或糖衣药片核心。合适的赋形剂尤其是指如包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇在内的糖类的填充剂；如例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄蓍胶、木质素纤维、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的纤维素制剂。在需要的情况下，可以添加诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或褐藻酸或其盐类(如藻酸钠)的分裂剂。这样的成分可以通过任何制药方法制备，但是所有方法包括将上述一种或多种药物与构成一种或多种必要成分的载体相连这一步骤。一般而言，本发明的药物组合物可以通过显而易见的方式生产，例如，通过常规的混合、溶解、颗粒化、包裹糖衣、研末、乳化、装入胶囊、截留(entrapping)或冻干处理。
糖锭的核心具有合适的包衣。为此目的，可以采用浓缩的糖溶液，该溶液可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯胶、聚乙二醇、或二氧化钛、涂膜溶液、以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。为识别或突出活性化合物剂量的不同组合，可以对药片或糖锭包衣添加染料或色素。
可用于口服的药物包括由明胶制成的推进式(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂(如丙三醇或山梨醇)制成的密封软胶囊。推进式胶囊可以包含与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)、或滑润剂(如滑石粉或硬脂酸镁)以及可选择添加的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在合适的液体中(诸如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二醇)。除此以外，可以添加稳定剂。
本发明中药物的服药形式也可以包括注入或植入专为此目的而设计的受控释放装置或其他形式的、改进成以此方式补充作用的值入物。例如用包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂族醇、聚乳酸和聚乙二醇酸在内的疏水性聚合物以及某些纤维素衍生物(如羟丙基甲基纤维素)对本发明的试剂进行包被能影响该试剂的受控释放。除此以外，采用其他的聚合物基质、脂质体或微球体可以影响受控释放。
本发明的药物可以药学上可接受的平衡离子盐的形式提供。药学上可接受的盐可以通过多种酸形成，这些酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等等。盐在作为相应的非碱性溶剂形式的水或其他质子溶剂中具有更高的溶解度。
对于本发明的方法中所采用的任何化合物而言，治疗上的有效剂量最初能由细胞培养物检测进行估计。例如，能在动物模型中设计药物剂量，以达到将在细胞培养物中测定的IC50(例如，待测试剂浓度，在此浓度下，达到FGF或FGFR多肽活性的半最大抑制或增强)包含在内的循环浓度区间。这样的信息能用于更精确地确定在人体中的有效剂量。
这样的药物的毒性及治疗功效能通过常规的药物学方法在细胞培养物或实验动物中测定，例如，为测定LD50(导致群体中50％个体死亡的剂量)和ED50(对群体中50％个体有治疗功效的剂量)。毒性与治疗功效之间的剂量比称为治疗指数并能用LD50/ED50的比率来表示。优选的化合物具有大的治疗指数。从这些细胞培养物检测和动物实验中获得的数据可用于设计在人体中使用的剂量区间。这些化合物的剂量优选地位于包含ED50值在内的、无毒或低毒的循环浓度区间之内。取决于所采用的剂型和给药途径，剂量可以在此区间内变动。精确的配方设计、给药途径和剂量可由具体医师考虑患者的状况进行选择(参见Fingl等所著的《治疗的药理学基础》(“The Pharmacological Basis of Therapeutics”)，1975，一书第1章第1页)。
用药量及用药间隔可以进行个体调节以使活性试剂的血浆水平足以维持FGF或FGFR抑制或增强效果。通常的患者全身用药量区间为1-2000毫克/日，一般为1-250毫克/日，典型地为10-150毫克/日。按照患者体重表示，通常的用药量区间为0.02-25毫克/公斤/日，一般为0.02-3毫克/公斤/日，典型地为0.2-1.5毫克/公斤/日。按照患者身体表面积表示，通常的用药量区间为0.5-1200毫克/平方米/日，一般为0.5-150毫克/平方米/日，典型地为5-100毫克/平方米/日。
作为另一种选择，可以将所述化合物进行局部而不是全身给药，例如，通过将经常是积存或持续释放配方的所述化合物直接注射入组织中(优选地是皮下或网膜组织)。
更进一步地，所述药物可以靶向药物传输系统的方式进行给药，例如，以组织特异抗体包被的脂质体形式。该脂质体能被引导至该组织并被该组织选择性摄取。
在局部给药或选择性摄取的情况下，所述试剂的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。
本发明还包括哺乳动物基因治疗的方法。这样的方法利用了基因治疗构件，该基因治疗构件包含由一条编码FGF信号途径组分或其生物学活性片段的核酸序列构成的经分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸与具有一个或多个指导该多核苷酸在哺乳动物中表达的调控序列的基因治疗载体相连。通常，基因治疗载体来源于如腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒和逆转录病毒等的病毒DNA序列。目前可供精通本领域的人员利用的合适的基因治疗载体可以参见如Robbins等(1998)的著作。如果希望进行“反义”治疗(如Fgf)，则Fgf多核苷酸的一个或多个部分可以3’→5’定位于基因治疗载体中。
将基因治疗构件对哺乳动物(优选地是人体)给药可以包括通过直接口服投药、全身性注射、或对选择的组织或细胞投药、或通过对分离自该哺乳动物或兼容供体的细胞投药的间接投药。后一种方式的实例可以是干细胞治疗，其中用含Fgf多核苷酸的载体转染经分离的具有生长与分化潜能的干细胞。所述干细胞培养一段时间后再转移到需要治疗的哺乳动物。
