专利名称：胸腺肽α1乳酸杆菌构建及酸奶制备方法
技术领域：
本发明涉及一种胸腺肽α1乳酸杆菌构建及酸奶制备方法，属于食品生物学领域，特别涉及到基因工程技术。
背景技术：
胸腺是人体的重要免疫器官，可以分泌多种胸腺激素，参与机体的免疫功能。在胚胎时期，胸腺比心脏，甚至比肺还要大，在青春时期达到最大，以后开始逐渐退化，到中年时减小到10克左右。胸腺组织逐渐由脂肪代替，到50岁之后，胸腺激素的分泌就完全停止。由于胸腺的萎缩和退化或者一些疾病的影响，使得胸腺激素的分泌减少，导致机体免疫力降低。在治疗肝炎、肿瘤、免疫力低下等疾病的过程中，还必须人为的应用胸腺激素治疗。因此，市场上销售胸腺肽药品比较广泛，其中注射冻干粉针剂是一种比较常见的制剂。
市售胸腺肽药品的制造主要是靠从动物的胸腺中提取，由于存在纯化工艺的局限，其成分比较复杂，纯度比较低。虽然有化学合成的上市产品，但是价格昂贵，人们难以接受。总体上说，胸腺肽药品的生产使用大量的设备和技术，投入的成本比较高，应用一般都采用注射方法，给应用带来不便。
胸腺肽是一类多肽和蛋白质激素的总称，用反相HPLC分离出60多种组分，根据等电点的不同，分为α、β、γ3组，其中α1、β4活性最强，功能也最清楚。
胸腺肽α1的功能是诱导增加MIF、IFN和淋巴毒素的产生，调节修饰TDT活性，增加抗病毒、真菌和肿瘤的免疫性，人体中扩增T细胞免疫等。
胸腺肽α1在临床上主要用于提高机体免疫力以及用其免疫调节作用治疗慢性乙型肝炎、肿瘤、艾滋病等感染性疾病，胸腺肽α1可以明显降低血浆中的脂质，增加红细胞膜ATP酶活性，对防止动脉粥样硬化有较强的效能。同时，胸腺肽α1由于有多种生物学功能，因此对重症肌无力、血友病、创伤愈合以及放射治疗后的免疫恢复等多种病症都有尝试和使用。
酸奶是一种广泛食用的保健食品，通常都是将牛奶接种乳酸菌发酵而成。发酵过程使奶中糖、蛋白质有20％左右被分解成为小的分子(如半乳糖和乳酸、小的肽链和氨基酸等)，使酸奶更易消化和吸收，各种营养素的利用率得以提高。酸奶由纯牛奶发酵而成，除保留了鲜牛奶的全部营养成分外，在发酵过程中乳酸菌还可产生人体营养所必须的多种维生素，如VB1、VB2、VB6、VB12等。
一般来说，无论是手术后，还是急性、慢性病愈后的病人，为了治疗疾病或防止感染都曾服用或注射了大量抗生素，使肠道茵丛发生很大改变，甚至一些有益的肠道菌也统统被抑制或杀死，造成菌群失调。酸奶中含有大量的乳酸菌，每天喝0.25-0.5千克，可以维持肠道正常菌丛平衡，调节肠道有益菌群到正常水平。所以大病初愈者多喝酸奶，对身体恢复有着其他食物不能替代的作用。因此，对于久病初愈的人来说也是最需要的。
现有的基因工程技术可以将胸腺肽基因转入乳酸杆菌，而使得两者接合，共同发挥作用。
用乳酸杆菌表达胸腺肽α1而制作的酸奶是一种新的尝试，不仅充分发挥胸腺肽和酸奶的各自的治疗以及保健作用，更重要的是将药食合二为一，简化生产过程，降低成本，价格低廉，应用方便，人们更容易接受。
发明内容
利用基因工程技术，根据胸腺肽α1的氨基酸序列，构建合成其编码核苷酸序列，组成2串体，组装入乳酸杆菌表达载体，通过在牛奶中接种发酵获得乳酸杆菌表达胸腺肽α1的酸奶。
具体实施例方式一、构建工程菌1、从基因库中查及人胸腺肽α1的核苷酸序列，针对胸腺肽α1的结构特点在基因前依次接上核酸内切酶ECORI、蛋氨酸、核酸内切酶BamHI、天冬酰胺和甘氨酸对应的核苷酸序列，在其基因后依次加上甘氨酸、核酸内切酶BglII、终止密码子和核酸内切酶Pst对应的核苷酸序列，采用BamHI和BglII酶切后实现胸腺肽α1基因的重复串连，如下所示EcoRIMelBamHI Asn Gly.........Gly BglII Stop PstIGAATTC ATGGGATCCACC GGC......GGC AGATCTTGACTGCAG2、合成以下4条基因片段f1aattcatgggatccaacggcagcgacgccgccgtggacaccagcaf2gcgagatcaccaccaaggacctgaaggagaagaaggaggtggtggaggaggccgag 2aacggcagatcttgactgcaf3gtcaagatctgccgttctcggcctcctccaccacctccttcttf4ctccttcaggtccttggtggtgatctcgctgctggtgtccacggcggcgtcgctgccgttggatcccatg3、胸腺肽α1(Tα1)基因的形成 溶解f1、f2、f3、f4，使其终浓度为100pmol/μl，混合均匀。各取适量，100℃加热2min，自然冷却至室温，-20℃保存。
