专利名称：用于检测创伤弧菌的引物和探针以及使用他们的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种在食品检测、流行病学环境检测、以及临床检查中用于检测、识别、或定量创伤弧菌的方法。
背景技术：
创伤弧菌(Vibrio Vulnificus是一种存在于海水和微咸水地区的嗜盐性革兰氏-阴性细菌。尽管很少感染健康人类，但创伤弧菌却感染患有严重原发性疾病如肝硬化的病人并可导致严重传染病。作为与死亡病例相关的传染性细菌，它已在公众健康中引起注意。由此种细菌产生的传染病的第一个病例报告包括通过Roldan于1970年(New Engl.J.Med.，282，1306，1970)从下端坏疽中的分离细菌。这一病例最初被认为是Vibrio rahaemolyticus的肠外感染的病例。自此披露了这种细菌降解乳糖要比大肠杆菌及其类似菌慢得多，并且不能在8％NaCl存在的情况下增殖，因此在1979年，此菌被Farmer命名为创伤弧菌(Lancet，ii，903，1979).
这种细菌基于其生物特性被分为生物型1-3(Appl.Environ.Microbiol.，63，1460-1466 1997，Lancet，354，1421-1424 2000)。那些分离于人类传染病的主要为1型，2型主要作为感染鱼的病原细菌被分离。此外，那些3型作为导致发生在1996和1997年期间在犹太人中大量感染的病原细菌被分离(Lancet，354，1421-14242000)。
这种细菌的感染形式包括口腔感染型和伤口感染型。口腔感染型主要通过夏季吃生的海产品所致，在消化系统疾病如发烧发作、腹痛、腹泻和/或感染后24小时内呕吐的症状发展之后伴随着复杂的脓血症，导致平均48小时内死亡。死亡率非常高，在50％和70％之间。此外，伤口感染是通过伤口与海水接触所至，在伴随着12小时潜伏期后1周内发作发生。其死亡率为25％，低于口腔感染的死亡率。在U.SA.，从1988-1996在22个州内报道了422个病例。至于传染源，反映美国饮食习惯的大多数病例由摄取生牡蛎引起。同时，在Kanto的太平洋沿岸和日本的西部报道大约90个病例，并且感染主要是通过吃生海鲜如生鱼片和寿司所至。近来，例如2001年7月在Kumamoto，4人由于吃生虾蛄和flatheads感染了此种细菌，且他们中的2人死亡。在日本，伴随着他们饮食生海鲜的文化，由创伤弧菌所致的传染病可以说是警告的原因。
在此种细菌的选择性分离中，主要使用TCBS琼脂培养基，与用于副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)的相似。创伤弧菌形成与那些通过副溶血弧菌在TCBS培养基上形成的非常相似的蓝绿色的菌落。需要证明用于区别的不同的生化性质。证明方法复杂并伴随错误识别的危险。与此同时，改进的选择培养基如SPS琼脂(SDS-多粘菌素B蔗糖琼脂)培养基(FEMS Microbiol.Lett.，17，205-209 1983)或纤维二糖-collistin琼脂培养基(Appl.Environment.Microbiol.，64，1721-1724 1998)也已被报道，根据证明生化特性所需要的程序是一样的。
在此期间，已发展了一些用于检测创伤弧菌的遗传工程技术应用的方法，类似于其它食物中毒细菌的情况。“wza”发现于E.coli，并作为编码用于转运CPS(夹膜多糖)从周质至膜外所必须的转运子(transporter)的基因。在创伤弧菌的例子中，由于缺乏夹膜的菌株对老鼠不存在任何毒性，且WZA-缺失的菌株失去了其对老鼠的治病性(Infect.Immun.69，6893-6901 2001)，因此wza被认为是致病原因之一。相应地，作为用于检测具有致病性的创伤弧菌的方法，以wza为目标的引物已由Wright et al发展(U.S.Patent 6183973，Feb.，6，2001)。然而，创伤弧菌的致病因子并不只限于CPS，所以并不是所有的带有致病性的创伤弧菌总能被检测出来。此外，还发展了以被认为也是创伤弧菌的致病因子之一的溶血素基因(vvh创伤弧菌hemolysin)为目标的引物(Appl.Environ.Microbiol.57，707-711 1991)。根据vvh基因是创伤弧菌特异性基因这一假设设计了引物。然而，已报道，V.cholerae和V.mimicus溶血素基因显示出与vvh基因同源(Infect.Immum.58，2706-2709 1990；Infect.Immun.65，1830-1835 1997)。此外，根据设计的引物，并没有与这些溶血素基因进行对比。因此，不能说特异性已被充分证明。
