专利名称：白耙齿菌cz－81菌株及其人工培养方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌生物工程深层发酵培养的高性能菌种，即白耙齿菌“CZ-81”菌株的培养方法。
背景技术：
白耙齿菌Irpex lacteus Fr.属齿菌科，耙齿菌属、白耙齿菌种的一种真菌，别名白囊孔。异名Hirschioporus lacteus(Fr.)Teng；邓叔群，中国的真菌，484.1963。其子实体生于阔叶树的枯立木或枯倒木上。形态特征担子果(子实体)平伏，扩展，白色，软革质；或平伏而反卷，反卷部分为8～15×10～20mm。有时倒生，呈复瓦状叠生，扇形，有狭小的基部，横径2～4cm，原2～3mm；盖面乳白色，有短绒毛，有绢丝状光泽，有环纹，边缘薄，下弯，波状至浅裂。菌肉白色，原1mm左右。刺呈耙齿状，短，不整齐，白色至黄白色，长1～2cm，孢子椭圆形，平滑，无色，4～5×2～3mm。囊状体棒形或纺锤形，50～150×5～10μm，有时披有结晶，主要分布于长白山林区和黑龙江、河北、山西、甘肃、江西、福建、云南和西藏等省区[1]。
由白耙齿菌分离纯化成菌株的发酵提取物对治疗慢性肾小球肾炎有很好的临床效果，现有的菌株的稳定性差，代谢功能弱的不足，如何人工培养出高品质的白耙齿菌菌株，一直没有得到好的培养方法。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种性能稳定，抗老化能力强，生物代谢性能高的白耙齿菌菌株。
本发明同时公开了该菌株的培养方法。
本发明的技术方案如下本发明所提供的白耙齿菌Irpex lacteus Fr.其菌种为CZ-81菌株，是从中国长白山林区针阔混交林带的阔叶树枯立木或枯倒木上长有白耙齿菌的子实体，经分离、纯化、筛选和长期选育而得到的。
生物体的共同生长发育规律是由幼龄期到发育旺盛期，最终到衰老期，直至衰亡。真菌类生物也是如此，真菌类生物发酵工程原理，就是应用发酵法，促进菌丝的不断繁殖及代谢产物的积累，提取有效活性成分，为制药提供可靠的原料。由于长期生产扩繁菌种，势必造成菌种的退化。因此，提供一种稳定性好，活力强，生长发育速度快，代谢性能高，抗老化性能强的菌种，对发酵生产是重要的关键技术问题。
该菌种已于2003年9月25日，在中国科学院微生物菌种保藏委员会保藏，保藏号CGMCC No.1016。
菌种应用标准1、菌种来源说明CZ-81菌株系从长白山林区朽木上，长有白耙齿菌的子实体中经分离、纯化、筛选，并通过系统选育考核而得到的性能稳定的菌株。CZ-是指长春中医学院的缩写字头。
2、菌种的形态标准
(1)外观形态斜面菌种菌落呈白色，菌丝为白色棉絮状，并沿试管壁向上延伸、茂密。菌丝生长发育速度快，5天就可长满全斜面。
摇瓶菌种菌液澄明、黄褐色，菌丝呈放射性球状。味感有浓厚水果香味。
种子罐菌种同摇瓶种子形态，但菌球中的菌丝致密，干重增加，味感同上。
(2)镜检形态通过16×100倍生物显微镜的检查，菌丝着色深(美兰单染色法)，均匀，分枝多，呈网状，粗壮，锁状联合明显可见，无杂菌污染。
3、菌种应用的一般标准菌种在生产使用时必须按以下标准执行(1)使用新扩繁的新鲜菌种(指新扩繁的菌种在2～4℃冰箱保存，其斜面菌种种龄勿超过30日)(2)使用冰箱保存的备用菌种，要先行活化12小时以上，方可使用。