4、质粒载体的制备 取PGEM-32f质粒，用EcoRI和PstI双酶切，电泳回收所需要的片段并溶于双蒸水中。
5、片段的连接 取3退火片段4μl，T4核酸连接酶1μl，质粒载体1μl，双蒸水3μl，混合均匀，16℃连接12hr。
6、转化大肠杆菌 取片段连接产物5μl，加入到制备的感受态大肠杆菌DH5α100μl中，混合均匀，常规方法转化DH5α。
7、阴性克隆的筛选 经铺板、培养、扩增和酶切鉴定后初步筛选出阴性克隆，最后通过测定序列确定阴性克隆。
8、胸腺肽α1基因重复序列的构建 酶切和测序正确的克隆经扩大培养后提取质粒，分为两份，一份用BamHI和PstI酶切，回收小片段；另一份用BglII和PstI酶切，回收其大片段。将回收的大小片段用T4核酸连接酶连接，即将2个重复的胸腺肽α1基因连接。
9、表达载体的构建 将含胸腺肽α12串体基因的重组质粒PGEM-32f经EcoRI和PstI双酶切，回收胸腺肽α1②，克隆入经相同酶切的PBV中，构成PBV-Tα1②重组体。
10、工程菌的构建 将连接好的PBV-Tα1②用电转化法转化乳酸杆菌，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上挑取单菌落，经扩大培养提取质粒，酶切鉴定筛选出目的菌株。
11、胸腺肽α1的表达 经筛选后的PBV-Tα1②的克隆于37℃培养过夜，次日按1％转接于LB中，37℃培养3hr，温度升至42℃诱导4hr，收集菌体，进行15％SDS-PAGE。
二、制备酸奶选用新鲜牛奶，要求脂肪量低于3％，按照鲜牛奶总量6％的比例加入白糖，煮沸5分钟灭菌，过滤。当温度下降至38-42℃时，接入电转化PBV-Tα1②构建的乳酸杆菌，37℃发酵培养6-8hr，发酵后要随时抽样检查酸度和凝固情况。当酸度Ph达到4.5-4.7、凝固也达到要求时，停止发酵，小心地取出在室温下冷却，再移到2℃-6℃冰箱中冷却。
权利要求
1.胸腺肽α1乳酸杆菌构建及酸奶制备。其特征在于，用于制备酸奶的乳酸杆菌中转入的质粒载体包含有抗青霉素和胸腺肽α1的基因。
2.根据权力要求1所述的胸腺肽α1以2串体的形式在乳酸杆菌中表达。其基因片段为f1aattcatgggatccaacggcagcgacgccgccgtggacaccagcaf2gcgagatcaccaccaaggacctgaaggagaagaaggaggtggtggaggaggccgagaacggcagatcttgactgcaf3gtcaagatctgccgttctcggcctcctccaccacctccttcttf4ctccttcaggtccttggtggtgatctcgctgctggtgtccacggcggcgtcgctgccgttggatcccatg
3.权力1所述的胸腺肽α1乳酸杆菌中的Tα1可以多串体的形式表达。
4.权力1所述的酸奶，是接入权力要求2、权力要求3所述的胸腺肽α1乳酸杆菌经发酵培养制作而成。
全文摘要
应用基因工程方法，将胸腺肽α1质粒载体转入乳酸杆菌，通过接种、发酵培养制作酸奶。这种酸奶含有功效最强的胸腺肽α1，耐酸，可以小肽的形式直接被肠完整吸收，更快被机体利用。因此，这种酸奶可以同时具有胸腺肽的药理作用和酸奶的保健功能，药食合二为一，弥补人胸腺肽分泌的不足。简化生产过程，降低成本，应用方便，人们容易接受。利用胸腺肽α1乳酸杆菌生产酸奶和用常规方法生产酸奶的工艺相同。
文档编号C12N15/11GK1626650SQ20031011895
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月8日 优先权日2003年12月8日
发明者石继红, 包春杰 申请人:包春杰, 石继红