如上所述，有关现有的使用基因来检测创伤弧菌的方法，不能说特异性是充分的。
发明概述传统的遗传筛选方法的共性是这些方法忽视了细菌的“种”是含有遗传多样性的一个种群这一事实。使用被推断为细菌种群的一个成员的1株的核苷酸序列作为该种群的共同序列或作为代表该种群的序列在基因迅速积累的中性突变的分子进化特征方面是非常危险的。特别地，这关系到这种使用能导致错误识别致使最初要被检测的菌株由于引物区域内的轻微突变被禁止扩增而不能被检测到。这还关系到不需被检测到的非常相关的菌株因为引物的不充分的特异性将被检测到。因此，需要生产一种高效和特异性的基因扩增引物和一种高效和特异性的探针用于检测、识别或定量创伤弧菌，其具有证明的特异性背景，错误识别的低可能性，和实践上充分的扩增效率以及扩增特异性。
为了产生用于特异性检测细菌系统发生群(group)的基因的方法，收集要被检测的生物群的尽可能多的核苷酸序列以及系统发生学上接近这些群的生物群的尽可能多的核苷酸序列是必要的。此外，特异性检测的靶基因应具有足够不同的核苷酸序列致使它能从最接近地相关的机体中区分出来。为此，靶基因必须具有足够快速的进化速度。此外，像在以高频率水平遗传的基因的(如，副溶血弧菌的毒素基因)情况，独立于种群(phylem)存在的基因不能被使用。在本发明中作为靶基因使用的由gyrB基因，rpoD基因和recA基因编码的蛋白对于生存是必须的。因为这一原因，这些基因很难水平遗传并具有适当的进化速度，所以他们优选用于细菌系统发生分析。我们已开发了一种便利的用于确定核苷酸序列的方法，该方法包括将gyrB基因和rpoD基因进行PCR直接测序方法(JP，07-213229，A(1995)，JP，08-256798，A(1996))。
此外，我们已从环境中分离了大量的创伤弧菌。同时，根据一已知的普通创伤弧菌菌株和那些根据基于16SrRNA序列的分析报道的相关该菌株的菌株纳瓦拉弧菌(V.navarrensis)、双氮养弧菌(V.diazotrophicus)、奥氏弧菌(V.ordalii)、鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)、构氏弧菌(V.metschnikovii)、辛辛那提弧菌(V.Cincinnatiensis)、最小弧菌(V.mimicus)和霍乱弧菌(V.chorelae)(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51，1449-1456(2001))，我们已分析了下表1中列出的菌株的gyrB、rpoD和recA基因的部分核苷酸序列，并基于这些序列进行了系统发生分析，因此揭示其系统发生关系。
表1使用的菌株
特殊的，在将上表1中所示的测试菌株用补充2％NaCl的脑心浸液培养基进行富集培养之后，使用PUREGENE DNA分离试剂盒(Gentra SYSTEMS)提取染色体DNA。使用提取的DNA作为模板，使用gyrB通用扩增引物UP-1E(5′-caggaaacagctatgaccaygsnggnggnaarttyra-3′)和AprU(5′-tgtaaaacgacggccagtgcnggrtcyttytcytgrca-3′)，通过PCR扩增长度为大约900bp(相应Escherichia coli菌株K-12的位点331-1212的核苷酸序列或位点111-404的氨基酸序列的区域)的gyrB基因片段。此外，相似地，使用rpoD通用扩增引物70F-M13(5′-caggaaacagctatgaccyatgmgngaratgggnacngt-3′)和70R-M13(5′-tgtaaaacgacggccagtngcytcnaccatytcyttytt-3′)，通过PCR扩增长度为大约800bp(相应Escherichia coli菌株K-12的位点334-1125的核苷酸序列或位点112-376的氨基酸序列的区域)的ropD基因片段。此外，使用recA基因通用扩增引物recUF和recUR(recUFcaggaaacagctatgaccatggaygtngaracnat和recURtgtaaaacgacggccagttanswrtaccangcncc)，通过PCR扩增长度为648bp(相应Escherichia coli菌株K-12的位点172-819的核苷酸序列或位点58-273的氨基酸序列的区域)的recA基因片段。使用热稳定的DNA聚合酶(AmpliTaq Gold由Applied Biosystems生产)和GENE MATE热循环器(ISC BioExpress)进行扩增反应。