专利名称：一株甜瓜蔓枯病病原菌及其分生孢子的诱导方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株甜瓜蔓枯病病原菌及其分生孢子的诱导方法与应用，特别是涉及一株甜瓜蔓枯病病原菌及其分生孢子的诱导方法与在评价甜瓜品种资源蔓枯病抗性水平中的应用。
背景技术：
甜瓜是深受世界各地人民喜爱的水果。随着国民经济发展和人民生活水平的提高，对质优味佳的餐后高档甜瓜的需求日益增加，近二十年来，我国厚皮甜瓜露地栽培和保护地栽培取得了长足的发展，显著地提高了甜瓜总产量和周年供应水平。然而，在厚皮甜瓜蓬勃发展的同时，还存在许多问题。
连作重茬障碍是制约甜瓜生产可持续发展的主要问题。由于连作重茬造成蔓枯病、枯萎病、疫病和根瘤线虫病等土传病害加剧，影响了果品产量与品质的提高。
蔓枯病(Didymella bryoniae(Auersw.)Rehm)是世界性的甜瓜重要土传病害之一。由于栽培需要整枝整叶，增加了病原菌从伤口侵染的机会。在整个生育期，地上各部均可受害，但主要危害茎基部。幼苗基部受害，起初出现水渍状小点，后迅速向上下扩展，不久全株软腐死亡。开花后期至果实膨大期是发病盛期，主要侵染根颈以上茎基部和主蔓，有时也侵染侧蔓。开始发生水渍状，进而分泌出液滴，由淡黄转变成深红至黑红色，严重时使植株基部萎缩，最终导致全株凋萎死亡。在我国，无论是露地栽培的西北厚皮甜瓜产区，还是日光温室或大棚保护地栽培的东移厚皮甜瓜产区，蔓枯病普遍发生。
为了预防土传病害，栽培上常用药剂消毒的方法，不但成本高，效果差，难以彻底根除，而且消毒对生态环境、果品和人体健康会产生不良的影响。在我国，蔓枯病是危害厚皮甜瓜露地和保护地栽培的重要病害之一，研究病原致病性变异，广泛搜集品种资源，鉴定抗源基因，提高育成品种或嫁接砧木的抗性水平和抗性的持久性，是一条最经济、有效、安全的病害防御途径。
蔓枯病菌的分生孢子很难诱导。Keinath等(Keinath A.P.，M.W.Farnham，andT.A.Zitter 1995 Morphological，pathological，and genetic differentiationof Didymella bryoniae and Phoma spp.isolated from Cucurbits.PhytopathologyVol.85(3)364-369)在V8蔬菜汁琼脂培养基或1/4的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在22℃-24℃培养箱内光暗(各12h)交替培养2周或直到分生孢子器产生，尽管菌丝体生长很快，但产生的分生孢子器很少，制约了蔓枯病菌在甜瓜育种学与病理学有关研究方面的应用。
发明内容
本发明的目的是一株甜瓜蔓枯病病原菌及其分生孢子的高效诱导方法与应用。
本发明所提供的甜瓜蔓枯病病原菌(Didymella bryoniae)菌株名称为STw-1，已于2004年01月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为C6MCC №1089。
本发明的甜瓜蔓枯病病原菌STw-1，按照柯赫氏法则分离于国家蔬菜工程技术研究中心多年连作重茬的甜瓜大棚。利用分离病原逆境胁迫高效诱导的分生孢子进行了人工接种，评价了中国甜瓜地方品种资源蔓枯病的抗性水平，结果从中筛选了一批抗源，对这些抗源基因的深入研究，将促进我国厚皮甜瓜抗蔓枯病育种的发展，对有效控制甜瓜蔓枯病的危害起到积极作用。
甜瓜蔓枯病病原菌分生孢子的诱导方法，是将甜瓜蔓枯病病原菌的菌丝接种在马铃薯蔗糖培养基平板上，持续光照培养，待菌丝长满平板后，在紫外照射或热激胁迫后进行光暗交替培养，诱导高效产生分生孢子器；然后在玉米培养基或马铃薯燕麦葡萄糖培养基上，接种单个分生孢子器，高效扩繁产生分生孢子。
在上述过程中，所述马铃薯蔗糖培养基(PSA)的配制方法是，将去皮的马铃薯180-220克切片，加1000毫升蒸馏水，煮沸，滤去残渣；滤液中加入15-20克琼脂和18-22克蔗糖，定容至1000毫升；所述玉米培养基(MA)的组成为玉米粉280-320克，琼脂15-20克，水定容至1000毫升；所述马铃薯燕麦葡萄糖培养基(POGA)的配制方法是将去皮的马铃薯18-22克切片，加1000毫升蒸馏水，煮沸，滤去残渣；滤液中加入燕麦3-6克、葡萄糖18-22克和琼脂18-20克，定容至1000毫升。
