专利名称：作为载体的非人疱疹病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为载体的动物病毒例如动物疱疹病毒，该载体用作将异源基因和核酸诊断性、治疗性和预防性地分别递送给动物、人或其来源的原代细胞。通过使用该载体，可以实现感染性、自身免疫性和肿瘤疾病以及变态反应和遗传性疾病的预防和治疗。本发明进一步涉及用重组动物病毒在体外和在体内有效转导原代人类细胞的过程。
马疱疹病毒1型(EHV-1)，α疱疹病毒科的一个成员(EHV-1是一种α疱疹病毒)，水痘病毒属，通常感染马和马或啮齿动物来源的细胞，和在其中复制。通常，病毒所诱导的疾病很轻微，并且全世界大约90％的马带有这一动因，其在动物身上终生存在。临床症状是轻微的呼吸道疾病、在母马中很少见的流产、和神经疾病。
EHV-1的一个株，Ab4p的完整DNA序列已被确定。EHV-1是迄今为止确定的八种马疱疹病毒中的一个。EHV-1和它的最近的亲属EHV-4是水痘病毒属的成员，与EHV-3和EHV-5至EHV-8一样，属于α疱疹病毒科。EHV-2和EHV-5是γ疱疹病毒科，在马种群中分布广泛。无论考虑到它们的组织特异性、基因组组成，还是基因功能，EHV-1、-4、-3、-5和-8都被认为是在亲缘上最接近的。EHV-2和EHV-8虽然属于γ疱疹病毒科，但与EHV-1、-4、-3、-5和-8在整体基因组组成、同时也在基因功能的许多细节上有相似之处。
疱疹病毒通过将它们的被膜与质膜融合而进入靶细胞。糖蛋白在这些感染的早期阶段、同时也在病毒体从被感染细胞外出(egress)中、和在直接的细胞到细胞传播(cell-to-cell spread)(ctcs)中发挥决定性作用。到目前为止，在单纯疱疹病毒1型(HSV-1)—原型α疱疹病毒—中，已确定出11种糖蛋白，命名为gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL和gM3。对核苷酸和相应氨基酸序列的比较显示所有已知HSV-1糖蛋白基因在EHV-1中都是保守的。EHV-1糖蛋白根据HSV-1糖蛋白所用的命名加以命名，但EHV-1还编码另外一种被膜蛋白，称为gp2，以及一种是HSV-1的VP13/14同系物的间层蛋白，有报道该间层蛋白是被糖基化的。虽然α疱疹病毒在遗传上彼此具有紧密的亲缘关系、表达相似的基因、通过同等的机制进入细胞，参与这一过程、此外参与外出和ctcs的蛋白质却相当不同。例如，gD对HSV-1、EHV-1和牛疱疹病毒1型(BHV-1)的进入和ctcs是绝对必需的，然而它在水痘病毒属的原型成员—水痘带状疱疹病毒(VZV)—中却不存在。病毒进入的主要步骤可以区分成(i)肝素敏感和肝素不敏感的附着，和(ii)病毒被膜与靶细胞质膜融合。肝素敏感的附着，即病毒被膜与细胞表面的糖胺聚糖相互作用所介导的初级附着，在许多α疱疹病毒，例如假狂犬病病毒(PRV)、HSV-1、EHV-1中是由gC带来的。在病毒被膜和质膜很可能都发生构象变化后，跟着发生稳定附着，该稳定附着是由gD与细胞受体之间的相互作用所带来的。在α疱疹病毒，包括EHV-1中，这一步骤是通过涉及至少gB、gD、和gH-gL复合体的过程所介导的。然而，融合以及融合孔形成的确切机制仍然是个谜，并且到目前为止无法鉴别出“融合肽”。糖蛋白似乎也决定—至少部分地决定—α疱疹病毒有限的体内宿主向性，即，动物疱疹病毒不能感染与它们协同进化的宿主之外的物种。
近年来，通过引入细菌人工染色体(BAC)克隆和诱变，已便利了大的疱疹病毒基因组的操作。使用这一技术，几种疱疹病毒、包括EHV-1的基因组已作为BAC而加以克隆。对作为BAC而加以克隆的疱疹病毒基因组进行定向和随机诱变的快速草案已被使用，诱变不再依赖于病毒在真核细胞中的生长，而可在大肠杆菌中进行。
可能在人类基因治疗或免疫中使用的几种载体已被描述。其中有RNA和DNA病毒。最通常使用的载体是逆转录病毒、弹状病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、和包括HSV-1在内的人疱疹病毒，和人巨细胞病毒(HCMV)。与RNA病毒、腺病毒或AAV相关的问题在于它们包装异源DNA的能力有限，这些异源DNA通常被限制在在长度＜5kbp的DNA。此外，有效转导人类细胞需要极高的腺病毒或AAV效价，这也解释了在病人中过敏性或毒性反应的风险。人类疱疹病毒可包装大小＞100kbp的DNA，RNA病毒、腺病毒或AAV系统固有的低包装能力的局限性可通过使用HSV-1、EBV或HCMV而加以克服。然而，使用人类病毒的一个主要不利之处在于这一事实，即大多数病人已经遭遇了用这些病毒所进行的感染和/或接种。
因此，本发明的问题是提供新的载体系统，用来使得成功的基因治疗途径成为可能、和用来建立新的和有效的免疫计划。
本发明的问题通过权利要求所定义的主题加以解决。
通过参考附随的附图可以更容易地理解本发明。
附图简述
图1示意性地阐明EHV-1 RacH BAC(pRacH)的构建。所显示的是大约150kbp RacH基因组的组织(A)。描绘了带有和不带有插入的BAC序列的RacH基因组独特短区域的基因组组织(B)。给出了按bp或kbp的比例和限制酶位点。B，BamHI；H，HindIII；K，KpnI；P，PacI；S，SphI；S1，SalI。
图2显示在每个细胞加入一个感染单位的HΔgp2后，人(MT4，MEWO，HuH7)、猪(PK15)和牛(MDBK)细胞系的荧光分析。在90％以上的细胞中检测到GFP表达，而不依赖于细胞类型。在HΔgp2感染的HuH7和MDBK细胞中观察到多核体的形成。
图3显示转导细胞的流式细胞计量术数据。所显示的是用EHV-1 HΔgp2接种(0.5感染单位/细胞)24小时后，Con A刺激的牛和猪PBMC的点制图分析。与用模拟品接种的细胞相比，可分别在8.1％的被刺激的牛PBMC中、和在7.5％的被刺激的猪PBMC中检测到GFP表达。
图4同样显示转导细胞的流式细胞计量术数据。所显示的是用EHV-1HΔgp2或BHV-1ΔgE接种细胞(0.5感染单位/细胞)24小时后，Con A刺激的人PBMC的点制图分析。虽然用HΔgp2转导后18.5％的细胞GFP表达呈阳性，BHV-1ΔgE接种的PBMC中只有不到0.5％显示出绿色荧光。