制备50μl含有1μg DNA的反应溶液，50mMKCl，10mM Tris-HCl(pH 8.3)，1.5mM MgCl2，0.01％明胶，dNTP(每种0.2mM)，2.5U AmpliTaq Gold，和引物(每种1μM)。反应在AmpliTaq Gold活化的条件下进行(95℃，10分种)，94℃反应1分钟，退火1分钟(56℃，gyrB和rpoD；54℃，recA)，72℃反应2分钟，共40个循环，然后72℃延长10分钟。使用1％琼脂糖凝胶将获得的PCR产物进行电泳(0.5xTAE和100V，30分钟)(SeaPlaque GTG琼脂糖由BioWhittaker Molecular Applications生产)，然后用溴化乙啶染色10分钟。UV照射证明扩增产物存在，从凝胶上切除，然后用WizardPCR Preps DNA纯化系统(由Promega生产)进行纯化，从而制备了用于序列扩增的模板。使用先前加入到通用引物的M13R序列(5′-CAggAAACAgCTATgACC-3′)和M13-21序列(5′-TgTAAAACgACggCCAgT-3′)作为引物，ABI PRI SM BigDye Terminator Cycle Sequenceing Ready Reaction试剂盒(产品由Applied Biosystems生产)，和GENE MATE热循环仪(ISC BioExpress)进行序列反应。通过混合20ngDNA，3.2pmol引物，和8μl BigDye Terminator ReadyReaction Mix来制备终体积为20μl的反应溶液。通过92℃加热10分钟，和反应25个循环(96℃ 10秒，50℃5秒，和60℃4分钟)进行循环序列反应。使用ABIPRISM 310 GENETIC ANALYZER(由Applied Biosystems生产)分析核苷酸序列。根据使用获得的核苷酸序列的系统发生分析，至更精确地理解创伤弧菌的密切相关物种，在连接gyrB、rpoD和recA基因的部分序列后进行分析。特别地，在连接上述3个基因序列后，使用Clustal W计算机程序进行多重比对分析。随后，通过使用PHYLIP计算机程序设备，通过基于使用Kimura’s 2-参数模式(J.Mol.Evol.(1980)Vol.16，No.2，pp.111-20)计算的遗传距离的neighbor-joining方法(Mol.Biol.Evol.VOL.4，NO.4，406-425)来制作系统发生树。
结果，显示所有用于分析的创伤弧菌菌株在Vibvrio属菌株中组成一个独立的单种群(
图1)。特别地，建议属于此种群的细菌菌群应被确定为创伤弧菌。
因此，为了建立一个仅能检测创伤弧菌菌群的遗传方法，密切相关的种间核苷酸序列的第一区别被披露。也就是说，识别在创伤弧菌菌群内保守的，但不同于Vibrio属的其它菌群的核苷酸位点。特别地，找到创伤弧菌所属的系统发生组的一致序列并与基于系统发生分析的结果确定的相关种群的图1C1至C3簇的一致序列进行对比。从而，绘制种的系统发生特异性信息图谱(图2、3和4)。根据图2-4，显示在gyrB基因的情况中，SEQ ID NO1的位点3、15、69、95、121、123、132、136、138、139、231、424、549、557、603、700、701、726、727、728、734、735、738和804；在rpoD基因的情况中，SEQ ID NO2的位点21、33、60、120、126、235、260、312、315、340、354、396、414、459、462、570、686、689、732、750和756；和在recA基因的情况中，SEQ ID NO3的位点9、81、138、153、172、180、208、228、237、288和540是创伤弧菌所属的种群特异的。针对含有这些特征核苷酸的种群特异性序列的使用使具有高特异性的探针和具有高特异性以及极好扩增效率的基因扩增引物的设计成为可能。例如，使用15或更多个gyrB、rpoD、和recA基因连续核苷酸序列的核苷酸(含有不同于那些密切相关的种的核苷酸，使得总是含有与那些密切相关的种的核苷酸不同的位点)，优选20或更多核苷酸，和进一步优选gyrB、rpoD、和recA基因的连续核苷酸序列的20或更多核苷酸和40或更少核苷酸设计基因扩增引物成为可能。类似地，使用15或更多个gyrB、rpoD、和recA基因核苷酸序列的连续核苷酸(含有不同于那些密切相关的种的核苷酸，使得总是含有与那些密切相关的种的核苷酸不同的位点)，优选20或更多核苷酸，和进一步优选gyrB、rpoD、和recA基因的连续核苷酸序列的20或更多核苷酸，以及进一步优选20或更多核苷酸及100或更少连续核苷酸序列设计探针成为可能。