向哺乳动物细胞或组织传输基因治疗构件或传输兼容供体可以通过例如微弹法、脂质体介导的转染(如lipofectin或lipofectamine)、电穿孔技术、磷酸钙法或DEAE-葡聚糖介导的转染等得以简化。合适的传输方法的讨论可以参见Ausubel等著作(1994-1998，上文所述)的第9章。
例如，可以将编码FGF-1的多核苷酸导入细胞以增强该细胞促进脂肪形成的能力，相反地，可以导入诸如3’→5’寡核苷酸的Fgf-1反义序列以降低或削弱该细胞向脂肪细胞的分化。
在另一种实施方案中，作为以本领域内已知的“裸DNA”制剂形式的治疗或预防制剂，可以采用编码本发明的调节试剂的多核苷酸。例如，可将包含以可操作方式与调控多核苷酸(如启动子、转录终止子、增强子等等)相连的该多核苷酸的表达载体导入动物(优选地是哺乳动物)，该载体在动物体内(优选地是在前脂肪细胞组织中)引起调节试剂的生成。
取决于预期应用与物种，将表达载体导入靶细胞或组织的步骤会有所不同，并可能包括一个或多个非病毒和病毒载体、阳离子脂质体、逆转录病毒、和诸如例如Mulligan，R.C.，(1993)所描述的腺病毒。例如，这样的方法可以包括A.通过注射(Wolff等，1990)、手术植入、滴注或任何其他手段导入的表达载体的局部应用。这一方法也可以与通过注射、手术植入、滴注或其他任何手段导入的对该表达载体所编码的蛋白敏感的细胞的局部应用结合使用，以提高这种治疗方法的有效性。这一方法也可以与通过注射、手术植入、滴注或其他任何手段导入的所述蛋白活性所需的其他因子的局部应用结合使用。
B.通过DNA(Calabretta等，1993)或RNA单独注射或其与脂质体(Zhu等，1993)、病毒衣壳或纳米颗粒(Bertling等，1991)或任何其他传输介质组合注射的普通全身性投药。通过多核苷酸/表达载体与靶向分子连接(所谓的“魔弹”方法采用例如抗原结合分子)，或通过注射、手术植入或其他任何手段导入的该表达载体所编码的蛋白的活性所需的其他因子或对该蛋白敏感的细胞的局部应用，可以提高靶向性。例如，在含反义Fgf多核苷酸的脂质体的情况下，通过在脂质体膜上结合MVEC表面抗原特异的免疫相互作用试剂，可以引导脂质体到达MVEC。MVEC特异细胞表面抗原的一个实例是PECAM-1。
C.已在活体外通过转染(例如，在磷酸钙存在的情况下(Chen等，1987)，或在阳离子脂质体和多胺存在的情况下(Rose等，1991))、感染、注入、电穿孔(Shigekawa等，1988)或其他任何手段进行改造以提高这些细胞中所述多核苷酸表达的细胞的注射、植入或通过任何手段的导入。所述改造能由质粒、噬菌体、柯斯质粒(cosmid)、病毒(如腺病毒或逆转录病毒；Mulligan，1993；Miller，1992；Salmons等，1993)或其他载体、或其他如脂质体(Zhu等，1993)的改造试剂、病毒衣壳或纳米颗粒(Bertling等，1991)、或任何其他的改造介质所介导。采用细胞作为基因或基因产物的传输工具已由Barr等(1991)及Dhawan等(1991)进行过描述。处理过的细胞能与任何营养素、生长因子、基质或其他能促进其在治疗对象中存活的试剂组合导入。
为使本发明便于理解并产生实用效果，现在通过下列非限制性实施例对特别优选的实施方案进行描述。
实施例实施例1人前脂肪细胞和MVEC活组织采集、分离和培养材料与方法抗PECAM-1抗体包被的磁珠的生产按照生产商使用说明书，用经纯化的小鼠抗人PECAM-1(CD31)的单克隆抗体对含共价结合的羊抗小鼠IgGl的磁珠(Dynabeads M-450)(Dynal)进行包被。由抗PECAM-1抗体包被的磁珠重悬并以30毫克/毫升的浓度灭菌保存在4℃添加了0.1％BSA的去离子磷酸缓冲盐溶液(DPBS)中。制备好的磁珠至少在4个月中保持活性。
实验对象从接受选择性开腹外科手术(妇科或血管手术)的4名男性(平均年龄69岁，介与66-70岁之间；平均体重指数(BMI)27，介与26-29之间)和5名女性(平均年龄55岁，介与39-67岁之间；平均体重指数27，介与20-32之间)患者获得了成对的网膜(O)和腹部皮下(S)脂肪组织活体切片。所有患者均没有糖尿病或严重的全身性疾病，也均未服用已知能影响脂肪组织量或其新陈代谢的药物。实验方案得到了亚利克桑德拉公主医院研究伦理委员会(Research Ethics Committees of the PrincessAlexandra Hospital)和昆士兰技术大学(Queensland University of Technology)的核准。所有患者提交了书面的知情同意书。
血管间质细胞的分离参见图2，活体切片在林格溶液中运至实验室(运输时间15分钟)。前脂肪细胞和微血管内皮细胞分离自所述活体组织切片。(1)去除明显的神经、血管和纤维组织后，仔细地切碎脂肪组织并在含3毫克/毫升II型胶原酶和1.5％BSA的消化液(25mMHEPES，5mM葡萄糖，120mM氯化钠，50mM氯化钾及1mM氯化钙)中37℃温育1小时。消化液与脂肪组织之比是4∶1。获得的消化物通过250微米孔径的滤网(Sigma)过滤，通过4℃下250g离心5分钟将脂肪细胞与游离油与血管间质组分分离。(2)在含10％BSA的DPBS中重悬、洗涤并离心(600g，5分钟，4℃)血管间质沉淀。重复该步骤并最后用DPBS单独洗涤。(3)最终获得的沉淀在含1mM EDTA(CSL，Brisbane)的0.25％胰蛋白酶中室温温育15分钟并搅拌几次。胰蛋白酶用含5％胎牛血清(ICN)的Hanks’平衡盐溶液(HBSS)中和。(4)大的结缔组织片段用100微米孔径滤网(Sigma)过滤除去。(5)离心分离(600g，5分钟，4℃)滤液，用含10％胎牛血清(FBS)、100国际单位青霉素、100微克/毫升链霉素、2mM L-谷氨酰胺(均购自ICN BiomedicalAustralasia)、90微克/微升肝素、30纳克/毫升β-内皮细胞生长因子(β-ECGF)、0.014M HEPES、0.15％NaHCO3的内皮细胞(EC)生长培养基(M-199；ICN)重悬沉淀并接种于1％明胶包被的25cm2的细胞培养瓶中(Corning)。这一混合的细胞群体在37℃，5％CO2条件下培养3-5天。