图5显示在用EHV-1 HΔgp2接种(0.5感染单位/细胞)24小时后，ConA刺激的人PBMC的流式细胞计量术分析。接种后，细胞通过用CD3-、CD4-、CD8-、或CD11b特异的单克隆抗体和ALEXA 546(Molecular Probes)第二山羊抗小鼠IgG偶联物进行间接免疫荧光来进行染色。对CD3-、CD4-、CD8-、或CD11b呈阳性的细胞簇用红色荧光通道进行门化(gated)，在绿色荧光通道分析GFP表达。通过直方图分析，13.2％-22.9％之间的被分析PBMC群体的GFP表达呈阳性。发绿色荧光的CD4+和CD8+T细胞的百分比事实上是一样的。
图6描绘了在用EHV-1 HΔgp2接种(0.5感染单位/细胞)24小时后，人CD4+MT4细胞的流式细胞计量术直方图分析。与用模拟品转导的对照细胞相比，用HΔgp2接种的MT4细胞中大约74％对GFP的表达呈阳性。
图7鼻内施用1×104IU/小鼠后，在第2天在鼠肺中的GFP表达。(A)肺被除去，立即对GFP表达进行原位扫描。放大倍率为100X。(B)将肺在液氮中休克冷冻(shock-freezing)后制备小鼠肺的薄切片。让肺不固定和不染色，以维持GFP表达。上图显示在下图中所显示的在荧光显微镜下的视野的光镜图像。注意GFP在细支气管(箭头)和肺泡(箭头)细胞中的表达。放大倍率为200X。
在此所用的术语“异源动物”指一种动物或其细胞群体，虽然它不是病毒的天然或终末(dead-end)宿主，但却可被根据本发明的载体加以感染。
在此所用的术语“载体”指一种病毒或其衍生物，该病毒或其衍生物能将核酸转移给动物和人或自其中分离的细胞群体。
在此所用的术语“复制缺陷型EHV”指一种以EHV为基础的载体，它已在遗传上，例如通过对病毒复制所必需的基因组序列加以缺失，而被加以修饰，在某种意义上它不再在通常的例如马或啮齿类动物来源的允许细胞或细胞系中复制。
在此所用的术语“可复制病毒”指一种重组病毒，其在允许细胞系或原代细胞中是具有复制能力的。
本发明涉及动物病毒在治疗性、预防性或诊断性基因递送目的中的用途，该动物病毒不将人类作为其天然或终末宿主。这样的病毒可以在如下病毒所组成的不具有限制作用的组中找到双RNA病毒(例如IBDV，传染性法氏囊病病毒)、Mononegavirales(例如新城疫病毒)、痘病毒(例如副痘、山羊痘、禽痘)、冠状病毒(例如传染性胃肠炎病毒，TGEV；禽传染性支气管炎，AIB)、腺病毒(牛、猪、犬腺病毒)和疱疹病毒(马疱疹病毒，EHV)。本发明因此旨在探索这样的动物病毒，特别是动物疱疹病毒，并且更特别是马疱疹病毒例如EHV-1，作为在异源物种，包括人，中的通用载体的用途的可能性。令人惊讶的是，本发明人发现，动物疱疹病毒在多种多样的异源细胞，包括体外以及体内原代人类细胞中，在极低的颗粒数目时展现出高的转导效率。值得注意的是，这一特征与其他那些特征同时存在，即(i)与大多数动物病毒一样，EHV不在非天然宿主的异源生物，例如人类细胞，中复制；(ii)EHV固有地不诱导长期持久的体液免疫应答，此外(iii)重组EHV来源的载体可被构建，该载体在转导的或感染的细胞中不表达单个的EHV蛋白，和(iv)针对大多数相关人类疱疹病毒呈现高抗体效价的人血清不中和EHV，这使得设计EHV来源的载体和基因递送策略成为可能，这样的递送策略允许体外和体内高度有效的和重复的基因递送。与此同时，这样的策略帮助避免对受者引入载体免疫和另外的不利副作用，例如毒性、过敏性或自身免疫反应。根据优选的病毒/细胞组合，疱疹病毒是EHV-1，细胞是原代人类细胞。更优选地，重组EHV-1被用作在体内将基因递送给人类的载体。
根据本发明，提供了允许对异源动物和人递送基因的载体系统。
本发明的一个令人惊讶的方面是涉及这一事实，即EHV能在体外和在体内进入和有效转导来自不同物种和原代组织的各种各样的细胞。因此，除了感染各种细胞系之外，发明人能证实脊椎动物来源，包括鸟类，的原代细胞的感染，例如鸡和鹌鹑、牛、猪、犬、猫和人类细胞。
本发明的另一出人意料的方面涉及这一事实，即EHV以极高效率进入事实上所测试的每一种细胞类型，包括人类细胞，并且将标记物基因例如增强的绿色荧光蛋白(EGFP)引入目的细胞只需要相当于大约100个颗粒/每细胞的不到一个感染单位。这一方面对均衡最佳基因递送并在同时降低载体免疫的引入是至关重要的。
本发明的另一出人意料的发现在于这一事实，即EHV介导的基因，例如EGFP，向PBMC的递送的效率可通过或者特异性地刺激PBMC、或者用促分裂原，例如Con A进行非特异性刺激而显著增加。
本发明的另一方面涉及这一事实，即在用表达EGFP的重组EHV感染后，在原代刺激的、同时也在非刺激的外周血细胞中，标记物转基因可有效地和在长持续时间内表达。
本发明的另一令人惊讶的方面涉及这一事实，即在细胞例如人CD4+细胞系MT4中，几次连续传代后，标记物转基因表达仍被相对稳定地保持，而不需要子代病毒的从头(de novo)生产，这一点已被在被感染细胞上清中没有传染性子代的条件下EGFP仍长时间表达所证实。这些细胞似乎不被EHV所溶解，并明显抗拒生产性病毒复制，生产性病毒复制这一现象最有可能是由EHV基因组在某些非允许细胞中的附加型(episomal)和稳定保持所引起的。
另一个出人意料的发现是在人体内，包括在与该介质持续接触的实验室人员中，缺乏中和性抗EHV-1抗体，同时缺乏由针对相关人类病毒的高效价抗血清所带来的交叉中和，该相关人类病毒例如α疱疹病毒组如HSV-1和2、β疱疹病毒如人巨细胞病毒(HCMV)和γ疱疹病毒如EB病毒中的重要成员，这两个发现代表了将重组EHV有效用作在人体内免疫和基因治疗应用的新载体的前提条件。另一个发现是，EHV能在体内有效转导小鼠肺细胞。鼻内滴注低剂量EHV后，可在超过12天的时间里检测到EGFP的表达。EHV的这些特性使得这一系统，例如，易于在小动物模型中在体内测试潜在的治疗应用。
另一令人惊讶的方面在于这一事实，即把以EHV为基础的载体体内投药仅诱导非常温和和持续时间很短的体液应答，这使得重复施用成为可能，而不会导致转导或免疫效率的显著丧失。
总言之，以EHV为基础的载体与目前所使用的载体相比具有多种优势，这些目前所使用的载体源自在人体内复制或至少用人体作为其终末宿主的病毒。考虑到这些方面以及EHV在理论上的包装能力，并考虑到以下事实，即表达异源基因或包含异源核酸的安全载体可通过引入条件性致死突变株而构建，该条件性致死突变株只能在补充/包装(complementing/packaging)细胞系上扩增，根据本发明的EHV载体系统可以几种不同方式被利用。