此外，为了制备引物和探针，以高频率含有上述不同核苷酸的区域优选使用，例如，在gyrB基因的情况中，含有位点121、123、132、136、138、和139中的2个或更多位点的区域，含有位点549和557的区域，含有位点700和701的区域，和含有位点726、727、728、734、735、和738中的2个或更多位点的区域；在rpoD基因的情况中，含有位点21和33的区域，含有位点120和126的区域，含有位点312和315的区域，含有位点340和354的区域，含有位点396和414的区域，含有位点459和462的区域，含有位点686和689的区域，和含有位点732、750、和756中的2个或更多个位点的区域；在recA基因的情况中，含有位点138和153的区域，含有位点172和180的区域，含有位点208、228、和237中的2个或更多个位点的区域，和含有位点228和237的区域。
含有这些区域的链或其互补链可被用作基因扩增引物。此外，如果必需的话，其它序列如适配子(adapter)序列或标签序列也可包括其中。
在gyrB的情况中，优选的引物的例子是含有序列5′-gtgtctggcggtctt-3′(权利要求10，SEQ ID NO4)，5′-gatgcaccgcttgctatcatc-3′(权利要求11，SEQ ID NO5)，5′-tgcggacttyacttcrct-3′(权利要求12，SEQ ID NO6)，5′-gtccatgtagctgttcart-3′(权利要求13，SEQ ID NO7)，5′-ttgtctgccatgaaggattcc-3′(权利要求14，SEQ ID NO8)的链(核酸)或其互补链；或含有这些序列或它们的互补链的任一序列的链(核酸)。
在rpoD的情况中，优选的引物的例子是含有序列5′-aatcgacatcgctaamcga-3′(权利要求28，SEQ ID NO9)，5′-gttcgacaaagtacaagcg-3′(权利要求29，SEQ ID NO10)，5′-tcaagcagygattcagag-3′(权利要求30，SEQ ID NO11)，5′-aatggcgctagagaag-3′(权利要求31，SEQ ID NO12)，5′-cktraatgaacatggtcga-3′(权利要求32，SEQ ID NO13)，5′-gaactgatgctcgatgtgttt-3′(权利要利要求33，SEQ ID NO14)，5′-aatgtcttcttcgtgmagyt-3′(权利要求34，SEQ ID NO15)，5′-ttgatgttgytyactgaaagc-3′(权利要求35，SEQ ID NO16)的链(核酸)或其互补链；或含有这些序列或它们的互补链的任一序列的链(核酸)。
在recA的情况中，优选的引物的例子是含有5′-cctgtgtatgcgaagaarctt-3′(权利要求44，SEQ ID NO17)，5′-tatcgaccarttrttggta-3′(权利要求45，SEQ ID NO18)，5′-aagmgcatcacagatttccaa-3′(权利要求46，SEQ ID NO19)，5′-tcaaccgcmcctgagcgagca-3′(权利要求47，SEQ ID NO20)的链(核酸)或其互补链；或含有这些序列或它们的互补链的任一序列的链(核酸)。
此外，在引物的情况中，3′-末端优选为创伤弧菌特异性的核苷酸。本发明包含使用这些引物和探针与其它试剂的结合用于检测、量化、或识别创伤弧菌的试剂盒。
使用本发明引物的基因扩增方法并不限于PCR方法。引物可被用于基于引物特异性的特定扩增方法或用于特定抑制性扩增的方法。此外，引物也可被类似地用于使用特定扩增引物和标记的特异性探针相结合的定量和扩增反应。此外，本发明的探针也可被单独使用。使用探针的方法并不限于固相或液相之一。
引物和探针也可被用于实施使用试剂如cyber green来检测扩增的双链DNA的实时PCR或应用FRET等的实时PCR。
本说明书包括在日本专利申请No.2001-306868的说明书或附图中披露的部分或所有内容，其为本申请的优先权文本。
附图简述图1显示了连接gyrB、rpoD、和recA基因的部分序列后的系统发生分析的结果。它是一个通过neighbor-joining绘制的系统发生树，显示了创伤弧菌(如V.v.在图中指示)属于不同于那些属于Vibrio属的其它细菌的单种群。此外，不同于创伤弧菌的组被分类为C1-C4。E.coli K12菌株和霍乱弧菌N16961菌株的基因资料，在GenBank数据库中使用的登录号分别为NC00913和NC002505。另外，根据页码从顶端至底端排列图。
