专利名称：一种有机废弃物快腐菌剂及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种有机废弃物的快速降解复合菌剂及其构建方法，属于有机废弃物处理技术领域。
背景技术：
随着社会经济的发展，在社会各种领域产生的有机废弃物越来越多。无论是发达国家还是发展中国家，都不可避免地面临废弃物成灾的严重威胁。有机废弃物已成为社会的一大公害，它污染环境，吞噬耕地，危害人民的身心健康。如何使有机废弃物无害化、资源化、减量化、变废为宝，已成为世界性的亟待解决的问题。生物降解是目前普遍供认的有机废弃物资源化再生利用的有效途径之一，在有机肥制作，饲料、制糖、燃料工业及环保等方面具有广阔的应用前景。
目前，社会各领域产生的可降解的固体有机废弃物主要以木质纤维素类物质来组成。其中，纤维素约占40％，半纤维素约占20％～30％，木质素约占20％～30％。因此，不断地选育出具有高效稳定木质纤维素降解机能的微生物，一直是有机废弃物的资源化处理过程中最为活跃的研究领域。自然状态下，木质纤维素类物质都紧密连接的特性，要彻底降解此类物质需要依赖于纤维素、半纤维素及木质素分解菌等多种微生物的共同参与下才能实现。因此，近年来木质纤维素的生物降解领域中混合菌剂开始引起了人们的高度重视。
至今，已有很多关于有机废弃物降解混合菌剂方面的报道。但是，现有的混合菌剂，首先采用传统的纯分离方法筛选主要功能微生物，将两种或两种以上的纯菌株人为地组合构建而制备的。而且普遍采用液体发酵的方法制备菌剂，不可避免地提高了生产成本。现有生物降解菌剂主要存在的几个问题1、现有的生物降解菌剂局限在可分离的微生物，而自然界中可分离的微生物不到10％，而传统的纯分离方法人为地限制了在自然条件下具有高效降解机能但不可分离的微生物的利用，因此只注重于可分离的微生物是片面的；2、在自然条件下要彻底降解某种物质需要多种微生物的共同参与下才能实现，而采用传统的纯分离的方法进行筛选过程中，自然条件下原有的微生物区系被破坏，很容易漏掉产酶性能相对较弱或根本不产酶，但具有良好协同作用的微生物；3、采用纯菌种制作的菌剂在实际生产和应用过程中，普遍存在抗污染能力差、对发酵条件的要求严格、降解机能不稳定、实际应用范围较窄、生产成本高等诸多问题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种有机废弃物快腐菌剂，该菌剂抗污染能力强、不同微生物间具有良好的协同作用、对氧气的要求不严、适合的pH和温度的范围宽、且对难以降解的木质纤维材料具有高效稳定的降解机能。
本发明的目的之一是这样实现的一种有机废弃物快腐菌剂，所述菌剂由适合pH范围在4.0～10.0之间的嗜温微生物和嗜热微生物的复合菌群共同组成，所述菌剂中含有能产木质纤维素酶的细菌、放线菌和真菌，细菌主要由芽孢杆菌组成，放线菌主要由链霉菌组成，真菌主要由木霉和曲霉组成，每干重1克的菌剂中含有细菌108～1010个、放线菌106～108个、真菌105～107个。
本发明所述的快腐菌剂对有机废弃物具有良好的降解作用，不同微生物间协同性好，在不同发酵条件下均表现出很强的协同作用和抗污染能力，可适用于有机废弃物的降解处理，在处理过程中还能产生有机肥。
本发明的目的之二是提供一种有机废弃物快腐菌剂的构建方法。