因此，本发明的一个目的涉及重组动物病毒，优选双RNA病毒(例如IBDV，传染性法氏囊病病毒)、Mononegavirales(例如新城疫病毒)、痘病毒(例如副痘、山羊痘、禽痘)、冠状病毒(例如传染性胃肠炎病毒，TGEV；禽传染性支气管炎，AIB)、腺病毒(牛、猪、犬腺病毒)和疱疹病毒(马疱疹病毒，EHV如EHV-1)，该病毒在自然状态下不以人作为宿主，在原代细胞中具有复制能力或复制缺陷，并具有在体外以小于1的MOI转导原代细胞的能力，所述原代细胞来自并非病毒的天然宿主的生物。优选根据本发明的重组动物病毒进一步具有在体内以颗粒数目在大约166-108pfu的范围内转导细胞的能力。优选原代细胞源自人类。根据本发明的重组动物病毒优选包含转基因。
本发明的另一个方面涉及根据本发明的重组动物病毒作为药物或诊断试剂或疫苗，优选作为基因导向载体的用途。
本发明的更进一步方面涉及用根据本发明的重组动物病毒转染的原代细胞。
这样的根据本发明的重组的、具有复制能力或复制缺陷的动物病毒可被用于在各种来源的动物，例如哺乳动物，细胞中表达重组蛋白，其中细胞所来源的生物不是所述病毒的天然宿主。此外，这样的重组的、具有复制能力或复制缺陷的动物病毒可被用在免疫策略中，作为在动物，例如家养或宠物动物或人类中的疫苗，以诱导，例如病毒或肿瘤特异的免疫反应，以生成抗原特异性耐受、无反应性(anergy)，或为预防性或治疗性目的去除抗原特异性B细胞、T细胞或其独特亚型。此外，重组的、具有复制能力或复制缺陷的动物病毒，例如马疱疹病毒，可被用作人类体细胞基因治疗的载体，来恢复、补偿或调制细胞性、病毒性或任何其它疾病相关的基因的表达，以治疗遗传性疾病，例如常染色体性隐性遗传的遗传病、癌症、自体免疫疾病或传染性疾病。根据本发明的这样的重组的、具有复制能力或复制缺陷的动物病毒也可以被用作基因递送系统来生成转基因动物。此外，本发明涉及表达所选择的抗原的根据本发明的这样的重组的、具有复制能力或复制缺陷的动物病毒在诊断或跟踪抗原特异性T细胞应答中的用途，该抗原特异性T细胞应答是在疫苗接种、传染性疾病、癌症或自体免疫疾病后产生的。此外，本发明使得构建试剂盒成为可能，该试剂盒包含至少，例如一个转基因构建物，该转基因构建物包含(i)EHV DNA复制的两个已知起始点，ORIS和ORIL，中的一个，以及(ii)将单位长度的病毒DNA掺入预先形成的壳体所需的包装序列，其反式(in trans)提供自一个包装细胞系，以便能生成这样的重组、感染性的，然而在当前情况下是用于上述用途的复制缺陷型的、马疱疹病毒。更特别地，这样的检测试剂盒使得将基因文库亚克隆入转基因构建物成为可能，以在异源或同源细胞中表达时鉴定独特多肽、B和T细胞表位，该独特多肽、B和T细胞表位与传染性和自体免疫性疾病、癌症和变态反应的诊断、预防、治疗和治疗监测相关。
具有复制能力的病毒可按“材料和方法”中所描述的加以构建，并在图1中图解说明。简要地说，利用BAC克隆和重组技术，异源基因或DNA序列可被插入到，或完整或部分取代，基因内区段或非必需基因，该基因内区段或非必需基因可被缺失而不影响或仅少量影响病毒生长。这样的非必需基因的例子是gp2、gC、gE或gI基因。
复制缺陷型病毒可以对EHV基因组的几个开放阅读框架进行缺失为基础，该开放阅读框架或者单独、或者联合对病毒复制是必需的，例如EHV-1所编码的唯一一个即刻早期基因，基因64。特别地，由于EHV-1仅表达一个即刻早期(IE)反式激活蛋白，该即刻早期反式激活蛋白调节自身和调节所有非结构性和结构性蛋白表达，这一IE基因的缺失代表一种非常有效的方式，用来构建复制缺陷型EHV-1。使用这一方法，可以构建EHV-1来源的载体—最初是作为包含除IE基因之外的完整EHV-1基因组的以EHV-1为基础的BAC，该载体将被转染入和在补充细胞系上扩增。这样的重组EHV-1载体能感染，例如人类，来源的靶细胞。然而在体外或在体内进入靶细胞后，只有在非EHV-1来源的、异源启动子/增强子的控制下的转基因将被表达，并且抗EHV-1免疫反应可被完全避免。
通过构建“无内脏”(gut-less)EHV，基因治疗载体可被进一步开发。这样的无内脏EHV，优选EHV-1来源的载体，基本上基于EHV-1来源的复制子(replicon)基因组，该EHV-1来源的复制子基因组包含EHV-1 DNA复制的两个已知起始点，ORIS和ORIL20-22，中的至少一个，以及将单位长度的病毒DNA掺入预先形成的核壳22-24所需的包装(pac)序列。这些突变复制子基因组也可包含必需的核壳、间层或被膜成分的基因。这样的复制子基因组可在携带突变EHV-1基因组的细胞系的帮助下被包装，该突变EHV-1基因组缺乏病毒包装序列以及ORIS和/或ORIL，但能提供和补充所需和必需的基因，该所需和必需的基因被从用于病毒DNA包装的载体上反式除去。由于这些细胞系不编码pac位点，只有复制子基因组被包装，因此，这样便代表了纯的重组病毒群体。
包装细胞系也可以以各种来源的稳定细胞系的形式构建，其中复制缺陷型EHV-1来源的复制子基因组包含EB病毒(EBV)来源的ORIp，并因此分离入表达EBV来源的EBNA-1蛋白的包装子细胞。在将基因引入包装细胞、用例如G-418抗性来选择后，EBNA-1可通过补充细胞系稳定生产。EBNA-1介导EHV-1来源的复制子基因组的分离，及其通过与ORIp结合在子细胞中的稳定维持。
为了延长转基因信息在靶细胞或靶组织中的维持，EBV ORIp和EBNA-1 ORF也可被插入EHV复制子基因组中，该EHV复制子基因组将在补充包装细胞或生产者细胞中包装入EHV，优选EHV-1载体颗粒。在用EHV载体成功转染靶细胞或靶组织后，包含转基因信息的EHV来源的复制子基因组在EBNA-1与ORIp结合的介导下在有丝分裂过程中分离入子细胞，从而导致EHV来源的复制子基因组在被转导细胞的核中的长期保持。或者，通过将基质附着位点(MAT)插入EHV来源的复制子基因组，也可以使转基因信息的保持延长。
在不依赖于EHV糖蛋白的条件下将本发明的EHV来源的载体导向特定细胞类型是可能的。例如，EHV-1对细胞的附着是通过病毒体对细胞表面的糖胺聚糖经由gC的结合而介导的。在到目前为止所分析的所有疱疹病毒中，稳定附着与受体结合是通过gD介导的，而病毒被膜与质膜的融合通过仍然未知的过程发生，该过程涉及gB、gD和gH-gL复合物。然而，也证实在gB、gD和gH-gL不存在时病毒从被感染细胞有效释放。