(3)放2～4℃冰箱长期保存的斜面菌种，必须在120天左右转管理一次。经转管扩繁达到菌种规定标准(指外观、镜检形态和活力)时再使用。
(4)要使用来源清楚，有详细记录，性能可靠的，符合标准规定要求的，CZ-81菌株的优良菌种。
(5)如出现斜面菌种的菌落稀薄，白色絮状菌丝纤细、变色，又很少有沿管壁向上延伸的菌丝，说明菌种已老化、活力已降低，不可再使用。
(6)CZ-81菌株性能稳定，但长期传代势必造成菌势降低，本菌株20代以内，不易退化。超过20代则明显逐渐老化，不可再使用，必须更换性能可靠的“CZ-81”新菌种，确保产品质量。
4、菌种的分级技术管理标准(1)一级斜面菌种培养基综合PDA培养基葡萄糖2％，马铃薯20％，琼脂2％，KH2PO40.3％，MgSO40.2％，VB1 0.05％，PH6.5(消前)。
设专人、专箱(冰箱)，专项记录管理。对菌种性能和老化情况随时考查、记录。做好转管传代标记和记录，生产使用的菌种属第几代(传代数)必须清楚。发现异常和老化的菌种要及时淘汰，不可应用于生产。
斜面菌种培养温度26±1℃，110-130小时菌丝长满斜面，放冰箱(2～4℃)保存备用。
(2)二级摇瓶菌种培养基葡萄糖3％，蛋白胨1.5％，酵母浸膏0.5％，KH2PO40.2％，MgSO40.15％，PH6.5(消前)。灭菌备用。
取菌龄短、菌丝粗壮茂密的斜面菌种，在无菌条件下，接入已灭菌过的摇瓶培养基中(按1∶6比例，即1个斜面接6个摇瓶)，26±1℃温控培养，摇瓶转数为160-260r/min(旋转式)，当菌球体积即湿重占30％以上(取100ml培养液放量筒中，静止15分钟，菌球沉降的百分率)；镜检达到菌种项下标准，味感有浓厚水果香味，无杂菌污染，培养时间为90-96小时，可转入种子罐发酵培养。
(3)三级种子罐菌种培养基葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，豆饼粉浸汁5％，MgSO40.15％，KH2PO40.2％，PH6.5(消前)。
取新鲜(冰箱保存备用者，勿超过一周)摇瓶菌种，按10％比例，在无菌条件下接入已灭菌过的种子罐培养基中，26±1℃温控培养，通无菌过滤空气搅拌，其流量为1∶0.4vvm。当菌球湿重占60％以上；镜检菌丝着色深，均匀，粗壮，分枝多，呈网状，锁状联合明显可见；发酵液呈黄褐色、澄明，有浓厚水果香味；PH降至5.5-6；氨基氮(N)降至30-40％，还原糖(C)降至3-5％；培养时间为68-76小时；无杂菌污染时，可转入发酵罐接种培养。(发酵罐培养接种量按10％的比例接种)5、生产工艺流程及代谢能力考核标准应用本菌株采用以下工艺流程
合格(提取)——→原料半成品——→检测——→成品原料药，备用。
1)对放罐后的发酵液经检测“白耙齿菌多糖”(粗多糖)含量不应少于1.5～2mg/ml。
2)经后处理加工提取制成的干品“多糖”含量不得少于150～200mg/g(3.5-二硝基水杨酸法检测)生产应用效果[发酵罐培养及检验要求]1、出发菌种“CZ-81菌株”2、培养基同种子罐培养基3、PH值6.5(消前)4、接种量10％5、发酵罐培养条件温度26±1℃空气流量1∶0.4vvm罐压0.5kg/cm26、放罐标准(1)外观菌液澄明、黄褐色、菌丝湿重(菌球)达70％以上。
(2)味感有微水果香味。
(3)镜检菌丝着色浅、较细、分枝减少，锁状联合少见(或无)，偶见空孢。
(4)生化指标