本发明的目的之二可以通过两种方法实现方法之一包括以下步骤A)高温复合菌的筛选从富含木质纤维素分解菌环境中取样，以木质纤维素为唯一碳源，在50～60℃下静置富集培养，在相同的发酵条件下连续传代至富集培养物的微生物区系及降解机能稳定，即为高温复合菌；B)中温复合菌的筛选从富含木质纤维素分解菌环境中取样，以木质纤维素为唯一碳源，在25～35℃温度、150～200rpm/min摇床上进行富集培养，在相同的发酵条件下连续传代至富集培养物的微生物区系及降解机能稳定，作为中温复合菌；C)将所获得的中温复合菌和高温复合菌按相同的菌数进行混合，并以2～5％接种量转接到固体发酵培养基，分别在25～35℃中温和50～60℃高温下进行浅盘发酵5～7天，固体培养基厚度为5～10cm，每隔2天进行翻堆，将中温和高温培养后的两种培养物分别在40～50℃下烘干、粉碎，过10～20目筛子，得到中温固体曲和高温固体曲，将质量含量30％～70％的中温固体曲和70％～30％高温固体曲进行混合，即获得所述一种有机废弃物快腐菌剂。
方法之二包括以下步骤A)中温复合菌的筛选从富含木质纤维素分解菌环境中取样，以木质纤维素为唯一碳源，在25～35℃温度、150～200rpm/min摇床上进行富集培养，在相同的发酵条件下连续传代至富集培养物的微生物区系及降解机能稳定，作为中温复合菌；B)将所获得的中温复合菌按2～5％接种量转接固体发酵培养基，在25～35℃下进行浅盘发酵5～7天，培养基厚度控制在5～10cm，每隔2天进行翻堆，40～50℃下烘干、粉碎，即成为中温复合系的固体曲；C)高温复合菌的筛选从富含木质纤维素分解菌环境中取样，以木质纤维素为唯一碳源，在50～60℃下静置富集培养，在相同的发酵条件下连续传代至富集培养物的微生物区系及降解机能稳定，即为高温复合菌；D)将所获得的高温复合菌，按2～5％比例接种到液体发酵培养基，50～60℃下静态发酵3～5天，即为高温菌的发酵液；E)将高温菌的发酵液以相同菌数吸附到中温复合系的固体曲中，在40～50℃下烘干，即成为所述一种有机废弃物快腐菌剂。
本发明所述的一种有机废弃物快腐菌剂具有如下特性A、本发明所述菌剂中共分离出14株不同种类的微生物(见表1)，分别为6株芽孢杆菌，4株放线菌，4株真菌，其中细菌和放线菌分别由芽孢杆菌和链霉菌组成，而真菌由木霉和曲霉组成。可见此复合菌群由细菌、放线菌、真菌等不同类群微生物共同组成。
B、本发明所述菌剂中的复合菌群既有嗜温菌(30℃)，又有嗜热菌(55℃)，嗜温菌种类和数量均高于嗜热菌(见表1)。此复合菌群中除了一株放线菌(PC2-f4)号是专性高温菌外，高温细菌和真菌均属于属于兼性高温菌(如YC2-x1～x4及YC2-z1～z2)。
C、本发明快腐菌剂的中温(30℃)微生物数量分别为细菌1010个/g(干样)、放线菌108个/g(干样)、真菌107个/g(干样)；而高温(55℃)微生物数量分别为，细菌108个/g(干样)、放线菌106个/g(干样)、真菌105个/g(干样)(见表1)。
表1不同培养温度下YUP1微生物区系
D、30℃中温或55℃高温条件下由高温复合菌和中温复合菌混合制成的快腐菌剂的降解效率较混合前有明显的提高(见表2)。
表2固体发酵条件下YPC1的混合增效
E、本发明的快腐菌剂30℃适合含水率在55％～70％，其中最适含水率为65％(见表3)；55℃的高温下适合含水率在60～80％，其中最适含水率为70％。
表3不同含水率对降解效果的影响