用抗PECAM-1磁珠筛选微血管内皮细胞依然参见图2(6)经过短期培养(大约3天)，所述细胞与0.25％胰蛋白酶/1mMEDTA孵育4-5分钟，随后用含5％FBS的Hank缓冲盐溶液(HBSS)中和胰蛋白酶并离心。(7)1毫升HBSS+5％FBS重悬细胞沉淀并与50微升抗PECAM-1抗体包被的磁珠孵育(15分钟，4℃)。(8)用HBSS+5％FBS将细胞/磁珠悬浮液体积调整为10毫升，并在室温下用磁性颗粒收集器筛选内皮细胞3分钟。当试管仍处于磁场中时，将洗液中未被选的细胞(前脂肪细胞)移入另一新试管中。随后内皮细胞进一步用10毫升HBSS+5％FBS洗涤并再次用磁性颗粒收集器筛选(3分钟)。这一洗涤/筛选过程重复5次。(9a)挑选出的细胞(内皮细胞)接种于1％明胶包被的细胞培养瓶EC生长培养基中(如上所述)。(9b)离心收集未选择的细胞(前脂肪细胞，PA)并重悬于含100国际单位青霉素、100微克/毫升链霉素、2mM L-谷氨酰胺和10％FBS的1∶1的DMEM/HamF12(ICN Biomedical Australasia)(PA生长培养基)中。
内皮细胞培养物的纯化依然参见图2(10)通过用0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA(T/V)处理细胞培养物30-40秒，用HBSS+5％FCS溶液中和T/V，并将非贴壁的内皮细胞移至含EC生长培养基的1％明胶包被的培养瓶中，实现内皮细胞与杂质成纤维细胞分离。这样的胰蛋白酶消化与转移过程在培养的最初两周中重复1或2次，直至获得均一的内皮细胞培养物。
细胞培养细胞保持在37℃5％CO2空气条件下培养。每2-3天更换培养基，同时细胞日常性地用胰蛋白酶/EDTA传代。内皮细胞保持在明胶包被的培养瓶中的EC生长培养基中，而前脂肪细胞保持在未包被的细胞培养瓶中的PA生长培养基中。随着内皮细胞数量的增加，EC生长培养基中β-ECGF的浓度由30纳克/毫升降至10纳克/毫升。在实验工作中采用2到4代传代的内皮细胞和前脂肪细胞。
其他细胞类型的培养人皮肤微血管内皮细胞系CADMEC(Cell Applications，Inc.，San Diego)(以与脂肪来源的初级内皮细胞相同的条件下培养)，以及人皮肤成纤维细胞(通过钻取活体切片并在与人前脂肪细胞相同的条件下培养获得)用作内皮细胞研究的相应的阳性和阴性对照。
内皮细胞特征描述用多种的方式对获得自脂肪组织活体切片的微血管内皮细胞(MVEC)进行了特征描述。
形态学为观察内皮细胞特有的鹅卵石状形态(图3A)，通过倒置相差显微镜检查细胞培养物。
免疫荧光采用针对(冯)维勒布兰德(氏)因子(vWF)(Clone F8/86，DAKO)和血小板内皮细胞吸附分子-1(PECAM-1；CD31)(Clone JC/70A，DAKO)的表达的特异单克隆抗体通过免疫荧光对细胞进行考察。细胞在24孔板(1％明胶包被的)的孔中生长至融合浓度。对照细胞(人皮肤微血管内皮细胞-CADMEC、人前脂肪细胞初级培养物和人皮肤成纤维细胞)平行处理。去除培养基以后，细胞在2％多聚甲醛(BDH Laboratory Supplies，England)中室温(RT)固定2分钟。用0.1％Triton X100(Ajax Chemicals，Australia)室温下对细胞作渗透性处理30秒。洗涤经固定及渗透性处理的细胞并用含1％BSA的PBS(×3)封闭，随后与所用的在PBS+1％BSA中稀释(所有抗体按1∶100稀释度使用)后的一抗4℃孵育4小时。为排除二抗的非特异结合产生的假阳性，所有细胞类型也用缓冲液替代一抗或用非免疫抗体(同种型对照)以相同方式处理。细胞用PBS洗涤(×3)，随后在室温下与1∶50稀释于PBS+1％BSA的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗(兔抗小鼠IgG FITC；DAKO)孵育30分钟。细胞用PBS洗涤(×2)，随后细胞核用碘化丙啶(贮存液5毫克碘化丙啶溶于100毫升0.1M柠檬酸三钠；工作液1份贮存液混合3份0.1MPBS)在4℃下反转染色5分钟。细胞用PBS再洗涤2次，随后用含尼康TE-FM Epi-荧光附件的尼康Eclipse TE300倒置显微镜和尼康F70相机配合柯达MAX 400 ASA胶片对细胞进行检测和照相。通过用单克隆抗体(CloneBBIG-E4，R&D Systems，Inc)和如上所述的免疫荧光方法，还研究了在含10纳克/毫升肿瘤坏死因子(TNF)α(Biosource International，USA)的生长培养基中预处理4小时的细胞中选择素E-selectin(CD62E)的表达。结果表示在图3中。
基因表达检测了MVEC和CADMEC中通过NOS3基因的内皮一氧化氮合成酶(eNOS)的表达。用Tri试剂(Sigma)按照生产商的说明书从细胞中提取总RNA。用逆转录酶ExpandReverse Transcriptase(Roche)通过常规方法将2毫克RNA转为cDNA。PCR在含1×PCR缓冲液、1微升cDNA、每种引物各12.5pmols、1.5mM MgCl2和0.625单位TaqDNA聚合酶的25微升的总反应体积中进行。引物序列及热循环条件如Rockett等所述(In vitro Cell Dev Biol Anim 31473-481，1998)。PCR产物在1×TBE缓冲液中含1微克/毫升溴化乙锭的1.2％琼脂糖胶上分离并在紫外灯下观察并照相。采用了φX174分子量标记。
前脂肪细胞特征描述在形态学(相差显微镜和细胞计数)和分化能力的基础上进行前脂肪细胞特征描述。分化能力通过G3PDH酶活性和甘油三酯积累进行评估。
G3PDH活性活性按照Adams等(J Clin Invest 1003149-53，1998)和Hutley等(《主要间充质细胞》第一版，(Primary Mesenchymal Cells)，Kluwer Academic 5173-87，2001)所述的进行评价。
甘油三酯积累采用细胞计数和尼罗红检测法评估脂积累。
细胞计数。在分化培养基中处理14天之后，每种处理中的脂质包含细胞的数量用1mm2的测微计网格(Neubauer，West Germany)以100倍放大倍数在相差显微镜下估算。每种处理检测10个不同区域，细胞总数及脂质包含细胞百分数均进行了估算(未公开数据)。
尼罗红检测法。如以前所述(Hutley等，2001，上文)，在6孔板中培养的前脂肪细胞在磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH 7.4)中洗涤3次，并在每个孔内添加150微升胰蛋白酶-EDTA。细胞在37℃下温育10分钟，直至细胞从培养平板上脱落。向每个孔内添加含终浓度1微克/毫升尼罗红的PBS，细胞在室温下进一步温育5-7分钟。室温下在分光荧光光度计(Aminco Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer)下以488nm激发波长/540nm发射波长检测荧光。结果按表面积进行标准化。每一实验重复3次。