所述菌丝在马铃薯蔗糖培养基平板上，在25℃条件下一般培养7天。在逆境胁迫过程中，紫外照射一般在30W条件下进行0.5-4分钟，热激在30-35℃条件下一般处理1-4天；胁迫后的光暗交替培养一般在25℃条件下进行2-15天。
本发明巧妙地利用逆境胁迫(紫外照射和热激)，在甜瓜蔓枯病菌丝体生长到一定阶段后，在影响菌丝体营养生长而不至于杀死菌丝体的前提下，使菌丝体由营养生长阶段过度到生殖生长阶段，促进分生孢子器的形成，产生大量的分生孢子，可充分满足病理学与育种学实际研究工作中对蔓枯病菌分生孢子量的需要。
图1A及图1B显示了在PSA平板上菌丝的生长状况。
图2A及图2B显示了在OA平板上菌丝的生长状况。
图3显示了在MA平板上菌丝的生长状况。
图4显示了在POGA平板上菌丝的生长状况。
图5示菌丝形状。
图6示分生孢子器的显微形态特征。
图7示分生孢子器裂开释放分生孢子。
图8示分生孢子形态。
图9示致病性接种实验的病株。
图10为香瓜品种资源蔓枯病抗性分布直方图。
具体实施例方式
实施例1、甜瓜蔓枯病病原菌(Didymella bryoniae)STw-1株的分离1、表面消毒将病株茎基部发病处洗净，切成约4×4×2mm3的小块，用70％的酒精灭菌3-5S，无菌水冲洗3次；再用5％的NaClO分时间梯度4、8、12、16min灭菌，无菌水冲洗3次。
2、接种诱导菌丝将经过表面消毒的病组织块接种于PSA平板上，置于25℃培养箱持续光照培养。接种2d后，在PSA平板上个别组织块的表面产生白色的菌丝。
3、纯化扩繁菌丝上述PSA平板在接种5d后挑取边缘菌丝，接种于PSA平板上，待菌落形成后，再从菌落边缘挑取菌丝，接种于PSA平板上继续培养，以纯化和扩繁菌丝。
4、菌落形态、生长状况以及菌丝显微形态特征的观察将纯化的菌丝接种于PSA、OA(燕麦培养基，配制方法是燕麦片30g在60℃水浴中放置1h，双层纱布过滤去渣，取上清液，加琼脂20g，定容至1000毫升)、MA和POGA不同平板上，在25℃生长箱持续光照培养7d，菌丝生长旺盛，均长满平板，正面颜色与菌龄有关，而且在不同培养基上菌落形态表现不一。如图1A(培养皿正面)及图1B(培养皿背面)所示，在PSA平板上，菌落边缘稀薄，中间稠密，略隆起，正面颜色与菌龄有关，背面黄色至褐色，后期变为黑色，且有明显的同心轮纹。打开培养基皿盖时可闻到“灰土味”。
如图2A(培养皿正面)及图2B(培养皿背面)所示，在OA平板上，菌落中间稠密，略隆起，边缘稀薄，有明显水波状同心轮纹，背面初为黄色，后渐变为褐色至黑色，轮纹尤其明显，黄褐相间。
如图3所示，在MA平板上，菌落中间稠密，明显隆起一直径4cm的圆形，周围菌丝平匐在培养基表面，背面初为黄色，后期变为黑色，有同心轮纹，但不明显。
如图4所示，在MPGA平板上，菌丝较均匀的分布于培养基表面，无隆起，背面初为黄色，后期变为黑色，无同心轮纹。
菌丝的显微形态特征如图5所示，菌丝较细、无色、有隔，直径2.5-12.5μm。
5、STw-1株与其它甜瓜蔓枯病病原菌病株的区别蔓枯病菌能侵染所有葫芦科植物，但不同菌系的致病性存在差异(Farr，D.F.，Bills，G.F.et al 1989 Fangi on plants plant products in Unite State.American Phytopathological Society，St.Paul，MN；Punithalingam，E.，andHolliday，P.1972 Didymella bryoniae.CMI Descriptions of Pathogenic Fungi andBacteria No.332；Chiu，W.F.and walker，J.C.1949 Physiology andpathogenicity of the cucubit black-rot fungus.J.Agric.Res.78589-615；Lee，D.H.Mathur，S.B.