F、本发明所述的一种有机废弃物快腐菌剂是由高温复合菌和中温复合菌的混合发酵产物，适合的温度范围广，在20～65℃温度范围内均表现出稳定的降解机能(见表4)，其中最适温度为55℃。
表4不同温度条件下降解机能(发酵5天)
G、本发明的快腐菌剂，适合的pH范围在4～10，其中最适的pH在6.0～8.0(见表5)。
表5不同初始pH条件下滤纸崩解情况
～还没开始分解；+表示分解强度；0全部分解完
具体实施例方式
实施例1通过制造高温堆肥方法在自然条件下富集木质纤维素分解菌1、高温堆肥的制作称取500kg新鲜作物秸秆(如稻秆、麦秆等)，加入50kg新鲜畜禽粪便(鸡粪，猪粪、牛粪等)，调节含水率为65％，均匀地混拌，堆成山型堆体。在堆肥的制作过程中升温至高温阶段每隔2天进行翻堆，并同时调节含水率，使堆体温度尽量控制在65℃以内，含水率保持60％～65％；降温至后熟阶段自然发酵。
2、高温复合菌的筛选A、取样从高温阶段堆肥样品中取样；B、土壤浸出的液制备腐熟堆肥或肥沃的菜园土200g加上1000mL自来水，煮沸1h，过滤，灭菌，保存待用；C、液体发酵培养基A(W/％)的制备蛋白胨0.5，新鲜稻秆粉1，NaCl 0.5，CaCO30.2，酵母粉0.1，土壤浸出液10，0.5×6cm新华滤纸纸条；D、高温复合菌的筛选称取5g上述高温阶段的堆肥样品，加入100mL无菌水的250ml三角瓶中，在180rpm下震荡30min。按5％(v/v)比例加到试管液体发酵培养基A中(1.8×18cm)，培养基的高度保持6～10cm左右，55℃下静态富集培养。当滤纸将要崩解时按5％接种量转接到新鲜的液体发酵培养基A，在相同的培养条件下连续传代至富集培养物内的微生物区系和产酶性能稳定；此复合系作为高温复合菌。
3、中温复合菌的筛选A、取样从后熟阶段的高温堆肥样品中取样；B、液体发酵培养基B(W/％)的制备新鲜稻秆粉1.0，麦麸0.5，蛋白胨0.05，尿素0.03，KH2PO40.4，K2HPO40.3，(NH4)2SO4·7H2O0.03，Tween-80 0.2，FeSO4·7H2O 0.05，MnSO4·H2O 0.16，ZnSO4·7H2O 0.14，CaCl2微量(2mg)，pH6.0；C、中温复合菌的筛选将堆肥制作后熟阶段的样品按2～5％固液比加入装有200ml液体发酵培养基B的500ml三角瓶中，在30℃、180rpm/min摇床上，进行富集培养5～7天。将此富集物作为种子，按5％接种量转接到新鲜的培养基中，在相同的发酵条件下连续的传代下去，直到培养液中的微生物区系基本趋于稳定，此富集物为中温复合菌。
4、快腐菌剂的制备A固体发酵培养基(W/％)的制备切成2～5cm新鲜稻秆77％，麦麸20％，(NH4)2SO42％，尿素0.5％，KH2PO40.25％，MgSO4·7H2O 0.25％，pH为自然，含水率65％；灭菌1h；B、将筛选好的中温复合菌和高温复合菌按1∶1比例进行混合，按2～5％接种量转接到上述固体发酵培养基，分别在30℃和55℃下进行浅盘发酵5～7天，培养基厚度控制在5～10cm，每隔2天进行翻堆，40～50℃下烘干、粉碎，过10～20目筛子，最后将过筛后的中温固体曲(30℃下发酵)和高温固体曲(55℃下发酵)按质量比1∶1比例进行混合，即成为本发明的菌剂。
实施例2