作为一个例子，假型EHV载体可通过几种方式生产。例如，通过从病毒基因组中分别单独或联合缺失gB、gD和gH-gL，并构建各自的补充包装细胞系，可以生成单个或多重缺失的EHV-1。这些病毒可被用来感染非补充细胞，从这些非补充细胞中“非传染性”病毒释放出来。在这一病毒子代的被膜中，目的受体导向蛋白，例如gp120/41，可通过从细胞系中表达各自基因而被插入，该目的受体导向蛋白在表面暴露的膜受体水平介导细胞类型或组织特异性。或者，缺少gB、gD、gH-gL编码区域的以EHV-1为基础的BAC基因组也可以通过，例如将所述EHV-1糖蛋白gB、gD和gH-gL中的全部或部分用目的受体导向蛋白取代而加以直接假型化。这样的病毒可随后在允许生产细胞系上很容易地生产，该允许生产细胞系表达受体和潜在的共同受体。在gp120/41假型化的病毒这一例子中，受体和共同受体分子是原代人CD4受体和人共同受体，例如CXCR4或CCR5。任选地，除了gB、gD和gH-gL以外，IE基因和/或其它基因可被从病毒基因组缺失，例如用来避免EHV来源的基因产物在靶细胞中的表达和/或增加EHV来源的载体(“无内脏”载体)的包装体积，并且必须因此在上述包装和生产细胞系中被补充。
介导细胞类型或组织特异性的受体导向蛋白可源自不同来源，例如(i)来自病毒，例如来自HIV-1的gp120/gp41被膜蛋白，通过假型化逆转录病毒支持CD4阳性细胞的特异性转导，(ii)来自已知在天然状态下介导紧密细胞与细胞接触的细胞受体，(iii)来自已知识别它们的相关细胞受体的可溶性配体，该相关细胞受体例如补体成分或趋化因子，该趋化因子能够通过异源跨膜结构域固定于病毒体表面，从而介导与例如抗原呈递细胞、幼稚或记忆T或B细胞(取决于，例如，所选择的趋化因子的性质)接触，(iv)来自基因工程化的膜结合抗体、Fab片段或其替代品，例如单链抗体、PSTI(胰分泌性胰蛋白酶抑制剂)衍生物、或任何已通过，例如噬菌体或核糖体展示技术加以选择的其它支架蛋白，或(v)来自其代表互补性决定区或受体相互作用决定簇的部分，该互补性决定区或受体相互作用决定簇被插入到受体导向或膜融合介导蛋白的合适位点。此外，例如EHV-1载体颗粒有效融合和进入靶细胞可独立完成，或通过完全或部分非选择性兼嗜性，例如病毒被膜蛋白如VSV-G被膜蛋白、MoMLV被膜蛋白或GaLV被膜蛋白，而辅助细胞类型和组织特异性结合。
EHV来源的载体可被用于递送非EHV载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体。为了构建这样的杂种EHV载体，将要被包装入EHV来源的载体颗粒的EHV来源的复制子基因组必须包含至少逆转录病毒或慢病毒复制子DNA基因组，该逆转录病毒或慢病毒复制子DNA基因组编码转基因信息，此外还有EHV来源的复制子基因组复制和其在补充包装细胞系中包装入EHV载体颗粒所需的最少信息。插入EHV复制子基因组的逆转录病毒或慢病毒复制子DNA基因组必要地必须提供至少所有顺式作用元件，该顺式作用元件对于逆转录或慢病毒RNA复制子的生成、其包装入逆转录或慢病毒颗粒、逆转录、核靶向以及慢病毒复制子基因组整合入宿主细胞基因组和转基因的表达是必需的。这样的传染性、但非复制的杂种的以EHV为基础的载体颗粒可被用于通过感染逆转录或慢病毒包装细胞来反式生产逆转录病毒或慢病毒载体颗粒，该逆转录或慢病毒包装细胞提供包装功能例如GagPol，以及表面暴露的靶蛋白，例如VSV G蛋白。
或者，除了逆转录或慢病毒“复制子”DNA基因组之外，将被包装入EHV来源的载体颗粒中的EHV来源的“复制子”基因组也可包含(i)野生型或密码子优化的逆转录病毒或慢病毒gagpol包装基因，以及(ii)开放阅读框架，该开放阅读框架编码表面暴露的导向蛋白，该导向蛋白介导逆转录病毒或慢病毒载体的细胞特异性。这样的复杂的杂种的以EHV为基础的载体颗粒也可被用于在体外生产逆转录病毒或慢病毒载体颗粒。这样的复杂的杂种的以EHV为基础的载体颗粒的一个优选应用是它们的原位或体内用途，其中，在用杂种的以EHV为基础的载体颗粒感染后，逆转录病毒或慢病毒颗粒在原位生产，该逆转录病毒或慢病毒颗粒允许通过将转基因信息整合入宿主细胞基因组而稳定转导靶细胞。
用例如EHV-1来源的载体递送非EHV-1来源的载体的用途的另一个例子是递送甲病毒(alphavirus)(例如无名森林病毒SFV、辛德比斯或委内瑞拉脑炎病毒VEE)复制子到靶细胞。这样的甲病毒来源的复制子通常受，例如病毒的、细胞类型特异的或可诱导的启动子调节，该启动子驱动一单位的核转录，该单位包含编码甲病毒非结构蛋白、和代表甲病毒启动子的序列，该甲病毒启动子对转基因的强胞质转录是必需的，该转基因受反式激活甲病毒非结构蛋白的控制。这些元件在转录单位上的顺序的一个例子是5’-CMV启动子/增强子-甲病毒非结构蛋白-甲病毒启动子-转基因-3’。为了构建这样的杂种EHV-1载体，将要被包装入EHV-1来源的载体颗粒的EHV-1来源的复制子基因组至少包含上述的甲病毒复制子，该甲病毒复制子除了最少信息之外还包括转基因信息，该最少信息对于EHV-1来源的复制子基因组的复制和其在补充包装细胞系中包装入EHV-1载体颗粒是必需的。
转基因信息的转录可被任何异源的，例如病毒的、细胞的或任何种类的杂种启动子/增强子单元所驱动。组成型转录可通过各种病毒启动子/增强子元件来达到，病毒启动子/增强子元件例如病毒的人巨细胞病毒(HCMV)即刻早期启动子/增强子、劳斯肉瘤病毒启动子/增强子或腺病毒主要/晚期启动子/增强子，或通过驱动管家基因表达的细胞启动子/增强子单位来达到，管家基因例如肌动蛋白启动子。或者，转基因表达的细胞类型特异性导向可以通过使用细胞类型或组织特异性启动子/增强子元件来达到或受其支持，该细胞类型或组织特异性启动子/增强子元件例如那些调节例如肌肉肌酸激酶(MCK)、MHC I或II类分子、CD4受体、胰岛素、血液凝固级联因子或其它的表达的元件。或者，可以利用可诱导启动子/增强子元件，例如激素可诱导的P/E元件，或优选能被四环素或其类似物诱导的启动子增强子单位。将被以EHV-1为基础的载体递送的转录单位可编码各种生物学上的活性化合物，例如用于诊断、预防或治疗用途的多肽、apta-或intramer、核酶、反义构建物或小干扰RNA(small interfering RNA)。通过这样的重组EHV-1来源的载体单独或联合递送的这样的生物学上的活性化合物可被用于诱导、增强和调制免疫反应、中断或诱导耐受、诱导无反应性、去除特异性T或B细胞或其亚群。
因此，以EHV为基础的载体可简单地被用于在细胞培养物中为诊断、预防或治疗用途生产任何种类的多肽。
或者，EHV-1来源的载体可被用于在体外和在体内感染或转导非马动物和人类来源的原代靶细胞、以及非马动物和人类来源的细胞系。
