专利名称：一类具有毒杀线虫活性的化合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类具有毒杀线虫活性的化合物及其应用，属微生物生物农药技术领域。
背景技术：
线虫危害严重，它不仅给人类和动物带来严重的疾病，而且每年给农作物造成相当于1044亿美元的损失。目前对线虫的防治仍然以化学防治为主，但由于化学杀线虫剂多数是高毒、高残留农药，对人蓄和环境造成严重的威胁。有的化学杀线虫剂，如用作土壤熏蒸剂的溴甲烷类等，已经在全球多数国家禁止使用或已经规定使用的最后期限。随着人们环境意识的增强，化学杀线剂的应用受到限制，因此对线虫的生防研究自然成为重点和焦点问题。在线虫的生防研究中，目前已有直接利用菌体的第一代商品生防剂问世，并已有相当范围的大田应用。由于这一代产品是活菌体，土壤存在着不同程度的抑菌作用，导致在不同国家不同土壤中试用的不稳定性和不一致。这是活体生防制剂的共同通病，为克服这一难题，人们更加关注线虫生防第二代产品的开发，即菌株次生代谢产物的研究与开发。
近30年的研究中，已从50多株菌中分离到90多种对线虫有活性的化合物，其结构类型多样，主要有醌类、生物碱类、萜类、肽类、吡喃类、脂肪酸类和萘类等。但由于各种原因，在这些化合物中目前具有潜力开发成线虫生防制剂的很少，因此加紧筛选获得对线虫有活性的物质或组分，将其开发成生防制剂是一项具有重要意义。
5-甲基-3-呋喃羧酸是一种呋喃的羧酸衍生物，CAS No.21984-93-0，CA名称3-Furancarboxylic acid，5-Methyl，分子式C6H6O3，分子量126.10，结构式如下 5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮是一种呋喃类的衍生物，CASNo.14300-72-2，CA名称2(5H)-Furanone，-5-hydroxy-3，5-dimethyl，分子式C6H8O3，分子量128.21，结构式如下
国内外文献检索表明，5-甲基-3-呋喃羧酸常被用作有机合成的前体，但未见有关活性和天然来源的报道，也未见5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮用于制备杀线虫制剂应用的公开文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮及其在制备杀线虫制剂中的应用。
本发明是这样实现的本发明使用的真菌是毛头鬼伞(Coprinus comatus LHA-7)，LHA-7菌株已于2003年5月26日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.0932。
毛头鬼伞属担子菌，主要形态特征是子实体较大。菌盖呈圆柱形，当开伞后限快边缘菌褶溶化成墨汁状液体。菌盖直径3-5cm，高达9-11cm，表面褐色至浅褐色，并随着菌盖长大而断裂成较大型鳞片。菌肉白色。菌柄白色较细长，圆柱形且向下渐粗，长7-25cm，粗1-2cm，光滑，椭圆形12.5-16×7.5-9μm。具囊体，无色，棒状顶部钝圆24-60×10-12.3μm。菌丝无色，具明显锁状联合。
本发明将毛头鬼伞(Coprinus comatus LHA-7)通过常规发酵培养，将发酵液低压浓缩后，用甲醇提取。将甲醇提取物经反复硅胶柱，氯仿/甲醇洗脱，得到本发明的化合物，化合物经核磁共振波谱，质谱，红外光谱和紫外光谱确定为5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮，结构式依次为 5-甲基-3-呋喃羧酸5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮实验表明5-甲基-3-呋喃羧酸具有显著的毒杀腐生线虫和花生根结线虫的活性，对腐生线虫的ED50(半致死率)为125ppm(24hr)，ED90(90％致死率24hr)为500ppm。对花生根结线虫的ED50(半致死率)为125ppm(24hr)，ED90(90％致死率24hr)为250ppm。5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮对腐生线虫的ED50(半致死率)为250ppm(24hr)，ED90(90％致死率24hr)为500ppm。对花生根结线虫的ED50(半致死率)为250ppm(24hr)，ED90(90％致死率24hr)为500ppm。
本发明将从Coprinus comatus LHA-7中用现有方法分离得到的5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮作为制备杀线虫制剂的应用。
本发明亦可将0.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于二甲亚砜，再用Tween-20水溶液稀释，得具杀线虫活性物质的乳浊液；乳浊液中，二甲亚砜的终浓度不超过3％，Tween-20的终浓度不超过0.3％；该乳浊液作为制备杀线虫制剂的应用。
本发明与现有的杀植物寄生线虫药相比，具有高效、低毒及低残留等优点。