1、高温复合菌的筛选A、取样从实施例1中高温阶段堆肥样品中取样；B、土壤浸出的液制备腐熟堆肥或肥沃的菜园土200g加上1000mL自来水，煮沸1h，过滤，灭菌，保存待用；C、液体发酵培养基A(W/％)的制备蛋白胨0.5，新鲜稻秆粉1，NaCl 0.5，CaCO30.2，酵母粉0.1，土壤浸出液10，0.5×6cm新华滤纸纸条；D、高温复合菌的筛选称取5g上述高温阶段的堆肥样品，加入100mL无菌水的250ml三角瓶中，在200rpm下震荡30min。按5％(v/v)比例加到试管液体发酵培养基A中(1.8×18cm)，培养基的高度保持6～10cm左右，60℃下静态富集培养。当滤纸将要崩解时按5％接种量转接到新鲜的液体发酵培养基A，在相同的培养条件下连续传代至富集培养物内的微生物区系和产酶性能稳定；此复合系作为高温复合菌。
2、中温复合菌的筛选A、取样从实施例1中后熟阶段的高温堆肥样品中取样；B、液体发酵培养基B(W/％)的制备新鲜稻秆粉1.0，麦麸0.5，蛋白胨0.05，尿素0.03，KH2PO40.4，K2HPO40.3，(NH4)2SO4·7H2O0.03，Tween-80 0.2，FeSO4·7H2O 0.05，MnSO4·H2O 0.16，ZnSO4·7H2O 0.14，CaCl2微量(2mg)，pH6.0；C、中温复合菌的筛选将堆肥制作后熟阶段的样品按2～5％固液比加入装有200ml液体发酵培养基B的500ml三角瓶中，在35℃、200rpm/min摇床上，进行富集培养5～7天。将此富集物作为种子，按5％接种量转接到新鲜的培养基中，在相同的发酵条件下连续的传代下去，直到培养液中的微生物区系基本趋于稳定，此富集物为中温复合菌。
3、快腐菌剂的制备A、固体发酵培养基(W/％)的制备切成2～5cm新鲜稻秆77％，麦麸20％，(NH4)2SO42％，尿素0.5％，KH2PO40.25％，MgSO4·7H2O 0.25％，pH为自然，含水率65％；灭菌1h；B、将筛选好的中温复合菌和高温复合菌按1∶1比例进行混合，按2～5％接种量转接到上述固体发酵培养基，分别在35℃和60℃下进行浅盘发酵5～7天，培养基厚度控制在10cm，每隔2天进行翻堆，40～50℃下烘干、粉碎，过10～20目筛子，最后将过筛后的中温固体曲(35℃下发酵)和高温固体曲(60℃下发酵)按质量比7∶3比例进行混合，即成为本发明的菌剂。
实施例31、高温复合菌的筛选A、取样从实施例1中所述高温阶段堆肥样品中取样；B、土壤浸出的液制备腐熟堆肥或肥沃的菜园土200g加上1000mL自来水，煮沸1h，过滤，灭菌，保存待用；C、液体发酵培养基A(W/％)的制备蛋白胨0.5，新鲜稻秆粉1，NaCl 0.5，CaCO30.2，酵母粉0.1，土壤浸出液10，0.5×6cm新华滤纸纸条；D、高温复合菌的筛选称取5g上述高温阶段的堆肥样品，加入100mL无菌水的250ml三角瓶中，在150rpm下震荡30min。按5％(v/v)比例加到试管液体发酵培养基A中(1.8×18cm)，培养基的高度保持6～10cm左右，50℃下静态富集培养。当滤纸将要崩解时按5％接种量转接到新鲜的液体发酵培养基A，在相同的培养条件下连续传代至富集培养物内的微生物区系和产酶性能稳定；此复合系作为高温复合菌。