任何可被回体(ex vivo)选择、生成、操作和培养的非马动物和人类细胞系或细胞群体可代表将在体外被转导的靶细胞。优选地，这些细胞是原代细胞例如分离自动物例如牲畜(livestock)或宠物动物(pet animal)或人类的原代免疫细胞，更优选多能祖先细胞、胚胎干细胞、骨髓干细胞、血液来源的干细胞、造血干细胞、B细胞、T细胞或其独特亚型或衍生物。最优选的，这些细胞分别是抗原呈递细胞例如B细胞、单核细胞/巨噬细胞系的细胞、树突细胞或其衍生物。或者，这些细胞是原代肿瘤细胞。
利用正的或负的可选择标记物，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)或新霉素，或利用免疫学标记物例如NGFR，来进行例如荧光激活的细胞拣选(FACS)、或转导细胞的物理富集，该物理富集是使用如通过MilenyiBioTech或Dynal而在商业上可得到的磁珠技术而进行的，成功转导的细胞可以被选择。被选择的细胞或者可自己扩增，或者更特别地可被用于扩增免疫细胞例如抗原特异性T细胞。所转导的细胞可被进一步在培养物中扩增，例如用来纯化分泌自细胞培养物上清中的成分例如多肽。优选地，转导的细胞可为治疗或预防目的再次被引入人体、宠物、牲畜或实验室动物体内。
优选地，使用根据本发明的重组的、具有复制能力的或复制缺陷型动物病毒回体转导细胞、优选原代和最优选原代人类细胞可被用于将选择的、疾病相关抗原、嵌合或杂种蛋白、表位或表位串分别递送入细胞，该表位串代表例如导致自体免疫或变态反应的病毒抗原、肿瘤抗原、抗原或表位，更特别地递送到抗原呈递细胞，并且优选递送到树突细胞或其衍生物，以便达到相关表位向免疫系统的顺利递送，该相关表位例如MHC I类和II类限制的T细胞表位和/或B细胞表位。免疫应答的强度和类型的结果可以例如通过在被转导细胞，例如树突细胞中或者单独、或者联合共表达选择的细胞因子，例如IL-2、gIFN、IL-12、IL18、IL10、IL4、IL6，和/或趋化因子例如Rantes、MIP1a、MIP1β、SDF-1、SLC、ECL、BCA-1、DC-CK1、IP-10或其衍生物而加以影响和调制，以影响Th1/Th2平衡、吸引限定亚群的免疫细胞，并且中断耐受。或者或额外地，参与细胞内信号传递例如共同刺激性信号如B7.1、B7.2、CD80、CD86的细胞表面受体或配体的表达水平，可例如通过共转录阅读框架特异性核酶、反义RNA或siRNA来在被转导的细胞中加以调制，以通过诱导无反应性使免疫的诱导转换为例如外周T细胞的耐受。此外，通过在被转导细胞中使用fas/fasL系统，抗原特异性T细胞可被去除，从而在表型上也导致耐受。
或者，使用根据本发明的重组的、具有复制能力的或复制缺陷型动物病毒回体转导细胞可被用作在人类中进行体细胞基因治疗的载体来恢复、补偿或调制细胞的、病毒的或任何其他疾病相关基因，通过递送例如反式显性失活突变体、分子诱骗物(decoy)、反义构建物或siRNA，来治疗遗传性疾病例如常染色体隐形遗传的遗传性疾病、癌症、自体免疫疾病或传染性疾病。更特别地，转导的胚胎干细胞可被用于生成转基因动物例如小鼠和牲畜。
原代人类细胞地体外转导也可被用于诊断目的，例如鉴别、指定和监视体液的，和优选地，细胞的，例如MHC I类和MHC II类限制的和，特别的，CD4-和/或CD8-阳性的T细胞应答。例如，纯化的PBMC，优选纯化的抗原呈递细胞和最优选纯化的树突细胞或其衍生物可被重组复制或复制机能不全的EHV-1感染，该EHV-1表达免疫靶蛋白或其衍生物。或者，全血样品可直接用来用重组EHV-1感染易感细胞，该重组EHV-1表达目的转基因，以达到选择的表位向免疫细胞的递送，该递送是MHC II类和/或MHC I类限制的。随后进行的对抗原特异性T细胞的刺激可通过不同手段加以监测，这些不同手段例如通过掺入例如3H胸腺嘧啶核苷或5-溴脱氧尿苷测定T细胞增殖、在ELISPOT测定中对细胞因子和趋化因子产生细胞进行定量，或者，另外地，通过FACS分析，或通过建立标准铬释放测定。此外，所得到的基因文库，例如作为将不同细胞群体的cDNA从彼此扣除的结果而得到的基因文库，可被克隆入具有复制能力或非复制的EHV-1来源的载体，以生成载体群体，该载体群体随后被用来进行根据上面概括的程序进行的详细的免疫分析，以鉴定和描绘MHC I类和MHC II类限制的T细胞的特征，该T细胞参与自体免疫疾病、肿瘤排斥和传染性疾病的控制。
利用在人类、宠物和牲畜中缺乏EHV特异性原始免疫，并考虑到例如原代人类细胞在低颗粒数目时的有效感染，本发明的另一个优选实施方式是为预防或治疗目的将EHV来源的载体在体内或原位直接投药给人类或宠物或牲畜，而不预先对靶细胞进行回体转导。
特别地，我们的这些发现证明极低的感染复数使得原代人类细胞例如B和T细胞的有效感染成为可能，并且MOI＜1对于体外有效感染人类细胞系是足够的；并充分暗示，通过EHV载体颗粒进行的体内基因递送比腺病毒介导的基因递送效率高出大约100-5000倍。因此，在低颗粒数目(106-108pfu；与腺病毒载体相比低出100-5000倍)使用这样的高度有效的、以EHV为基础的载体用于在体内向人类、宠物和牲畜进行基因递送的一个主要好处是与腺病毒载体相比，其诱发毒性副作用、变态反应或自体免疫疾病的可能性低。
EHV来源的、非复制载体颗粒这样的可比较的低数目对针对病毒载体的有限的免疫应答作出贡献。这一事实，以及短暂的EHV特异性体液免疫应答本身，使得在短的时间间隔使用同一EHV株作为载体重复增强免疫成为可能，并因此能够使用EHV来源的载体作为通用媒介物，用来递送各种抗原、基因或DNA序列。
至于根据本发明的非复制动物病毒来源的载体，当例如包装的EHV复制子缺乏例如EHV编码的即刻早期基因64时，这一效应可进一步扩大。这样的丧失IE基因的、EHV来源的载体使得体内感染和转导靶细胞成为可能，而不表达任何EHV蛋白，从而避免了对成功感染或转导的细胞的消除，这种消除是由EHV特异性免疫应答进行的。
除此之外，EHV来源的载体展示出优选转导非极化细胞(non-polarizedcell)例如PBMC和肿瘤细胞的倾向。
因此，除了回体转导靶细胞，这样的重组、具有复制能力或复制缺陷的马疱疹病毒也可在体内或原位在免疫策略中被直接使用，作为在动物，例如宠物和牲畜，以及人类中的疫苗，以便为预防或治疗目的诱导例如对病毒或肿瘤特异性的免疫应答、生成或中断抗原特异性耐受、诱导无反应性、或去除抗原特异性B细胞、T细胞或其独特亚型。