图2显示了图1所示的创伤弧菌所属组的gyrB基因的一致序列(上面的情况)和相关组(图1中的C1、2和3)的gyrB基因的一致序列(下面的情况)间的比较和确定的结果。它显示用●表示的位置是创伤弧菌特异的核苷酸。其显示D＝A或G或T，H＝A或C或T，V＝A或C或G，R＝A或G，Y＝C或T，K＝G或T，M＝A或C，S＝G或C，W＝A或T，和N＝A或G或T或C。
图3显示了图1所示的创伤弧菌所属组的ropD基因的一致序列(上面的情况)和相关组(图1中的C1、2和3)的ropD基因的一致序列(下面的情况)间的比较和确定的结果。它显示用●表示的位置是创伤弧菌特异的核苷酸。其显示D＝A或G或T，H＝A或C或T，V＝A或C或G，R＝A或G，Y＝C或T，K＝G或T，M＝A或C，S＝G或C，W＝A或T，和N＝A或G或T或C。
图4显示了图1所示的创伤弧菌所属组的recA基因的一致序列(上面的情况)和相关组(图1中的C1、2和3)的recA基因的一致序列(下面的情况)间的比较和确定的结果。它显示用●表示的位置是创伤弧菌特异的核苷酸。其显示D＝A或G或T，H＝A或C或T，V＝A或C或G，R＝A或G，Y＝C或T，K＝G或T，M＝A或C，S＝G或C，W＝A或T，和N＝A或G或T或C。
实施本发明的最好方式本发明将在后面通过提及的实施例被详细描述，但这些实施例并不是对本发明的限制。
实施例1显示了根据本发明使用应用创伤弧菌特异性的区域设计和获得的引物进行基因扩增的实施例。
表2.特异性检测创伤弧菌的引物
a)表示距离SEQ ID NOS1-3所代表的核苷酸序列5′末端的位置。
另外，权利要求11、14、33、35、44、和47中描述的引物对应于表2中的VF1、VR1、VrF2、VrR2、VVrecF2、和VVrecR2，并分别被SEQ ID NO5、SEQID NO8、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、和SEQ ID NO20所代表。
使用从试验菌株中提取的染色体DNAs为模板进行PCR。使用热稳定的DNA聚合酶(AmpliTaq Gold由Applied Biosystems生产)和GENE MATE热循环仪(ISC BioExpress)进行扩增反应。制备终体积为20μl并含有0.1μg DNA 50mMKCl，10mM Tris-HCl(pH 8.3)，1.5mM MgCl2，0.01％明胶，dNTP(每种0.2mM)，2.5U AmpliTaq Gold，和引物(其浓度见表3)的反应溶液。反应在AmpliTaq Gold活化的条件下进行(95℃，10分钟)，94℃反应1分钟，退火1分钟(gyrB基因65℃，rpoD 基因63℃，recA基因5℃)，和72℃1分钟，共35个循环，最后72℃延长10分钟。引物混合物和扩增反应条件如表3所示。
表3.用于特异性检测创伤弧菌的引物的PCR条件
使用1％琼脂糖凝胶(琼脂糖S由NIPPON GENE CO.，LTD.生产)将扩增后的5μl反应溶液进行电泳(0.5xTAE和100V，30分钟)然后用溴化乙啶染色。UV照射下证明扩增基因的存在或不存在。使用以gyrB为目标基因的VF1和VR1引物的组合，以rpoD为目标基因的VrF2和VrR2引物的组合，以recA为目标基因的VvrecF2和VvrecR2引物的组合，通过PCR筛选来自于表1所示菌株的DNAs。结果显示于表4。只对于来自于表1所示的确定属于创伤弧菌的菌株的DNA扩增产物被证实。，这揭示对于所用组合，只有创伤弧菌能被检测到。
表4 使用用于特异性检测V.vulnificus的引物的PCR结果
此中引用的所有出版物、专利和专利申请在此全部结合作为参考。
工业实用性本发明的gyrB、rpoD、和recA基因引物和探针已基于与创伤弧菌的系统发生关系的理解被设计。因此，这些引物和探针已被研究用于增强其特异性，并且根据检测精确性是极好的。因此，当在细菌未从食物、临床样品、或其类似物中分离以及被相关细菌种污染的环境下进行直接检测时，这些引物和探针是用的。
序列表单独文本SEQ ID NOS4-20是引物。
序列表<110>Nichirei Corporation<120>检测创伤弧菌的方法以及相应的引物和探针<130>PH-1839-PCT<150>JP 2002-255126<151>2002-08-30<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>885<212>DNA<213>