具体实施例方式本发明化合物的发酵生产方法1、将LHA-7的菌丝体接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，20-30℃下培养4-8天，获得试管种；2、将试管种接种到250ml三角瓶中(每瓶装50ml)液体培养基中，培养基配方为马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml，自然pH。培养温度20-30℃；摇床培养，转速为100-300rpm；培养时间4-12天。
3、将含菌丝的发酵液将发酵液低压浓缩后，用甲醇反复溶解，把溶解物合并低压浓缩后得甲醇提取物。用甲醇溶解提取物上样，经正相硅胶柱层析，氯仿反复洗脱。活性跟踪检测所分离到的组分，将具有活性的部分合并低压浓缩，经反复硅胶柱层析，氯仿/甲醇洗脱，洗脱液经活性检测，活性部分经TLC检测(展开剂氯仿∶甲醇5∶1；硫酸显色)，将只具有同一个单点的部位合并得到化合物5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮。
本发明化合物对植物寄生线虫的药效试验1、试验用药剂将化合物溶于少量二甲亚砜，用无菌蒸馏水稀释为适用浓度，二甲亚砜的终浓度不超过3％。
将未接种的发酵培养基低压浓缩后，用甲醇提取。将甲醇提取物浓缩后用二甲亚砜溶解，再用无菌蒸馏水稀释为适用浓度作为对照。
2、制备试验用线虫(1)制备Panagrellus redivivus线虫将P.redivivus线虫接种于燕麦片培养基上，于28℃下培养6天，冻于4℃冰箱备用。将所需线虫用贝曼漏斗法洗出，置于5ml离心管内，加5ml无菌水洗涤，瞬时离心，弃上清，重复5次得到洁净供试线虫。用无菌水将线虫稀释为含量为15条/μl的线虫悬浮液。
(2)花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)的培养将温室培养的带有花生根结线虫的蕃茄根用无菌水洗净，用解剖针挑取根结线虫的卵囊置于0.4M的KCl溶液中，在5ml离心管中依次用4ml无菌水(三次)、1ml无菌青-链霉素双抗溶液、3ml 0.1％的NaClO溶液洗涤和消毒，每一步骤均通过短暂离心(8000转30秒)除去上清液。洗涤好的虫卵置于0.4M的ZnCl2溶液中孵化48小时，二龄幼虫用移液器收集于1.5ml离心管，通过短暂离心(5000转30秒)富集备用。
3、试验方法将本发明化合物稀释为不同浓度供试药液，将药液200μl于20孔板中，加入活线虫100-150条，置于25℃下，分别于4小时、12小时、24小时在光学显微镜下检查计算线虫的死亡率。
鉴定死亡的方法为在处理板孔中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分钟后观察，死虫僵直，活虫则卷曲或扭动。
死亡率％＝(死亡线虫数/(死亡线虫数+存活线虫数))×100％校正死亡率％＝样品死亡率-对照死亡率实施例1化合物对线虫的毒杀作用将0.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于少量二甲亚砜，用无菌蒸馏水稀释为500ppm溶液，二甲亚砜的终浓度不超过3％。
按上述试验方法进行药效试验。列表所示为校正死亡率。
表15-甲基-3-呋喃羧酸对P.redivivus线虫的毒杀作用重复次数 4小时 12小时24小时135.3％ 81.1％100％243.7％ 82.8％100％352.1％ 98.3％100％结果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸500ppm水溶液对P.redivivus线虫的致死率在12小时达到80％以上，24小时达到100％。具有明显的杀线虫活性。
表2 5-甲基-3-呋喃羧酸对M.arenaria线虫的毒杀作用重复次数 4小时 12小时24小时l40.7％ 90.7％100％248.8％ 93.5％100％353.6％ 88.9％100％结果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸500ppm水溶液对M.arenaria线虫的致死率在12小时达到90％以上，24小时达到100％。具有明显的杀线虫活性。
表3 5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮对P.redivivus线虫的毒杀作用重复次数 4小时 12小时 24小时145.2％ 87.1％ 100％233.1％ 72.4％ 100％342.1％ 78.3％ 100％结果表明，5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮500ppm水溶液对P.redivivus线虫的致死率在12小时达到70％以上，24小时达到100％。具有明显的杀线虫活性。
表4 5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮对M.arenaria线虫的毒杀作用重复次数 4小时 12小时24小时152.1％ 91.1％100％255.4％ 92.5％100％352.2％ 91.0％100％结果表明，5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮500ppm水溶液对M.arenaria线虫的致死率在12小时达到90％以上，24小时达到100％。具有明显的杀线虫活性。