实施例2MVEC对前脂肪细胞增殖和分化的作用为了研究血管内皮细胞来源的因子在脂肪形成中的作用，发明人检测了体外培养中的前脂肪细胞在含有微血管内皮细胞来源的生长因子的生长培养基存在的情况下的作用。
材料与方法前脂肪细胞和MVEC的活体切片材料获取、分离和培养方法如实施例1所述。
条件培养基的制备在1％明胶包被的细胞培养容器中生长至融合浓度的单独的人脂肪来源微血管内皮细胞(MVEC)、人皮肤微血管内皮细胞(CADMEC)以及人皮肤成纤维细胞(HSF)分别与含10纳克/毫升β-ECGF的EC生长培养基(见上文)在37℃，5％CO2下接触48小时。随后收集培养基，用0.22μ的低蛋白结合滤器过滤，在进一步使用前-20℃保存。在不含细胞的培养瓶中，也如上所述处理EC生长培养基+10纳克/毫升β-ECGF(空白对照)。临使用之前将每种培养基解冻并进一步向每种培养基添加5％FCS。
前脂肪细胞增殖检测将皮下和网膜前脂肪细胞以及人皮肤成纤维细胞分别以约1×103细胞/孔的浓度(亚融合浓度)接种于96孔板含10％FCS的1∶1的DMEM/Ham F12(PA生长培养基)中并使其在37℃，5％CO2条件下贴壁生长16-20小时。随后将培养基换成通过与融合浓度皮下或网膜MVEC、人皮肤成纤维细胞(HSF)、或不含细胞的孔(空白对照)接触获得的EC条件生长培养基(见上文)(每一实验重复4次)。在单独的实验中，皮下(S)和网膜(0)前脂肪细胞如上所述进行接种并随后用S MVEC、O MVEC、人皮肤EC(CADMEC)条件培养基、新鲜EC生长培养基或空白对照进行处理。48小时后，前脂肪细胞细胞数量用甲试剂比色法(Promega)评估。向每个孔添加终浓度为200微克/毫升的水溶性噻唑蓝(MTS)。37℃温育4小时后，490nm处的吸收值用Bio-Rad 3550酶标仪检测。这一检测方法的有效性通过两种方法测定1)前脂肪细胞以每孔250、500、1000、2000、4000个细胞的量接种(重复4次)并检测490nm处的吸收值；2)经检测490nm处的吸收值后，细胞随后用碘化丙啶染色并用荧光显微镜进行直接细胞计数。每孔共计数4个区域，并将这些结果与用490nm处甲试剂吸收获得的数据进行比较。
统计学细胞个数与光密度之间的相关性通过Pearson相关系数进行评估。增殖数据通过对重复检测的单因素方差分析进行评估。由此可运用α＝0.05的配对t检验对符合条件的作用进行多重比较。
结论MVEC条件培养基对前脂肪细胞增殖的作用为了确定是否MVEC分泌任何影响前脂肪细胞增殖的可溶因子，将人的前脂肪细胞用MVEC条件培养基接触处理48小时。结果显示与对照相比，前脂肪细胞(皮下和网膜)的增殖速率显著提高(p＝＜0.001)。用来自皮下(S)和网膜(0)脂肪组织位点MVEC条件培养基处理的前脂肪细胞，这一结果是相似的，不过，用“S”MVEC处理的前脂肪细胞比那些用“O”MVEC处理的在增殖速率方面表现出略高一些的倾向。鉴于由人皮肤MVEC(CADMEC)诱导的增殖不如由脂肪来源的MVEC所诱导的明显(p＝0.001)，由脂肪来源的MVEC所产生的因子对前脂肪细胞的促有丝分裂作用表现出一定的特异性。来自人皮肤成纤维细胞的条件培养基相对于空白对照不具有提高前脂肪细胞增殖的作用。通过采用已知数量的前脂肪细胞对这些研究中的增殖检测进行了验证，结果显示细胞数量与490nm处的吸收值之间的线性关系(r2＝0.9)。在有限数量的实验中，还运用直接细胞计数来验证结果，在检验和实验检测中，细胞计数与490nm处甲试剂的吸收值呈正相关(Pearson相关系数＝0.97)。
实施例3前脂肪细胞、脂肪细胞和MVEC中FGF-1表达分析在观察到MVEC产生FGF-1的基础上，发明人进行实验以检查特异性生长因子FGF-1在前脂肪细胞体外复制与分化中的作用。结果(未公开数据)显示，与在不含FGF-1或其他MVEC来源的因子的条件下培养的前脂肪细胞相比，在存在经纯化的FGF-1条件下生长的前脂肪细胞从分离时起显示出类似的，但不是附加的，分化潜能的提高。发明人随后设计了实验以确认FGF-1生成细胞的特征并对所述细胞中FGF-1mRNA的生成进行定量分析。
材料与方法网膜及皮下组织活体切片以及前脂肪细胞的分离按照实施例1中描述的操作进行。
胞内FGF-1的荧光标记为探测胞内FGF-1，采用特异性抗FGF-1抗体(Sigma F5421)。标记的胞内FGF-1的造影通过采用共聚焦显微方法进行。
前脂肪细胞、脂肪细胞和MVEC中FGF-1 mRNA表达的评估通过采用实时RT-PCR对FGF-1 mRNA表达进行评估。通过运用常规实验方案(TRI试剂)从每种细胞类型中提取总RNA，并采用Superscript preamplification system试剂盒(Life Technologies)产生cDNA。随后FGF-1的表达用TaqManTM检测法(采用ABI Prism 7700序列检测器(Perkin Elmer/Applied Biosystems)的建立在荧光基础上的实时PCR技术)测定。
FGF-1蛋白表达的定量分析运用免疫印迹杂交估算每种细胞类型制品的全细胞溶解产物中FGF-1蛋白的表达量。
结论初始数据显示，在成熟的人脂肪细胞中FGF-1的mRNA和蛋白以很低的量表达，但在前脂肪细胞中，无论是mRNA还是蛋白均未检测到。与以前的结果相符，MVEC高水平表达FGF-1的mRNA和蛋白。
实施例4FGF-1诱导的基因表达改变的特征描述材料与方法人的网膜前脂肪细胞取自实施选择性开腹外科手术(妇科或血管外科)的患者的活体组织切片。没有患者患有糖尿病或严重的全身性疾病，也没有患者服用已知能影响脂肪组织量或其新陈代谢的药物。下述实验方案得到了亚利克桑德拉公主医院研究伦理委员会(Research Ethics Committees of the Princess Alexandra Hospital)和昆士兰技术大学(Queensland University of Technology)的核准。按照实施例1中所述的方法，对前脂肪细胞实行分离与接种。
前脂肪细胞在含有(+)或不含(-)人FGF-1的灭菌血清中生长48小时。随后按照生产商说明书用微矩阵芯片比较基因表达。在扫描的微矩阵影像上用ImaGene4.1(BioDiscovery)软件平台鉴别斑点。数据通过GeneSpring 4.1软件(SiliconGenetics)进行解读。
用免疫荧光标记手段采用抗PLCγ2抗体(Santa Cruz sc-5283)通过免疫印迹杂交分析磷脂酶Cγ2(PLCγ2)蛋白的表达。
实施例5引导PLCγ2调节剂至脂肪形成组织由于PLCγ2参与体内所有组织中的大量信号途径，为增强或拮抗脂肪形成的目的而使用能调节其活性的试剂优选地要求将调节剂靶向至前脂肪细胞。