，and Neergaard，P.1984 Detection and location of seedbrone inoculum of Didymella bryoniae and its transmission in seedlings ofcucumber and pumpkin.Phytpathol.Z.109301-308；Van Steekelenburg，.A.M.1982 Factors influencing external fruit rot of cucumber caused by Didymellabryoniae.Neth.J.Plant Pathol.8847-56)。Keinath等(Keinath A.P.，M.W.Farnham，and T.A.Zitter 1995 Morphological，pathological，and geneticdifferentiation of Didymella bryoniae and Phoma spp.isolated from Cucurbits.Phytopathology Vol.85(3)364-369)研究了美国东部地区来源于不同葫芦科植物厚皮甜瓜、西瓜、西葫芦、南瓜和黄瓜的22个蔓枯病菌系基因组DNA随机扩增片段长度的多态性，发现蔓枯病菌群体内不同菌系间存在基因型的差异。尽管如此，迄今还没有发现蔓枯病菌对不同葫芦科植物存在“种”的专化性，即使在其中任何一种植物如甜瓜或西瓜上也没有发现存在“小种”分化。
本发明所公布的甜瓜蔓枯病菌株STw-1是在北京蔬菜研究中心分离的，它对厚皮甜瓜品种资源高度致病，在基因型与致病性方面与文献报道过的其它菌株存在差别。
实施例2、诱导分生孢子一、培养基的配制1、马铃薯蔗糖培养基将去皮的马铃薯切片200克放入锅中，加1000毫升蒸馏水，煮沸30min，用纱布滤去残渣；滤液放回锅中，加入15-20克琼脂和20克蔗糖，定容至1000毫升。
2、玉米培养基玉米粉300克，琼脂15-20克，水1000毫升。
3、马铃薯燕麦葡萄糖培养基将去皮的马铃薯切片20克放入锅中，加1000毫升蒸馏水，煮沸30min，用纱布滤去残渣；滤液放回锅中，加入燕麦3-6克、葡萄糖20克和琼脂18-20克，定容至1000毫升。
以上3种培养基均为自然pH，高温高压灭菌(121℃，0.103Mpa，20min)后制板。
二、逆境胁迫高效诱导甜瓜蔓枯病菌分生孢子1、将甜瓜蔓枯病菌STw-1菌丝接种于马铃薯蔗糖培养基平板上，在25℃生长箱持续光照培养7d，菌丝长满平板。
2、逆境胁迫处理逆境胁迫处理可以采取紫外照射或热激两种方式，下面分别叙述1)紫外照射在超净工作台内用30W强度的紫外光分别照射步骤1中得到的平板0.5、1、2或4min，然后将平板置于25℃组织培养间进行光暗交替培养。15天后4个处理均产生分生孢子器，而且产生分生孢子器的量随处理时间的延长而增加。
2)热激将步骤1中得到的平板分温度(30℃和35℃)与时间(1d、2d、3d和4d)梯度分别置于培养箱进行热激处理，然后置于25℃培养间进行光暗交替培养，2d后30℃处理2d和3d的诱导出大量的分生孢子器，1d和4d的诱导出少量的分生孢子器；35℃各处理均诱导出大量的分生孢子器产生，尤其是处理1d和2d诱导分生孢子器的效果更好。
逆境胁迫诱导的分生孢子器在马铃薯蔗糖培养基平板上呈黄褐色至褐色小点，直径为54.5-175.5μm，平均为87μm，半埋生于菌丝丛中。在显微镜下，分生孢子器如图6所示，呈球形或扁球形，有孔口，壁膜质，黄褐色至深褐色，遇水裂开露出分生孢子(如图7所示)。
3、分生孢子的高效扩繁将逆境胁迫诱导得到的分生孢子器分别接种于马铃薯蔗糖培养基、玉米培养基和马铃薯燕麦葡萄糖培养基上，5-7d后，玉米培养基和马铃薯燕麦葡萄糖培养基上产生大量分生孢子器，而马铃薯蔗糖培养基上菌丝生长旺盛，始终没有产生分生孢子器。说明在玉米培养基和马铃薯燕麦葡萄糖培养基上，接种分生孢子器，能高效扩繁分生孢子。如图8所示，分生孢子呈椭圆形或圆筒形，无色，单孢，大小为2.5-15μm×2.5-6.25μm，平均7.3μm×3.6μm。
实施例3、甜瓜蔓枯病病原菌STw-1株的致病性鉴定用蒸馏水将分生孢子配置成1×106浓度的分生孢子悬浮液。在塑料大棚，用针蘸取分生孢子悬浮液，在苗期针刺接种甜瓜植株茎基部，接种7天后观察发病情况，结果发病率高达100％，如图9所示，针刺部位呈明显的水渍状病斑，病斑长度平均2cm，部分植株病部腐烂，是甜瓜幼期茎基部发病的典型症状。
对病株病健交接处进行病原再分离，重新得到了病原菌的纯培养，性状与最初获得的分离物相同。