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<223>人工序列的描述引物<400>5gatgcaccgc ttgctatcat c21<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6tgcggactty acttcrct18
<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7gtccatgtag ctgttcart 19<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8ttgtctgcca tgaaggattc c21<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
<400>9aatcgacatc gctaamcga 19<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10gttcgacaaa gtacaagcg 19<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>11tcaagcagyg attcagag18<210>12
<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>12aatggcgcta gagaag 16<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>13cktraatgaa catggtcga 19<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>14gaactgatgc tcgatgtgtt t21<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>15aatgtcttct tcgtgmagyt 20<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>16ttgatgttgy tyactgaaag c21
<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>17cctgtgtatg cgaagaarct t21<210>18<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>18tatcgaccar ttrttggta 19<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物<400>19aagmgcatca cagatttcca a21<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>20tcaaccgcmc ctgagcgagc a2权利要求
1.SEQ ID NO1所代表的基因片段，其在序列表中SEQ ID NO1的编码DNA旋转酶β亚基的基因(gyrB)的位点3、15、69、95、121、123、132、136、138、139、231、424、549、557、603、700、701、726、727、728、734、735、738和804中的任何位点上含有一个或多个核苷酸，所述位点对于创伤弧菌菌群是唯一的，所述基因片段能被用于设计特异性基因扩增引物或特异性探针。
2.基因扩增引物，其含有包含15个或更多个连续核苷酸的一条链或其互补链，其中一个或多个核苷酸是在序列表中SEQ ID NO1的编码DNA旋转酶β亚基的基因(gyrB)的位点3、15、69、95、121、123、132、136、138、139、231、424、549、557、603、700、701、726、727、728、734、735、738和804中的任何位点上的核苷酸，所述位点对于创伤弧菌菌群是唯一的。
3.权利要求2的基因扩增引物，其中使用了以高频率含有如权利要求2中指定的对创伤弧菌唯一的位点的区域。
4.权利要求3的基因扩增引物，其含有包含序列表中SEQ ID NO1的位点3和15的核苷酸的一条链或其互补链。
5.权利要求3的基因扩增引物，其含有包含序列表SEQ ID NO1的位点121、123、132、136、138、和139中的任何位点的2个或更多个核苷酸的一条链或其互补链。