材料与方法免疫靶向方案针对前脂肪细胞特异蛋白(脂肪分化相关蛋白，ADRP)的单克隆抗体通过常规方案获得。简而言之，合成来自该蛋白的肽序列并随后用于在12周内每周2次接种5只兔子(近交白兔品系)。期间针对导入的肽的免疫反应通过采用体外免疫细胞化学血清检验检测兔血清与ADRP的反应性进行监控。12周后牺牲实验兔，为分离和测试抗ADRP抗体变异体培养分离出的脾细胞。选择具有最高亲合常数的抗ADRP IgG抗体用于与U-73122通过碳化二亚胺酰胺化步骤将U-73122上游离的羧基基团与抗ADRP抗体上N-端残基交连的方式偶联。
亲脂性靶向方案亲脂性苯并二氮拮抗剂氟马西尼(Flumazenil)与U-73122偶联以促进这种磷脂酶抑制剂在脂肪组织中的积累。通过简单的交联反应在每个化合物上一个挑选的碳原子之间形成共价键的方式进行偶联。
为测试每种偶联的U-73122化合物的拮抗脂肪形成的能力，对每种制品的3个剂量在链脲佐菌素(STZ)处理产生的、出生后10日到40日的糖尿病肥胖品系大鼠中进行了测试。通过肌下注射每日两次给药。在整个实验阶段中，测试动物的体重指数(BMI)值每日进行测量，并对任何不良药物反应进行监控。仔细监测氟马西尼偶联处理组中任何中枢神经系统不良反应。
实施例6人脂肪组织、人脂肪组织微血管内皮细胞和小鼠3T3-L1细胞中FGF-1的表达从分化的3T3-L1脂肪细胞、脂肪组织MVEC、从分离时起(超过一周)含有和不含FGF-1的网膜和皮下人前脂肪细胞以及网膜和皮下分离的人脂肪细胞制备全细胞溶解物。蛋白通过BCA定量以后，每条泳道上样20微克总蛋白，蛋白通过SDS/PAGE分离并转移到硝酸纤维素膜上。感兴趣的蛋白通过一组抗FGF-1抗体及相应的二抗进行检测。结合的抗体通过强化化学发光(ECL)进行检测。
如图4所示，在3T3-L1细胞及内皮细胞中检测到了FGF-1，但在人前脂肪细胞或脂肪细胞中，在任何实验条件下均未检测到FGF-1。使用所有检测抗体的结果是一致的，并通过FGF-1 mRNA的定量RT-PCR得到了确认(未公开数据)。
实施例7FGF-1、FGF-2和IGF-1对网膜和皮下前脂肪细胞复制和分化的作用复制分离并以500个细胞/孔浓度(亚融合浓度)将前脂肪细胞接种于96孔板含血清培养基中，培养12-18小时使其贴壁。随后细胞在添加1纳克/毫升生长因子的含血清培养基(SCM)中孵育48小时并进行MTS增殖检测(Promega)。图5中表示的相对于SCM对照的结果表明，作为对FGF-1和FGF-2的回应，增殖水平明显提高。
分化在分化实验中，分离前脂肪细胞并在内皮细胞条件培养基(EC-DMEM)或含生长因子培养基中进行2个月以内的次培养，随后使其在6孔板上达到融合浓度。随后，细胞在不含血清的、含0.1μM罗格列酮的化学改良分化培养基中分化。分化通过常规的G3PDH检测法在第21天进行评定。
图5中表示的结果显示，在常规条件下，前脂肪细胞与生长因子或脂肪组织MVEC条件培养基接触促进其随后的分化。与对复制的作用一样，FGF-1比FGF-2具有更显著的作用，而FGF-2又比IGF-1的作用更大。
FGF-1与FGF-2组合处理的效果分离人网膜和皮下前脂肪细胞并在含有和不含FGF-1或FGF-2的SCM中进行次培养。达到融合浓度后，细胞在含有和不含FGF-1或FGF-2的常规化学改良的不含血清+罗格列酮培养基中分化。分化通过G3PDH活性进行评定。图6中表示的结果显示，在复制或在分化过程中，FGF-1和FGF-2中任一的存在，均能促脂肪形成。贯穿两个过程的存在度(presence)是累加的。FGF-1具有比FGF-2更强的促脂肪形成作用。这些数据指出，FGF-1在复制和分化过程中的促脂肪形成作用是独立的和累加的。
实施例8FGF-1在存在血清的条件下使人前脂肪细胞得以体外分化人前脂肪细胞体外分化的常规要求是必须去除血清。这与小鼠脂肪细胞细胞系(如3T3-L1)形成对比，这些细胞系在含血清培养基(SCM)中具有高分化潜能。人们推测，为人的细胞发展出的培养体系或是诱导分化所必需的因子的下调，或是促进拮抗分化因子的表达(或二者兼有)。在这些实验中，分离了人的网膜和皮下前脂肪细胞并在存在FGF-1的条件下进行次培养。随后细胞在添加胰岛素和(1-3天)地塞米松和罗格列酮的SCM中得以分化。
图8中表示的结果显示在SCM中(A)次培养的前脂肪细胞中完全不存在细胞分化(如通过细胞质脂质积累所证明的)以及在SCM+FGF-1中次培养的皮下(B)和网膜(C)前脂肪细胞的显著分化。
这是迄今首次证明人前脂肪细胞在存在血清条件下的体外分化，并为FGF-1在人脂肪形成中的中心作用提供了有说服力的证据。
实施例9
由FGF-1引起的人前脂肪细胞基因表达的微矩阵分析从分离并在SCM(对照)或SCM+FGF-1中生长至融合的人皮下前脂肪细胞中提取总RNA。制备cRNA并与芯片杂交，随后通过Affymetrix系统进行分析。每次处理用一式两份制品代表并进行了两次独立实验。如果表达量一直(CV＜5％)提高或降低至少50％，就认为基因表达受到了FGF-1的影响。100多个基因落入每个类别，其中那些目前正在研究的在图9中制成表格表示。
FGFR-1和FGFR-2的上调和FGFR-3的下调说明，人前脂肪细胞中FGF-1的作用可能是由FGFR-1或-2介导的。过氧化物酶体增生物活化受体γ(PPARγ)和CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)的上调指出，这些脂肪形成的关键转录调控因子介导FGF-1促脂肪形成作用。FGF-1可能促进其表达或防止其在SCM中表达能力丧失(或二者兼有)。PLCγ2的表达提高是适当的，因为它是FGFR下游的关键信号分子。
实施例10由FGF-1引起的人前脂细胞PLCγ表达提高在24孔板SCM+/-FGF-1中培养人前脂肪细胞。PLCγ表达通过间接免疫荧光进行检测。非免疫一抗和单二抗对照没有产生荧光染色。图10中表示的结果显示，与在单纯SCM中生长的细胞相比，在含FGF-1条件下生长至融合的人前脂肪细胞中PLCγ的表达得到了提高。这些数据也表明，PLCγ2表达在融合时-发生分化诱导的阶段-极大提高。
实施例11PLCγ的抑制削弱FGF-1诱导的人脂肪形成分离人皮下前脂肪细胞并在含和不含FGF-1且含与不含PLC抑制剂U-73122(Calbiochem)的SCM中次培养。随后使细胞达到融合并用含和不含FGF-1且含和不含U-73122的含罗格列酮的常规化学改良SFM使细胞分化。分化通过G3PDH活性进行评定。图11中表示的结果显示，在复制阶段或分化阶段，U-73122显著削弱了FGF-1诱导的分化，并且在这两个过程中U-73122也具有累加作用。