2、中温复合菌的筛选A、取样从实施例1中后熟阶段的高温堆肥样品中取样；B、液体发酵培养基B(W/％)的制备新鲜稻秆粉1.0，麦麸0.5，蛋白胨0.05，尿素0.03，KH2PO40.4，K2HPO40.3，(NH4)2SO4·7H2O0.03，Tween-80 0.2，FeSO4·7H2O 0.05，MnSO4·H2O 0.16，ZnSO4·7H2O 0.14，CaCl2微量(2mg)，pH6.0；C、中温复合菌的的筛选将堆肥制作后熟阶段的样品按2～5％固液比加入装有200ml液体发酵培养基B的500ml三角瓶中，在25℃、150rpm/min摇床上，进行富集培养5～7天。将此富集物作为种子，按5％接种量转接到新鲜的培养基中，在相同的发酵条件下连续的传代下去，直到培养液中的微生物区系基本趋于稳定，此富集物为中温复合菌。
3、快腐菌剂的制备A、按实施例1或2中所述比例制备固体发酵培养基；B、将筛选好的中温复合菌和高温复合菌按1∶1比例进行混合，按2～5％接种量转接到上述固体发酵培养基，分别在25℃和50℃下进行浅盘发酵5～7天，培养基厚度控制在5cm，每隔2天进行翻堆，40～50℃下烘干、粉碎，过10～20目筛子，最后将过筛后的中温固体曲(25℃下发酵)和高温固体曲(50℃下发酵)按质量比3∶7比例进行混合，即成为本发明的菌剂。
实施例4将实施例1中得到的中温复合菌和高温复合菌分别在固态和液态条件下进行发酵，最后将液体菌剂吸附到固体菌剂中；具体步骤为A、中温复合菌按2％比例接种到固体发酵培养基，在25℃下进行浅盘发酵5～7天，培养基厚度控制在5cm，每隔2天进行翻堆，40～50℃下烘干、粉碎，过10～20目筛子，待用；B、将高温复合菌按2％接种量转接到液体实施例1中所述发酵培养基A中，50℃下静态发酵3～5天，至培养基中的滤纸完全被崩解。
C、将高温复合菌以相同菌数吸附到中温复合菌的固体曲中，在40～50℃下烘干，即成为本发明的菌剂。
实施例5将实施例1中得到的中温复合菌和高温复合菌分别在固态和液态条件下进行发酵，最后将液体菌剂吸附到固体菌剂中；具体步骤为A、中温复合菌按5％比例接种到上述实施例中所述的固体发酵培养基，在35℃下进行浅盘发酵5～7天，培养基厚度控制在10cm，每隔2天进行翻堆，40～50℃下烘干、粉碎，过10～20目筛子，待用；B、将高温复合菌按5％接种量转接到液体实施例1中所述发酵培养基A中，60℃下静态发酵3～5天，至培养基中的滤纸完全被崩解。
C、将高温复合菌以相同菌数吸附到中温复合菌的固体曲中，在40～50℃下烘干，即成为本发明的菌剂。
实施例6
称取1000kg新鲜作物秸秆(如稻秆、麦秆等)，加入50～100kg新鲜畜禽粪便(鸡粪，猪粪、牛粪等)、1kg由上述实施例所获得的复合菌剂，调节含水率为65％，均匀地混拌，在长型发酵槽(1.2m×1.5m×20m)内堆成高1.2m、宽1.5m的长型堆体，进行发酵。在堆肥的制作过程中升温至高温阶段每隔2天进行翻堆并同时调节含水率，使堆体温度尽量控制在65℃以内，含水率保持60％～65％；降温至后熟阶段自然发酵，发酵15天可制成优质的高温堆肥，原料中的有机物得到了降解。
实施例7称取1000kg新鲜作物秸秆(如稻秆、麦秆等)，加入2～5kg由上述实施例所获得的复合菌剂、20～30kg尿素或硫铵、50kg腐熟堆肥，调节含水率为65％，均匀地混拌，在长型发酵槽(1.2m×1.5m×20m)内堆成高1.2m、宽1.5m的长型堆体，进行发酵。在堆肥的制作过程中升温至高温阶段每隔2天进行翻堆的同时调节含水率，使堆体温度尽量控制在65℃以内，含水率保持60％～65％；降温至后熟阶段自然发酵，发酵15天后可达到腐熟的目的，秸秆中的木质纤维素得到了降解。