PH值降至4.5～5左右C源(还原糖)降至2～2.5％。
N源(氨基氮)降至20％。
(5)多糖含量发酸液检测(放罐时)——含量在1.5mg/ml以上。
提取加工后干品——含量在200mg/g以上。
(6)培养时间36～40h。
本发明提供的白耙齿菌CZ-81菌株，是经过多年选育而培育成的稳定性强，代谢能力高，安全性高的菌种。该菌种在规范实施过程中不危及人类健康或动、植物病原或污染环境。经系统考核，本菌株传代20代不易退化，且代谢指标高于原初筛菌株的1倍以上。同时在深层发酵培养工艺及其各生产环节控制上更加科学、合理，整个发酵培养时间缩短了近20％的时间。即提高了有效活性成份的含量，又缩短了发酵培养时间，降低了生产成本。
并经安全性、药理学检测与原初筛菌种的发酵代谢产物相比，无异常所见。具有较高的应用价值，利用新选育的CZ-81菌株的发酵产物，提取的耙齿菌多糖，为制作治疗慢性肾炎药物，提供一个长远的、科学的、可靠的药源途径。
实施例从中国长白山林区针阔混交林带的阔叶树枯立木或枯倒木上长有白耙齿菌的子实体中经分离、纯化、筛选，并通过系统选育考核而得到的性能稳定的菌株，培养管理方法为
(1)一级斜面菌种培养基综合PDA培养基葡萄糖2％，马铃薯20％，琼脂2％，KH2PO40.3％，MgSO40.2％，VB1 0.05％，PH6.5(消前)。
设专人、专箱(冰箱)，专项记录管理。对菌种性能和老化情况随时考查、记录。做好转管传代标记和记录，生产使用的菌种属第几代(传代数)必须清楚。发现异常和老化的菌种要及时淘汰，不可应用于生产。
斜面菌种培养温度26℃，120小时菌丝长满斜面，放冰箱(3℃)保存备用。
(2)二级摇瓶菌种培养基葡萄糖3％，蛋白胨1.5％，酵母浸膏0.5％，KH2PO40.2％，MgSO40.15％，PH6.5(消前)。灭菌备用。
取菌龄短、菌丝粗壮茂密的斜面菌种，在无菌条件下，接入已灭菌过的摇瓶培养基中(按1∶6比例，即1个斜面接6个摇瓶)，26℃温控培养，摇瓶转数为160-260r/min(旋转式)，当菌球体积即湿重占30％以上(取100ml培养液放量筒中，静止15分钟，菌球沉降的百分率)；镜检达到菌种项下标准，味感有浓厚水果香味，无杂菌污染，培养时间为93小时，转入种子罐发酵培养。
(3)三级种子罐菌种培养基葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，豆饼粉浸汁5％，MgSO40.15％，KH2PO40.2％，PH6.5(消前)。
取新鲜(冰箱保存备用者，勿超过一周)摇瓶菌种，按10％比例，在无菌条件下接入已灭菌过的种子罐培养基中，26℃温控培养，通无菌过滤空气搅拌，其流量为1∶0.4vvm。当菌球湿重占60％以上；镜检菌丝着色深，均匀，粗壮，分枝多，呈网状，锁状联合明显可见；发酵液呈黄褐色、澄明，有浓厚水果香味；PH降至5.5；氨基氮(N)降至35％，还原糖(C)降至4％；培养时间为70小时；无杂菌污染时，可转入发酵罐接种培养。(发酵罐培养接种量按10％的比例接种)对放罐后的发酵液经检测“白耙齿菌多糖”(粗多糖)含量为2mg/ml。
经后处理加工提取制成的干品“多糖”含量为200mg/g(3.5-二硝基水杨酸法检测)。
权利要求
1.白耙齿菌CZ-81菌株(lrpes lacteus Fr.)CZ-81菌株CGMCC No.1016。