实施例12抗FGF-1中和抗体阻断FGF-1诱导的人前脂肪细胞复制分离了人皮下前脂肪细胞并在含FGF-1+/-抗FGF-1抗体的SCM中培养。按前文所述方法对复制进行评估。图12中表示的结果显示该抗体降低复制的量效关系。这些数据支持胞外FGF-1降低策略的有效性。
实施例13抑制FGFR下游信号传输对前脂细胞分化的作用分离了人前脂肪细胞并在SCM+FGF-1中次培养。分化前一周，向培养基中添加酪氨酸激酶抑制剂。随后细胞在最初3天内在SFM+罗格列酮+FGF1+/-所述抑制剂中分化。在第15天收集细胞并通过G3PDH活性检测分化情况。
在这些实验中采用了以下化合物(1)PKC抑制剂Calphostin C(Cal C)；(2)MEK抑制剂PD 98059(PD)；(3)PI3-K抑制剂Ly 294002(LY)；(4)p38激酶抑制剂SB202190(SB 190)；以及(5)SB 190对照化合物SB 202474(SB 474)。
图13中表示的结果显示，抑制FGFR下游信号转导途径对FGF-1介导的人脂肪形成具有显著影响。PKC、PI3K以及PLCγ的抑制(如上所示)都能明显降低分化水平。在前脂肪细胞复制阶段，单独抑制MEK和p38激酶明显降低随后的细胞分化。
这里所引用的每一份专利、专利申请和出版物的公开通过参考文献作为其整体特此组合在本说明书中。
这里任何参考文献的引用不能被认为是承认这些参考文献对于本申请而言是可利用的“在先技术”。
整个说明书的目的在于描述本发明优选的实施方案而不是将本发明限定于任何一个实施方案或特征的具体组合。因而精通本领域的人员能够认识到，按照本发明公开，可以在特定的实施例中进行修改和改变而没有离开本发明的范围。所有这样的修改和改变包括在附加权利要求范围以内。
权利要求
1.一种调节脂肪形成的方法，其特征在于，所述方法包括在足以调节一条FGF信号途径的条件下将细胞与试剂接触一段时间。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述FGF信号途径选自FGF-1信号途径和FGF-2信号途径。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂调节一条基因的表达或该基因表达产物的水平或功能活性，其中所述基因选自Fgf基因、Fgfr基因、Hspg基因、属于SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK途径的基因、属于PLCγ-PKC-Ca2+途径的基因、属于FGF-1核转移途径的基因和编码FGF胞内结合伴侣的基因。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞与调节一条基因的表达或该基因表达产物的水平或功能活性的试剂接触，其中所述基因选自Fgf基因和与该Fgf基因属于同一调控或生物合成途径的基因。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞是微血管内皮细胞或其前体。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述Fgf基因选自Fgf-1和Fgf-2。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，与Fgf基因属于同一调控或生物合成途径的基因选自P34和FIF。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞与调节一条基因的表达或该基因表达产物的水平或功能活性的试剂接触，其中所述基因选自Fgfr基因、与Fgfr基因属于同一调控或生物合成途径的基因、其表达受Fgf基因表达产物直接或间接调节的基因、或激活或拮抗与FGF相互作用的FGFR的功能的基因。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述Fgfr基因选自Fgfr-1、Fgfr-3和Fgfr-4。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述与Fgfr基因属于同一调控或生物合成途径的基因编码一种多肽，所述多肽选自多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖-2、多配体蛋白聚糖-3、多配体蛋白聚糖-4、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6、基底膜蛋白多糖、β聚糖、CFR、SHC、Crk、FRS2、Src、FAK、Nek、Shb、SHP2、GRB-2、SOS、80K-H、pp66、Gab1、P38 MAPK、PI3K、AKT、PKB、RAS、RAF、ERK1，2、MAPKKK、MAPKK、MAPK、Jun、Fos、FPPS、PLC、Fes、PIP2、DAG、Ca2+离子通道、IP3、CaM激酶、PKC、PKA、cAMP、CREB和CBP。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，其表达受Fgf基因表达产物直接或间接调节的基因选自Pparγ、Igfbp-3、Igfbp-6、Igf-2、Irs-2、Pi3激酶和Pkcθ。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述与FGFR相互作用的FGF是FGF-1或FGF-2。
13.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细胞是前脂肪细胞或其前体。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂拮抗FGF信号途径以降低前脂肪细胞的分化潜能和/或增殖。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述试剂降低一条基因的表达或该基因表达产物的水平或功能活性，其中所述基因选自Fgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpα、Plcγ2、Igfbp-3和Igfbp-6。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述试剂提高一条基因的表达或该基因表达产物的水平或功能活性，其中所述基因选自Fgf-1、Fgfr-3、Igf-2、Irs-2、Pi3激酶和Pkcθ。