6.权利要求3的基因扩增引物，其含有包含序列表中SEQ ID NO1的位点549和557的核苷酸的一条链或其互补链。
7.权利要求3的基因扩增引物，其含有包含序列表中SEQ ID NO1的位点700和701的核苷酸的一条链或其互补链。
8.权利要求3的基因扩增引物，其含有包含序列表SEQ ID NO1的位点726、727、728、734、735和738中的任何位点的2个或更多个核苷酸的一条链或其互补链。
9.权利要求2的基因扩增引物，其中3′末端核苷酸是如权利要求2中指定的对创伤弧菌唯一的位点的核苷酸。
10.权利要求2的基因扩增引物，其含有5′-gtgtctggcggtctt-3′对应其的互补链。
11.权利要求2的基因扩增引物，其含有5′-gatgcaccgcttgctatcatc-3′或对应其的互补链。
12.权利要求2的基因扩增引物，其含有5′-tgcggacttyacttcrct-3′或对应其的互补链。
13.权利要求2的基因扩增引物，其含有5′-gtccatgtagctgttcart-3′或对应其的互补链。
14.权利要求2的基因扩增引物，其含有5′-ttgtctgccatgaaggattcc-3′或对应其的互补链。
15.一种用于检测、定量或识别创伤弧菌的探针，其含有15个或更多个连续的核苷酸，其中一个或多个核苷酸为序列表中SEQ ID NO1的编码DNA旋转酶β亚基的基因(gyrB)在位点3、15、69、95、121、123、132、136、138、139、231、424、549、557、603、700、701、726、727、728、734、735、738和804中的任何位点的核苷酸，所述位点对于创伤弧菌菌群是唯一的。
16.SEQ ID NO2代表的基因片段，其在序列表中SEQ ID NO2的编码RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的位点21、33、60、120、126、235、260、312、315、340、354、396、414、459、462、570、686、689、732、750和756中的任何位点上含有一个或多个核苷酸，所述位点对于创伤弧菌菌群是唯一的，所述基因片段能被用于设计特异性基因扩增引物或特异性探针。
17.基因扩增引物，其含有包含15个或更多个连续核苷酸的一条链或其互补链，其中一个或多个核苷酸是序列表中SEQ ID NO2的编码RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)在位点21、33、60、120、126、235、260、312、315、340、354、396、414、459、462、570、686、689、732、750和756中的任何位点上的核苷酸，所述位点对于创伤弧菌菌群是唯一的。
18.权利要求17的基因扩增引物，其中使用了以高频率含有如权利要求17中指定的对创伤弧菌唯一的位点的区域。
19.权利要求18的基因扩增引物，其含有包含序列表中SEQ ID NO2的位点21和33的核苷酸的一条链或其互补链。
20.权利要求18的基因扩增引物，其含有包含序列表中SEQ ID NO2的位点120和126的核苷酸的一条链或其互补链。
21.权利要求18的基因扩增引物，其含有包含序列表中SEQ ID NO2的位点312和315的核苷酸的一条链或其互补链。
22.权利要求18的基因扩增引物，其含有包含序列表中SEQ ID NO2的位点340和354的核苷酸的一条链或其互补链。
23.权利要求18的基因扩增引物，其含有包含序列表中SEQ ID NO2的位点396和414的核苷酸的一条链或其互补链。
24.权利要求18的基因扩增引物，其含有包含序列表中SEQ ID NO2的位点459和462的核苷酸的一条链或其互补链。
25.权利要求18的基因扩增引物，其含有包含序列表中SEQ ID NO2的位点686和689的核苷酸的一条链或其互补链。
26.权利要求18的基因扩增引物，其含有包含序列表SEQ ID NO2的位点732、750、和756中的任何位点的2个或更多个核苷酸的一条链或其互补链。
27.权利要求17的基因扩增引物，其中3′末端核苷酸是如权利要求17中指定的对创伤弧菌唯一的位点的核苷酸。
28.权利要求17的基因扩增引物，其含有5′-aatcgacatcgctaamcga-3′或对应其的互补链。
29.权利要求17的基因扩增引物，其含有5′-gttcgacaaagtacaagcg-3′或对应其的互补链。