2.白耙齿菌CZ-81菌株，其特征在于代谢能力，在按本标准项下要求执行时，放罐后发酵代谢产物——“白耙齿菌多糖”含量应在1.5mg/ml以上；提取制成干品多糖含量在200mg/g以上，所得多糖的水解产物为甘露糖。凝胶过滤法测得的分子量约为80000。
3.根据权力要求1、2所述的白耙齿菌CZ-81菌株人工培养方法，其人工培养方法在于包括菌种培养，即斜面菌种培养；摇瓶菌种培养；种子罐菌种培养；和发酵生产培养及放罐后的提取加工。
4.根据权力要求3所述的培养方法，其特征在于所述及的斜面菌种培养所用的是综合PDA培养基，其培养条件为PH6-6.5(消前)，培养温度为26±1℃，培养时间为110-130h。
5.根据权力要求3所述的培养方法，其特征在于所述及的摇瓶菌种培养所用的培养基为葡萄糖蛋白胨综合培养基，PH6-6.5(消前)，培养温度为26±1℃，摇瓶培养转数为160-260r/min，培养天数为90-96h。
6.根据权力要求3所述的培养方法，其特征在于所述及的种子罐菌种培养所用的培养基为葡萄糖豆饼粉浸汁综合培养基；PH值为6-6.5(消前)，温度同摇瓶培养、无菌过滤空气搅拌培养，其空气流量为1∶0.4vvm。罐压0.5kg/cm2。培养时间为68-76h。
7.根据权力要求1-2所述的白耙齿菌CZ-81菌株，其特征在于所述及的斜面菌种应为茂密的白色棉絮状菌落；摇瓶菌种菌球湿重占30％以上，味感有浓厚水果香味；镜检美兰单染色着色深、菌丝粗壮、分枝多，呈网状、锁状联合明显可见。PH值降至5.5-6；种子罐培养，其菌球湿重应占60％以上，发酵液澄明，无混浊，有浓厚水果香味。镜检同摇瓶菌种标准；化检氨基氮降至30-40％，还原糖降至5％，PH降至5.5-6。
8.根据权力要求3所述的发酵方法，其特征在于所述及发酵罐培养的培养基为葡萄糖(工业用)豆饼粉浸汁综合培养基，PH值6-6.5(消前)，经1.3-1.5kg/cm2压力，灭菌1h后，进行培养，罐温26±1℃，无菌过滤空气搅伴，空气流量1∶0.4vvm。罐压0.5kg/cm2。接种量10％，当菌球湿重占70％以上，有微水果香味；镜检菌丝着色浅、较细，分枝渐少，少见锁状联合，或偶见空孢，但无菌丝自溶现象发生。此时氨基氮可降至20％，还原糖降至2-2.5％，PH值降至4.5-5，培养时间为36-40h。
9.根据权力要求3、8所述方法，其特征在于发酵罐培养终了放罐时的发酵液，经检测白耙齿菌多糖(粗多糖)含量应在1.5mg/ml以上；经加工制成干品，多糖含量应在200m/g以上。
全文摘要
白耙齿菌CZ－81菌株及其人工培养方法，涉及一种真菌生物工程深层发酵培养的高性能菌种，即白耙齿菌“CZ－81”菌株的培养方法。CZ－81菌株CGMCC No.1016。其人工培养方法在于包括菌种培养，即斜面菌种培养；摇瓶菌种培养；种子罐菌种培养；和发酵生产培养及放罐后的提取加工。白耙齿菌CZ－81菌株，是经过多年选育而培育成的稳定性强，代谢能力高，安全性高的菌种。本菌株传代20代不易退化，且代谢指标高于原初筛菌株的1倍以上。整个发酵培养时间缩短了近20％的时间。即提高了有效活性成分的含量，又缩短了发酵培养时间，降低了生产成本。
文档编号C12N1/14GK1626648SQ20031011591
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月12日 优先权日2003年12月12日
发明者宋启印 申请人:杨静