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述试剂拮抗FGFR的功能或干扰FGFR与FGF之间的相互作用。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂激活FGF信号途径以提高前脂肪细胞的分化潜能和/或增殖。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述试剂降低一条基因的表达或该基因表达产物的水平或功能活性，其中所述基因选自Fgf-1、Fgfr-3、Igf-2、Irs-2、Pi3激酶和Pkcθ。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述试剂提高一条基因的表达或该基因表达产物的水平或功能活性，其中所述基因选自Fgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpα、Plcγ2、Igfbp-3和Igfbp-6。
21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述试剂激活FGFR的功能，或增强、促进或以其他方式导致FGFR和FGF之间的相互作用。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，相对于不存在所述试剂时的表达、水平或功能活性，所述试剂至少以10％的幅度提高或降低基因表达或表达产物的水平或功能活性。
23.一种识别调节FGF信号途径的试剂的方法，其特征在于，所述方法包括将一种制品与一种待测试剂接触，其中所述制品包括(i)一条包含对应于FGF信号途径中一个多肽组分的至少一个生物学活性片段或其变异体或衍生物的氨基酸序列的多肽；或(ii)以可操作方式与报道基因相连的一条包含至少部分调控该组分的一个遗传序列的多核苷酸；并探测相对于不存在该待测试剂时，正常或参照水平和/或功能活性的所述多肽组分或所述报道基因表达产物的水平和/或功能活性的改变，这可说明所述试剂调节FGF信号途径。
24.一种识别调节FGF信号途径的试剂的方法，其特征在于，所述方法包括将表达一种FGFR的第一细胞样品与一种FGF接触并检测至少一种标记；将表达该FGFR的第二细胞样品与该FGF及一种试剂接触并检测所述标记；以及将第一细胞样品的标记与第二细胞样品的标记进行比较。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述标记选自甘油3磷酸脱氢酶、FGF途径胞内组分及其组合。
26.一种试剂在制造用于抑制或降低脂肪形成、或用于在肥胖或脂肪形成局部异常增加疾病中控制脂肪形成的药物中的应用，其特征在于，所述试剂拮抗一条FGF信号途径。
27.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述抑制或以其他方式降低脂肪形成的试剂与FGF或FGFR或调节Fgf或Fgfr基因表达的遗传序列相结合，这是通过以下方法测定的将包含FGF或FGFR多肽或其生物学活性片段、或其变异体或衍生物、或调节Fgf或Fgfr基因表达的遗传序列的制品与所述试剂接触；并探测FGF或FGFR多肽或其生物学活性片段、或其变异体或衍生物、或由所述遗传序列表达的产物的水平或功能活性的降低。
28.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述抑制或以其他方式降低脂肪形成的试剂拮抗一条FGF信号途径，这是通过以下方法测定的将FGFR和FGF与所述试剂接触并检测FGFR与FGF的结合，当所述试剂降低或阻断FGFR与FGF的结合时，该试剂测试为阳性。
29.如权利要求28所述的应用，其特征在于，所述试剂是FGF或FGFR特异的抗原结合拮抗分子。
30.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述抑制或以其他方式降低脂肪形成的试剂拮抗一条FGF信号途径，这是通过以下方法测定的将FGFR及HSPG与所述试剂接触并检测FGFR与HSPG的结合，当所述试剂降低或阻断FGFR与HSPG的结合时，该试剂测试为阳性。
31.如权利要求30所述的应用，其特征在于，所述试剂是HSPG或FGFR特异的抗原结合拮抗分子。
32.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述抑制或以其他方式降低脂肪形成的试剂拮抗FGF信号途径，这是通过以下方法测定的将FGF及CFR与所述试剂接触并检测FGF与CFR的结合，当所述试剂降低或阻断FGFR与HSPG的结合时，该试剂测试为阳性。
33.如权利要求30所述的应用，其特征在于，所述试剂是FGF或CFR特异的抗原结合拮抗分子。
34.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述抑制或以其他方式降低脂肪形成的试剂拮抗FGF信号途径，这是通过以下方法测定的将选自前脂肪细胞或其前体的第一细胞样品与FGF接触并检测细胞的分化和/或增殖；将选自脂肪细胞或其前体的第二细胞样品与FGF及一种试剂接触并检测细胞的分化和/或增殖；将第一细胞样品的分化和/或增殖与第二细胞样品的分化和/或增殖进行比较，当所述试剂增强细胞的分化和/或增殖时，该试剂测试为阳性。
35.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述试剂通过干扰FGF与FGFR的结合、通过干扰FGFR的磷酸化、通过干扰FGF/FGFR相互作用的上游或下游信号途径上的组分、通过干扰FGFR与HSPG的结合、通过干扰FGF与CFR的结合、或通过干扰FGFR的二聚化拮抗FGF信号途径。在一些实施方案中，拮抗FGF信号途径干扰信号途径的试剂选自TGF、IGF-1和WNT信号途径的信号途径。
36.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述抑制或以其他方式降低脂肪形成的试剂拮抗FGF信号途径，这是通过以下方法测定的将拮抗该信号途径的试剂对动物模型或人给药并检测动物对该试剂的反应，当所述试剂抑制或降低动物体内脂肪形成时，该试剂测试为阳性。
37.一种试剂在制造在恶病质或局部脂肪缺失症状的治疗或预防用于刺激脂肪形成的药物的应用，其特征在于，所述试剂激活FGF信号途径。