直接原位或体内给予根据本发明的这样的重组、具有复制能力的或复制缺陷的动物病毒可被用于递送选择的、疾病相关抗原、嵌合或杂种蛋白、表位或表位串分别至免疫系统，该表位串代表例如导致自体免疫或变态反应的病毒抗原、肿瘤抗原、抗原或表位，更特别地至抗原呈递细胞，最优选至树突细胞或其衍生物，以便达到相关表位向免疫系统的顺利递送，该相关表位例如MHC I类和II类限制的T细胞表位和/或B细胞表位。免疫应答的强度和类型的结果可以例如通过共表达选择的细胞因子，例如IL-2、gIFN、IL-12、IL18、IL10、IL4、IL6(或者单独、或者联合)，和/或趋化因子例如Rantes、MIP1a、MIP1β、SDF-1、SLC、ECL、BCA-1、DC-CK1、IP-10或其衍生物(或者单独、或者联合)而加以影响或调制，以影响Th1/Th2平衡、吸引限定亚群的免疫细胞，并且中断耐受。或者或额外地，参与细胞内信号传递例如共同刺激性信号如B7.1、B7.2、CD80、CD86的细胞表面受体或配体的表达水平可，例如通过共转录阅读框架特异性核酶、反义RNA或siRNA来在被转导的细胞中加以调制，以通过诱导无反应性从免疫的诱导转换至例如外周T细胞耐受。此外，通过在被转导细胞中使用fas/fasL系统，抗原特异性T细胞可被去除，从而在表型上也导致耐受。
此外，根据本发明的重组的、具有复制能力或复制缺陷的动物病毒可在体内被用作人类体细胞基因治疗的载体，来恢复、补偿或调制细胞性、病毒性或任何其它疾病相关的基因的表达，以治疗遗传性疾病，例如常染色体性隐性遗传的遗传病、癌症、自体免疫疾病或传染性疾病。
可使用不同的给药途径来向受者递送所需抗原、反式显性失活基因突变体、核酶、反义RNA或siRNA。递送途径的范围从(i)原位给药，例如通过将重组的、具有复制能力或复制缺陷的马疱疹病毒注射入门静脉来转导肝细胞，(ii)吸入，以将基因递送入肺，(iii)鼻内、直肠或阴道给药，例如以生成粘膜应答，(iv)皮下或皮内注射以导向特异的抗原呈递细胞，(v)肌肉内给药，直到(vi)静脉内注射。
递送抗原或核酸至免疫系统的另一方式是(i)或者在用重组的、具有复制能力或复制缺陷的马疱疹病毒感染后将细胞包入胶囊内，或者(ii)用根据本发明的重组的、具有复制能力或复制缺陷的动物病毒感染包入胶囊内的、或以别的方式固定或区室化的细胞，并且通过针对特异器官，或者系统地或者原位地随后将这样感染的、包入胶囊内的或固定的细胞投药给受者。这样的细胞可以是(i)包装细胞，该细胞支持根据本发明人的传染性、然而复制缺陷的动物病毒的生产；(ii)允许所需抗原适当表达和分泌的同源细胞、细胞群体或细胞系。
因此，本发明的一个目的是分析EHV-1作为通用载体用来将编码例如转基因报告子的DNA序列在体外递送入非人和人类来源的不同细胞的能力。更特别地，本发明的一个目的是分析EHV-1作为通用载体用来在体外和体内表达基因以针对传染性疾病免疫人和最重要的哺乳动物和鸟类物种的能力。本发明的另一个目的是分析EHV-1被用作人类抗肿瘤疫苗的能力。此外，本发明的一个目的是分析EHV-1来源的载体为基因治疗目的、转基因动物生成或诊断目的被用来用大的DNA稳定转导细胞的能力。本发明的另一个目的是分析EHV-1作为通用载体用来对在各种细胞类型中的鼠、人或任何其他基因组的BAC/PAC文库进行体外应用和功能性测定的能力。
特别地，鉴于高包装能力、低病毒数目/每个细胞即能极其有效地递送标记基因、不被人类血清中和、其在活跃复制的细胞中建立潜伏感染的能力、以及其在鼠模型中介导有效的和持久的体内转基因表达的能力，EHV-1可以证明是一种极端有用的新工具，用来作为在动物和人类中为治疗、预防和诊断目的的载体。
与其它系统相比，EHV-1作为在人类、宠物和牲畜中使用的载体有若干优点，即，如果被系统地加以利用和使用的话，生成具有迄今为止未知特性的新的递送系统。这些特性包括(1)其以极低的颗粒数目非常有效地感染异源物种，例如人类的能力，(2)缺乏中和抗EHV-1抗体，以及(3)缺乏相关人类病毒的交叉中和，以及以下事实(4)EHV本身仅诱导较小的载体特异性免疫应答，该应答(5)可通过生成安全的、条件致死突变体而加以进一步降低，该突变体可在补充/包装细胞系上扩增，在受者细胞中完全不表达EHV来源的蛋白质，(6)EHV-1理论上的包装容量到目前为止超过100kbp，以及(7)这一事实，即表达或递送异源核酸的EHV-1可容易地在小动物(啮齿类动物)模型上进行测试。
为了完成本发明，发明人使用了如下材料和方法。
材料病毒和细胞使用无毒EHV-1疫苗株RacH(第256次传代)的衍生物，将其生长于RK13细胞上，该细胞在补充有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco极限必需培养基(DMEM)扩增。在所有感染实验中，使用重构自传染性BAC克隆pRacH的无毒RacH病毒(图1)。重构自pRacH的病毒缺乏糖蛋白gp2基因(基因71)，被称为HΔgp2。作为对照病毒，使用表达GFP的牛疱疹病毒1型(BHV-1)，Schnbken株。至于BHV-1，病毒重构自传染性BAC克隆pBHV-1。重构自pBHV-1的BHV-1称为BHV-1ΔgE，缺乏gE开放阅读框架(ORF)，代替它的是插入了包括GFP表达盒的微型F质粒pHA2。
人细胞系是CD4+T细胞系MT4(MRC ARP017)、人黑素瘤细胞系MeWo(ATCC HTB-65)、肝细胞癌细胞系HuH7(ATCC CCL-185)，肾癌细胞系293(ATCC CRL-1573)，肺癌细胞系H1299，和人宫颈癌细胞系HeLa(ATCC EEL-2)。我们还使用了牛Madin Darby牛肾(MDBK；ATCCCCL-22)细胞，Madin Darby犬肾(MDBK；ATCC CCL-34)，猫胚细胞(Riems岛动物病毒疾病联邦研究中心的兽医学细胞系保藏中心，RIE138)、猪肾细胞系PK15(ATCC CCL-33)、以及原代鸡胚细胞(CEC)和鹌鹑肌肉QM7。细胞系保持在补充有10％FCS的DMEM中。原代人类、猪、牛或马外周血单核细胞(PBMC)如下述制备。将10毫升静脉血或脐带血加样至2ml 2％的柠檬酸钠溶液中。在用Ficoll(Histopaque，Sigma)进行密度梯度离心后，PBMC或脐带干细胞被分离。PBMC在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中洗两次，悬浮于RPMI(Gibco-BRL)。或者将PBMC留下不处理，或者用伴刀豆球蛋白A(ConA)以5μg/ml的浓度刺激24-48小时，然后用HΔgp2或BHV-1ΔgE病毒接种。