30.权利要求17的基因扩增引物，其含有5′-tcaagcagygattcagag-3′或对应其的互补链。
31.权利要求17的基因扩增引物，其含有5′-aatggcgctagagaag-3′或对应其的互补链。
32.权利要求17的基因扩增引物，其含有5′-cktraatgaacatggtcga-3′或对应其的互补链。
33.权利要求17的基因扩增引物，其含有5′-gaactgatgctcgatgtgttt-3′或对应其的互补链。
34.权利要求17的基因扩增引物，其含有5′-aatgtcttcttcgtgmagyt-3′或对应其的互补链。
35.权利要求17的基因扩增引物，其含有5′-ttgatgttgytyactgaaagc-3′或对应其的互补链。
36.一种用于检测、定量或识别创伤弧菌的探针，其含有15个或更多个连续的核苷酸，其中一个或多个核苷酸为序列表中SEQ ID NO2的编码RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)在位点21、33、60、120、126、235、260、312、315、340、354、396、414、459、462、570、686、689、732、750、和756中的任何位点的核苷酸，所述位点对于创伤弧菌菌群是唯一的。
37.SEQ ID NO3代表的基因片段，其在序列表中SEQ ID NO3的编码RecA的基因(recA)的位点9、81、138、153、172、180、208、228、237、288和540中的任何位点上含有一个或多个核苷酸，所述位点对于创伤弧菌菌群是唯一的，所述基因片段能被用于设计特异性基因扩增引物或特异性探针。
38.基因扩增引物，其含有包含15个或更多个连续核苷酸的一条链或其互补链，其中一个或多个核苷酸是序列表中SEQ ID NO3的编码RecA的基因(recA)的位点9、81、138、153、172、180、208、228、237、288和540中的任何位点上的核苷酸，所述位点对于创伤弧菌菌群是唯一的。
39.根据权利要求38的基因扩增引物，其中使用了以高频率含有如权利要求38中指定的对创伤弧菌唯一的位点的区域。
40.权利要求39的基因扩增引物，其含有包含序列表中SEQ ID NO3的位点138和153的核苷酸的一条链或其互补链。
41.权利要求39的基因扩增引物，其含有包含序列表中SEQ ID NO3的位点172和180的核苷酸的一条链或其互补链。
42.权利要求39的基因扩增引物，其含有包含序列表中SEQ ID NO3的位点208、228、和273中的任何位点的2个或更多个核苷酸的一条链或其互补链。
43.权利要求39的基因扩增引物，其中3′末端核苷酸是如权利要求39中指定的对创伤弧菌唯一的位点的核苷酸。
44.权利要求38的基因扩增引物，其含有5′-cctgtgtatgcgaagaarctt-3′或对应其的互补链。
45.权利要求38的基因扩增引物，其含有5′-tatcgaccarttrttggta-3′或对应其的互补链。
46.权利要求38的基因扩增引物，其含有5′-aagmgcatcacagatttccaa-3′或对应其的互补链。
47.权利要求38的基因扩增引物，其含有5′-tcaaccgcmcctgagcgagca-3′或对应其的互补链。
48.一种用于检测、定量、或识别创伤弧菌的探针，其含有15个或更多个连续的核苷酸，其中一个或多个核苷酸为序列表中SEQ ID NO3的编码RecA的基因(recA)的位点9、81、138、153、172、180、208、228、237、288和540中的任何位点的核苷酸，所述位点对于创伤弧菌菌群是唯一的。
49.用于检测、定量、或识别创伤弧菌的方法，其中使用权利要求2-14、17-35、和38-47中任何一项的引物。
50.用于检测、定量、或识别创伤弧菌的试剂盒，其中使用权利要求2-14、17-35、和38-47中任何一项的引物。
全文摘要
为制备用于检测、定量、或识别创伤弧菌，并具有低风险错误识别和实践中足够扩增效率和扩增特异性的高精确特异性基因扩增引物，已确定创伤弧菌及其密切相关种的gyrB、rpoD、和recA基因的部分核苷酸序列，揭示它们的系统发生关系，识别创伤弧菌的核苷酸特征。从而使设计具有高特异性的探针和具有高特异性和极好扩增效率的基因扩增引物成为可能，它们都含有特征核苷酸。
文档编号C12N9/90GK1678754SQ0382033
公开日2005年10月5日 申请日期2003年8月27日 优先权日2002年8月30日
发明者小泉雄史, 西山叶子, 山本敏, 福山正文, 吉畑胜则, 大仲贤二 申请人:株式会社日冷