38.如权利要求37所述的应用，其特征在于，所述刺激脂肪形成的试剂与FGFR或一条调节Fgfr基因表达的遗传序列结合，这是通过以下方法测定的将包含一条FGFR多肽或其生物学活性片段、或其变异体或衍生物、或调节Fgf或Fgfr基因表达的遗传序列的制品与所述试剂接触；并探测所述FGFR多肽或其生物学活性片段、或变异体或衍生物、或由所述遗传序列所表达的产物的水平或功能活性的提高。
39.如权利要求37所述的应用，其特征在于，所述刺激脂肪形成的试剂激活FGF信号途径，这是通过以下方法测定的将FGFR及FGF与该试剂接触并检测FGFR与FGF的结合，当所述试剂刺激FGFR与FGF的相互作用时，该试剂测试为阳性。
40.如权利要求39所述的应用，其特征在于，所述试剂是FGF或FGFR特异的抗原结合激活分子。
41.如权利要求37所述的应用，其特征在于，所述刺激脂肪形成的试剂激活FGF信号途径，这是通过以下方法测定的将FGFR及HSPG与该试剂接触并检测FGFR与HSPG的结合，当所述试剂刺激FGFR与HSPG的相互作用时，该试剂测试为阳性。
42.如权利要求41所述的应用，其特征在于，所述试剂是HSPG或FGFR特异的抗原结合激活分子。
43.如权利要求37所述的应用，其特征在于，所述刺激脂肪形成的试剂激活FGF信号途径，这是通过以下方法测定的将FGF及CFR与该试剂接触并检测FGF与CFR的结合，当所述试剂刺激CFR与FGF相互作用时，该试剂测试为阳性。
44.如权利要求43所述的应用，其特征在于，所述试剂是FGF或CFR特异的抗原结合激活分子。
45.如权利要求37所述的应用，其特征在于，所述增强脂肪形成的试剂激活FGF信号途径，这是通过以下方法测定的将选自前脂肪细胞或其前体的第一细胞样品与FGF接触并检测细胞的分化和/或增殖；将选自前脂肪细胞或其前体的第二细胞样品与FGF及一种试剂接触，并检测细胞的分化和/或增殖；将第一细胞样品的分化和/或增殖与第二细胞样品的分化和/或增殖进行比较，当所述试剂刺激细胞的分化和/或增殖时，该试剂测试为阳性。
46.如权利要求45所述的应用，其特征在于，所述试剂通过刺激FGF与FGFR的结合、通过刺激FGFR的磷酸化、通过刺激FGFR与HSPG的结合、通过刺激FGF与CFR的结合、通过刺激FGFR的二聚化或通过刺激FGF/FGFR相互作用的上游或下游信号途径激活FGF信号途径。
47.如权利要求37所述的应用，其特征在于，所述刺激脂肪形成的试剂激活FGF信号途径，这是通过以下方法测定的将激活该信号途径的试剂对动物模型或人给药，并检测动物对该试剂的反应，当所述试剂刺激动物体内脂肪形成时，该试剂测试为阳性。
48.一种制造用于在脂肪相关疾病中调节脂肪形成的试剂的方法，其特征在于，所述方法包括测试怀疑能调节FGF信号途径的试剂；并在其对调节的测试为阳性的基础上合成该试剂。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括衍生该试剂，并任选将所述衍生的试剂与药学上可接受的载体和/或稀释剂配伍。
50.一种在患者中发现脂肪相关疾病或诊断脂肪相关疾病风险的方法，其特征在于，所述方法包括在取自患者的生物制品中确定参与FGF信号途径的异常基因或参与FGF信号途径的基因的异常表达产物的存在，其中所述异常基因或异常表达产物与疾病的存在或风险相关。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述异常基因选自异常Fgf基因和异常Fgfr基因。
52.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述异常表达产物选自异常Fgf表达产物和异常Fgfr表达产物。
53.一种用于在患者中发现与脂肪异常增生相关的疾病或诊断其风险的方法，其特征在于，所述方法包括在取自患者的生物制品中确定参与FGF信号途径的异常基因或参与FGF信号途径的基因的异常表达产物的存在，其中所述异常基因或异常表达产物与所述疾病的存在或风险相关。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述疾病选自肥胖和脂肪形成局部异常增加疾病。
55.如权利要求53所述的方法，其特征在于，脂肪形成局部异常增加疾病选自脂肪瘤和脂肪过多症。
56.一种用于在患者中发现与脂肪异常增生相关的疾病或诊断其风险的方法，其特征在于，所述方法包括确定细胞中参与FGF信号途径的基因表达产物的水平或功能活性，该水平或功能活性与该表达产物的正常参照水平或功能活性不同。
57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述方法包括确定选自Fgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpα、Plcγ2、Igfbp-3、Igfbp-6的基因表达产物水平或功能活性的提高或增强，其中所述细胞是前脂肪细胞或其前体。
58.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述方法包括测定选自Fgf-1、Fgfr-3、Igf-2、Irs-2、Pi3激酶、Pkcθ的基因的表达产物的水平或功能活性的降低，其中所述细胞是前脂肪细胞或其前体。
59.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述方法包括测定选自Fgf-1和Fgf-2的基因表达产物的水平或功能活性的提高或增强，其中所述细胞是微血管内皮细胞。
60.一种用于在肥胖或脂肪形成局部异常增加疾病中抑制或降低脂肪形成的方法，其特征在于，所述方法包括给需要这样治疗的患者服用脂肪形成抑制有效量的降低或干扰FGF信号途径的试剂，以及任选的药学上可接受的载体或稀释剂。
61.一种治疗或预防恶病质或局部脂肪缺失症状的方法，其特征在于，所述方法包括给需要这样治疗的患者服用增强脂肪形成有效量的刺激FGF信号途径的试剂，以及任选的药学上可接受的载体或稀释剂。
62.一种调节FGF信号途径的试剂在制备用于治疗或预防脂肪相关疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了用于调节前脂肪细胞分化潜能和/或增殖的方法和试剂。更具体地说，本发明公开了用来调节成纤维细胞生长因子(FGF)信号途径的，特别是FGF－1或FGF－2信号途径，以治疗或预防脂肪相关疾病的方法和试剂，所述疾病包括但不仅限于肥胖、脂肪瘤、脂肪过多症、恶病质或脂肪营养不良或创伤或萎缩性疾病中的脂肪组织缺失。
文档编号C12Q1/68GK1678734SQ03820407
公开日2005年10月5日 申请日期2003年6月27日 优先权日2002年6月27日
发明者J·B·普林斯, L·J·赫特雷 申请人:昆士兰大学, 昆士兰医学研究所委员会