方法单一步骤生长动力学和病毒效价测定 对接种于24孔板的1×105细胞以感染复数(m.o.i.)为3进行感染后，测定单一步骤生长动力学。让病毒在冰上附着2小时，随后在37℃穿透1小时。温度转换后在指定时间收获感染的上清，通过在RK13细胞上铺板(EHV-1)或在MDBK细胞上铺板(BHV-1)测定两种配制品中的病毒效价。
间接免疫荧光和流式细胞仪测定 对间接免疫荧光(IF)而言，将细胞生长在24或6孔板上，继而用表达GFP的HΔgp2在各种m.o.i.进行感染。GFP表达和抗体结合用倒置荧光显微镜(Zeiss Axiovert和Olympus)观察，抗体结合用与各种荧光染料结合的第二抗体进行检测，或用FACSCan(Becton-Dickinson)通过流式细胞计进行观察。将病毒感染的细胞转移至U形底的96孔微量滴定板(4×104细胞/孔)。于冰上加入针对各种人CD标记物的单克隆抗体(mabs)(抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD11b、抗CD16、抗CD319，所有抗体来自Dako)30分钟，细胞用PBS洗两次。加入ALEXA543山羊抗小鼠IgG偶联物(Molecular Probes，USA)15分钟。再用PBS洗两次之后，细胞重悬于100μl PBS，并用流式细胞计分析(至少5000细胞/样品)。
病毒中和测定包含10-100pfu的病毒悬液在10％DMEM中在37℃与包含高效价VZV-、HSV-1-、HCMV-、或EBV特异性抗体的人抗血清一起孵育1-4小时。对照包括对EHV-1抗体呈阴性或阳性的马或鼠血清。将病毒抗体混合物一式三份加入RK13细胞，在37℃孵育48-96小时，用光学显微镜分析致细胞病变效应。
动物实验乙醚麻醉后，用20μl体积的2×104感染单位的EHV-1鼻内接种BALB/c或C57/黑(C57/black)。在滴注后第1至14天，杀死小鼠，取下肺，立刻原位检查GFP表达。然后将肺在液氮中迅速冷冻(shock-freeze)，制备薄切片。不进行固定，以避免GFP荧光信号被降低。用光学显微镜和荧光显微镜扫描肺切片。用数码照相机(Olympus)拍照片。
实施例1EHV-1有效感染各种来源的细胞系，并递送异源基因至细胞以前曾显示，EHV-1可有效感染马和啮齿类动物来源的细胞，并在其中复制。为EHV-1生长所提供的基质是源自鼻上皮、肺、甲状腺和皮肤的原代马细胞。此外，EHV-1株已被显示在兔RK13细胞、小鼠LM细胞、以及幼仓鼠肾BHK-21/C13细胞中生长至高效价。也可证明，在这些细胞中，异源基因在各种启动子控制下有效表达。
我们的兴趣在于探索gp2-阴性EHV-1 HΔgp2感染鸟类、牛、猪、犬、猫和灵长类动物来源的细胞的能力，该gp2-阴性EHV-1 HΔgp2在HCMV即刻早期启动子/增强子的控制下表达GFP。我们能够证明，EHV-1有效进入鸟类、牛、猪、犬、猫和人类动物来源的细胞。如荧光显微镜所分析的，在CEC、QM7、MDBK、PK15、MDCK、CRFK、和人类细胞系MT4、HeLa、HuH7、293、H1299、和MeWo的情形下，显示2％至100％之间的细胞从感染后24小时后表达GFP(图2)。相反，从传染性质粒pBHV-1收回的BHV-1ΔgE无法有效感染非牛来源的细胞，显示EHV-1在非人来源的α疱疹病毒中具有独特的感染人类细胞系的能力。
实施例2EHV-1有效感染猪和牛PBMC在下一系列的实验中，我们研究了EHV-1进入原代细胞的能力，该原代细胞获自重要牲畜物种的外周血。从马、猪或牛取静脉血，以m.o.i为0.1进行感染。尽管这些物种的大约0.5％的PBMC在接种EHV-1后表达GFP，当用ConA刺激后24-48小时对细胞进行感染时，5-25％的PBMC被显示表达GFP(图3)。有趣的是注意到，马PBMC—其已被描述在马中既是溶解性感染部位，也是潜伏状态部位—与用分离自其它物种的PBMC所测定的一样，对用HΔgp2感染展示出相似的易感性。结果证明，EHV-1能有效进入牲畜动物的PBMC。相反，正如将病毒添加给受刺激和未受刺激的PBMC后缺乏GFP表达细胞这一点所反映出的，BHV-1ΔgE无法进入任一物种的PBMC。
实施例3EHV-1有效转导人PBMC和脐带干细胞上面的结果非常令人惊讶，即其他物种的PBMC具有被EHV-1转导的能力。因此，将不同女性和男性人类个体的PBMC，以及分别来自一个男性和一个女性新生儿的脐带干细胞，保持在补充有10％FCS的RPMI中，或保持在含ConA的培养基中。可以显示，总共4个个体的PBMC可被EHV-1感染，并且发生GFP表达。此外，来自男性和女性胚胎的干细胞可用EHV-1有效转导，并且超过15％的分离的干细胞表达GFP。正如马、猪和牛PBMC所报告的，如果PBMC用ConA刺激24小时，感染和GFP表达更加有效(图4)。如用流式细胞仪所测定的，在未刺激的培养物中，大约1％的PBMC被EHV-1所转导，而感染ConA刺激的胚细胞24小时后，高达22％的PBMC为GFP阳性。如上面所描述的，BHV-1ΔgE既无法进入刺激的、也无法进入未刺激的人类PBMC。这些结果以及上面所描述的那些结果证明，EHV-1能有效转导各种来源的细胞系，并且其能以高效进入人类PBMC。
实施例4EHV-1以相似效率介导向人类CD3+、CD4+、CD8+、CD11b+、CD19+细胞的基因导入我们随后尝试鉴定EHV-1转导的人类PBMC的特性。EHV-1被用来以m.o.i为1感染人类PBMC，该PBMC或者用ConA刺激24小时，或者留下不进行刺激。感染后24小时将细胞与特异性CD标记物一起孵育，进行流式细胞计数。可以证明，使用EHV-1，人类B淋巴细胞(CD19+)，以及CD4+和CD8+人类T淋巴细胞被有效转导，证明这一点的是在感染后24小时在表达GFP的细胞表面检测相应的分化分子后，出现双标记细胞，并且每种被测试表型的细胞中大约15-22％被显示出表达标记物GFP基因(图5)。此外，在生长自悬浮培养物的CD11b+细胞(单核细胞、粒细胞和自然杀伤细胞)中的大约10％中，可以很容易地检测到GFP表达(图5)。此外，CD4+MT4细胞也可以高效率被转导(图6)。结果证明，在用ConA刺激后，EHV-1能转导广泛种类的人类PBMC，并且其m.o.i低，相当于不到100颗粒/细胞。