实施例4、中国甜瓜地方品种资源蔓枯病抗性评价1、病情分级指数与抗性分类病情分级标准1级(无病斑)，代表值为0；2级(有分泌物且病斑没扩展)，代表值为0.5；3级(病斑长度0～1)，代表值为1；4级(病斑长度1～2)，代表值为2；5级(病斑长度≥2)，代表值为3；6级(病株枯死)，代表值为4。
按病情指数(DI)进行抗性分类高抗(HR)，DI≤10％；抗病(R)，10-20％；中抗(MR)，20-50％；中感(MS)，50-80％；感病(S)，80-90％；高感(HR)，DI≥90％。
2、中国甜瓜地方品种资源蔓枯病抗性评价厚皮甜瓜几乎都高感蔓枯病。中国是甜瓜和菜瓜的次级起源中心，为此，从国内引进和搜集了100个甜瓜品种，利用甜瓜蔓枯病病原菌STw-1株在苗期针刺接种甜瓜植株茎基部，对它们进行了蔓枯病抗性评价，结果如表1所示，100份甜瓜品种资源对蔓枯病的抗性表现基本上呈正态分布，其中2个品种3X38和3X22的病情指数分别为7.1和7.1，表现为高抗，另外9个品种的病情指数介于10％-20％之间，表现为抗病。这些抗源在抗病育种和嫁接砧木的选育中具有重要的应用价值。
表1中国甜瓜品种资源蔓枯病抗性评价
权利要求
1.甜瓜蔓枯病菌(Didymella bryoniae)STw-1 CGMCC №1089。
2.甜瓜蔓枯病病原菌分生孢子的诱导方法，是将甜瓜蔓枯病病原菌的菌丝接种在马铃薯蔗糖培养基平板上，持续光照培养，待菌丝长满平板后，在紫外照射或热激胁迫后进行光暗交替培养，诱导高效产生分生孢子器；然后在玉米培养基或马铃薯燕麦葡萄糖培养基上，接种单个分生孢子器，高效扩繁产生分生孢子。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述马铃薯蔗糖培养基的配制方法是，将去皮的马铃薯180-220克切片，加1000毫升蒸馏水，煮沸，滤去残渣；滤液中加入15-20克琼脂和18-22克蔗糖，定容至1000毫升；所述玉米培养基的组成为玉米粉280-320克，琼脂15-20克，水定容至1000毫升；所述马铃薯燕麦葡萄糖培养基的配制方法是将去皮的马铃薯18-22克切片，加1000毫升蒸馏水，煮沸，滤去残渣；滤液中加入燕麦3-6克、葡萄糖18-22克和琼脂18-20克，定容至1000毫升。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述菌丝在马铃薯蔗糖培养基平板上，在25℃条件下培养7天。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述紫外照射是在30W条件下进行0.5-4分钟。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述热激是在30-35℃条件下处理1-4天。
7.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述胁迫后的光暗交替培养在25℃条件下进行2-15天。
8.甜瓜蔓枯病菌(Didymella bryoniae)STw-1 CGMCC №1089在甜瓜品种蔓枯病抗性评价中的应用。
9.甜瓜蔓枯病菌(Didymella bryoniae)STw-1 CGMCC №1089在甜瓜抗性育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株甜瓜蔓枯病病原菌及其分生孢子的诱导方法与应用，本发明所提供的甜瓜蔓枯病病原菌(Didymella bryoniae)菌株名称为STw－1，利用该菌株的分生孢子进行人工接种，可评价甜瓜品种资源蔓枯病的抗性水平，从中筛选抗源，对这些抗源基因的深入研究，将促进厚皮甜瓜抗蔓枯病育种的发展，对有效控制甜瓜蔓枯病的危害起到积极作用。甜瓜蔓枯病病原菌分生孢子的诱导方法，是将甜瓜蔓枯病病原菌的菌丝接种在马铃薯蔗糖培养基平板上，持续光照培养，待菌丝长满平板后，在紫外照射或热激胁迫后进行光暗交替培养，诱导高效产生分生孢子器；然后在玉米培养基或马铃薯燕麦葡萄糖培养基上，接种单个分生孢子器，高效扩繁产生分生孢子。
文档编号C12N3/00GK1664094SQ20041000616
公开日2005年9月7日 申请日期2004年3月4日 优先权日2004年3月4日
发明者王建设, 刘玲, 张慧玲, 陈贵林, 韩丽华, 王永键 申请人:北京市农林科学院蔬菜研究中心