权利要求
1.一种有机废弃物快腐菌剂，其特征是所述菌剂由适合pH范围在4.0～10.0之间的嗜温微生物和嗜热微生物的复合菌群共同组成，所述菌剂中含有能产木质纤维素酶的细菌、放线菌和真菌，细菌主要由芽孢杆菌组成，放线菌主要由链霉菌组成，真菌主要由木霉和曲霉组成，每干重1克的菌剂中含有细菌108～1010个、放线菌106～108个、真菌105～107个。
2.根据权利要求1所述的一种有机废弃物快腐菌剂，其构建方法包括如下步骤A)高温复合菌的筛选从富含木质纤维素分解菌环境中取样，以木质纤维素为唯一碳源，在50～60℃下静置富集培养，在相同的发酵条件下连续传代至富集培养物的微生物区系及降解机能稳定，即为高温复合菌；B)中温复合菌的筛选从富含木质纤维素分解菌环境中取样，以木质纤维素为唯一碳源，在25～35℃温度、150～200rpm/min摇床上进行富集培养，在相同的发酵条件下连续传代至富集培养物的微生物区系及降解机能稳定，作为中温复合菌；C)将所获得的中温复合菌和高温复合菌按相同的菌数进行混合，并以2～5％接种量转接到固体发酵培养基，分别在25～35℃中温和50～60℃高温下进行浅盘发酵5～7天，固体培养基厚度为5～10cm，每隔2天进行翻堆，将中温和高温培养后的两种培养物分别在40～50℃下烘干、粉碎，过10～20目筛子，得到中温固体曲和高温固体曲，将质量含量30％～70％的中温固体曲和70％～30％高温固体曲进行混合，所获得的混合物即为所述一种有机废弃物快腐菌剂。
3.根据权利要求1所述的一种有机废弃物快腐菌剂，其构建方法包括如下步骤A)中温复合菌的筛选从富含木质纤维素分解菌环境中取样，以木质纤维素为唯一碳源，在25～35℃温度、150～200rpm/min摇床上进行富集培养，在相同的发酵条件下连续传代至富集培养物的微生物区系及降解机能稳定，作为中温复合菌；B)将所获得的中温复合菌按2～5％接种量转接固体发酵培养基，在25～35℃下进行浅盘发酵5～7天，培养基厚度控制在5～10cm，每隔2天进行翻堆，40～50℃下烘干、粉碎，即成为中温复合系的固体曲；C)高温复合菌的筛选从富含木质纤维素分解菌环境中取样，以木质纤维素为唯一碳源，在50～60℃下静置富集培养，在相同的发酵条件下连续传代至富集培养物的微生物区系及降解机能稳定，即为高温复合菌；D)将所获得的高温复合菌，按2～5％比例接种到液体发酵培养基，50～60℃下静态发酵3～5天，即为高温菌的发酵液；E)将高温菌的发酵液以相同菌数吸附到中温复合系的固体曲中，在40～50℃下烘干，即成为所述一种有机废弃物快腐菌剂。
全文摘要
本发明公开了垃圾处理技术领域内的一种有机废弃物快腐菌剂及其构建方法，所述快腐菌剂包括细菌、放线菌、真菌等不同类群的微生物，不同微生物间具有良好的协同作用。本发明所述菌剂直接以复合菌的形式分离筛选木质纤维素分解菌群而得。所述快腐菌剂不仅对作物秸秆、畜禽粪便、生活垃圾等有机废弃物具有高效稳定的降解机能，而且对不同环境的适应性及抗污染能力强，在有机废弃物资源化再生利用及环保等方面具有广阔的应用前景。
文档编号C12N1/20GK1560230SQ20041001420
公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月1日 优先权日2004年3月1日
发明者朴哲, 杨林章, 殷士学, 胡健, 朴 哲 申请人:扬州大学