实施例5EHV-1不被含高效价的针对人疱疹病毒的中和抗体的人类血清所中和为了使EHV-1能被用于人类疫苗接种或基因治疗，我们考察了用含高效价抗体的血清中和EHV-1的问题，该抗体针对α疱疹病毒HSV-1或VZV，以及β疱疹病毒HCMV，和γ疱疹病毒EBV。此外，测试了三名研究人员的血清，该三名研究人员日常操作EHV-1。血清在56℃灭活30分钟，或留下不进行处理，100μl体积的100或10p.f.u.的EHV-1 RacH株或HΔgp2突变病毒与在DMEM中的log2稀释的(100μl)人血清在37℃一起孵育1-4小时。病毒一抗血清混合物然后与RK13细胞混合。在人血清中没有一份能检测到针对EHV-1的中和活性，并且即使使用最低血清稀释度(1∶4)和仅仅10p.f.u.的病毒，也发展出完全致细胞病变效应(表1)。相反，用RacH免疫一次的小鼠或马血清很容易中和10或100p.f.u.的RacH和HΔgp2，该RacH和HΔgp2展示1∶16至1∶256的效价(表1)。这些结果证明，EHV-1无法被人类抗血清中和，即使它们包含针对人疱疹病毒的高效价。此外，无论男性还是女性，人类在实验室条件下持续暴露于EHV-1都不导致诱导EHV-1特异的抗体滴度。
实施例6EHV-1引起的体内有效和持久转基因表达为了将新开发的载体用于疫苗接种或基因治疗应用，载体所介导的插入转基因的体内表达是必要的。因此，评估了在对各种遗传背景的小鼠鼻内滴注2×104IU的EHV-1后，GFP的体内表达。鼻内施用第1至12天，BALB/c和C57/黑小鼠肺中都可以很容易观察到GFP表达。肺从尸体上取下后立即在显微镜下检查时，鉴定出多个展示出高水平自发荧光的区域(图5a)。在薄切片上，在支气管和肺泡的多个细胞中观察到高水平GFP表达。施用载体后直到第12天，检测到气道上皮细胞中转基因的长时间表达，证实了上面所证明的在自然器官中的观察(图5b)。重要的是应该强调，接受表达GFP的EHV-1载体的小鼠中没有一只在观察期间表现出任何疾病迹象，因为使用的是无毒的和遗传上减毒的病毒。这些结果显示，EHV-1能在体内有效转导非马来源的细胞，而不引起任何临床症状。汇总起来，上述实施例清楚证明，分离自牛、猪和人的原代外周血单核细胞(PBMC)可有效地被EHV-1所感染。EHV-1的这一特性是通过使用表达增强的绿色荧光蛋白(EGFP)的重组病毒而显示出来的，该增强的绿色荧光蛋白位于HCMV即刻早期启动子/增强子的转录控制之下。人类PBMC可以以高达分离的、Ficoll梯度纯化的、和伴刀豆球蛋白A刺激的细胞的25％的效率被感染，反之大约0.5％至2％的未刺激细胞可被感染。具有各种表型标记物(CD3+、CD4+、CD8+、CD11b+、和CD19+)的细胞可以以几乎相同的效率被感染。此外，使用＜1的感染复数，实际上100％的人细胞系是CD4+人细胞系MT4、人黑素瘤细胞系MEWO、人肝细胞癌细胞系HuH7、人肾癌细胞293、和人宫颈癌细胞系HeLa可被EHV-1感染。当被感染的细胞在感染后被增殖时，GFP表达可在几次连续传代中被检测。然而，病毒感染后细胞不死亡，并且没有观察到传染性向细胞培养物上清中的释放。这些结果显示，在非允许细胞中建立了非溶解性EHV-1感染。此外，EHV-1能以高效率进入猪肾PK15、牛Madine Darby牛肾细胞(MDBK)、猫胚细胞(KE-R)、鸡胚细胞、和鹌鹑肌肉细胞QM7。因为包括EHV-1在内的疱疹病毒展现出高的包装容量(＞100kbp)，并且因为EHV-1能在复制细胞中建立潜伏感染，在动物和人中进行免疫、抗肿瘤治疗、自体免疫疾病的治疗以及基因治疗方面，使用EHV-1作为异源核酸序列的预防性和治疗性递送的通用载体是可能的。
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权利要求
1.源自病毒的重组动物病毒，该病毒天然状态下不以人或其它动物物种作为宿主或终末宿主，该重组动物病毒在原代细胞中具有复制能力或是复制缺陷的，具有以小于1的感染复数体外转导原代细胞的能力，所述原代细胞源自不是天然或终末宿主的生物体。
2.根据权利要求1的重组动物病毒，进一步具有在体内以低颗粒数目有效转导细胞的能力，该低颗粒数目在小于106至108颗粒/生物体范围内。
3.根据权利要求2的重组动物病毒，其中转导导致了免疫反应在生物学上可测量的诱导、转基因产物的表达，该转基因产物的表达足以在受处理的生物体内诱导预防性或治疗性或诊断性效应。
4.根据前述权利要求中任一所述的重组动物病毒，所述病毒是马疱疹病毒。
5.根据前述权利要求中任一所述的重组动物病毒，所述原代细胞来源于人，宠物动物或牲畜。
6.根据前述权利要求中任一所述的重组动物病毒，包含转基因。
7.根据前述权利要求中任一所述的重组动物病毒，缺乏至少一个对在其天然宿主或源自天然宿主的细胞或细胞系中复制是必需的基因。
8.根据前述权利要求中任一所述的重组动物病毒，包含ORIS和/或ORIL，以及包装(pac)序列。
9.根据前述权利要求中任一所述的重组动物病毒在制备针对疾病进行治疗或诊断或免疫的药学试剂或诊断试剂或疫苗中的用途，其中所述重组动物病毒以低颗粒数目投药给受治疗的个体，该低颗粒数目在小于106至108颗粒/剂量范围内。
10.根据权利要求1-8中任一所述的重组动物病毒，其用作基因导向载体，其中所述重组动物病毒以低颗粒数目投药给受治疗的个体，该低颗粒数目在小于106至108颗粒/剂量范围内。
11.用根据权利要求1-8中任一所述的重组动物病毒转导的原代细胞。
12.携带至少一种根据权利要求1-8中任一所述的重组动物病毒的包装细胞系，缺乏病毒包装序列，ORIS和/或ORIL，但反式提供和补充从载体上除去的对病毒DNA包装所需要和必需的基因。
全文摘要
本发明涉及动物病毒，例如动物疱疹病毒，作为异源基因和核酸分别向动物、人类或其来源的原代细胞进行诊断性、治疗性和预防性递送的载体。通过使用所述病毒，传染性、自体免疫和肿瘤疾病被预防和治疗，并且变态反应和遗传性疾病可被治疗。本发明进一步涉及用重组动物病毒体外和体内有效转导原代人类细胞的步骤。发明进一步涉及试剂盒，对于(i)诊断和监测先天的和获得性的免疫应答，以及(ii)基因治疗，和(iii)免疫目的是有用的。
文档编号C12N15/869GK1678749SQ03820044
公开日2005年10月5日 申请日期2003年9月1日 优先权日2002年8月30日
发明者马丁·比尔, 尼古劳斯·奥斯特里德, 詹斯·鲁道夫, 萨沙·特拉普, 拉尔夫·瓦格纳 申请人:基因艺术有限责任公司