实施例2化合物对线虫的半致死率ED50实施例2方法同实施例1，不同之处为将2.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于少量二甲亚砜，配制为1000ppm的水溶液，随后倍半稀释，测定ED50(半致死率)和ED90(90％致死率)，待测溶液中二甲亚砜的终浓度不超过3％。
表5 5-甲基-3-呋喃羧酸对P.redivivus线虫的ED50和ED90浓度ppm4小时 12小时24小时1000 86.5％ 97.3％100％50078.8％ 92.1％100％25067.9％ 75.4％89.6％12545.8％ 60.7％83.4％60 9.34％ 11.3％18.2％30 7.90％ 15.6％17.6％15 6.86％ 10.8％17.3％表6 5-甲基-3-呋喃羧酸对M.arenaria线虫的ED50和ED90浓度ppm4小时 12小时24小时1000 81.7％ 97.7％100％50068.6％ 87.8％100％25051.5％ 86.5％98.8％
125 23.5％ 45.7％ 64.2％6021.6％ 31.3％ 45.5％3011.7％ 12.8％ 20.9％1510.7％ 13.5％ 15.6％结果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸对M.arenaria线虫的ED50(半致死率，24hr)为125ppm，ED90(90％致死率，24hr)为250ppm。
表7 5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮对P.redivivus线虫的ED50和ED90浓度ppm 4小时 12小时24小时1000 71.2％ 89.4％100％500 60.8％ 76.6％100％250 47.2％ 55.4％72.1％125 33.3％ 40.7％46.9％6011.2％ 12.1％27.6％309.08％ 15.6％19.5％1510.1％ 12.55 18.7％结果表明，5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮对P.redivivus线虫的ED50(半致死率，24hr)为250ppm，ED90(90％致死率，24hr)为500pm。
表8 5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮对M.arenaria线虫的ED50和ED90浓度ppm4小时 12小时24小时1000 76.5％ 97.3％100％50072.1％ 82.1％100％25065.8％ 65.4％70.8％12534.8％ 47.7％49.4％60 19.2％ 28.3％33.9％30 11.9％ 16.6％28.9％15 11.2％ 10.8％17.3％结果表明，5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮对M.arenaria线虫的ED50(半致死率，24hr)为250ppm，ED90(90％致死率，24hr)为500ppm。
实施例3化合物与乳化剂混合对线虫的毒杀作用实施例3方法同实施例1，不同之处为将0.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于二甲亚砜，再用0.3％浓度的Tween-20水溶液稀释，稀释浓度为500ppm，得具杀线虫活性物质的乳浊液。在该乳浊液中，二甲亚砜的终浓度不超过3％，Tween-20的终浓度不超过0.3％。
表9 5-甲基-3-呋喃羧酸乳化制剂对P.redivivus线虫的毒杀作用重复次数4小时 12小时 24小时1 52.5％ 99.8％ 100％2 62.4％ 98.4％ 100％3 58.6％ 97.8％ 100％结果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸与乳化剂混合后可以提高毒杀P.redivivus线虫活性，提高率为12-20％。
表10 5-甲基-3-呋喃羧酸乳化制剂对M.arenaria线虫的毒杀作用重复次数4小时 12小时 24小时1 61.3％ 99.0％ 100％2 62.4％ 98.7％ 100％3 65.8％ 96.7％ 100％结果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸与乳化剂混合后可以提高毒杀M.arenaria线虫活性，提高率为7-10％。
表11 5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮乳化制剂对P.redivivus的毒杀作用重复次数4小时 12小时 24小时1 51.382.41002 52.291.21003 57.680.7100结果表明，5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮与乳化剂混合后可以提高毒杀P.redivivus线虫活性，提高率为7-10％。
表12 5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮乳化制剂对M.arenaria的毒杀作用重复次数4小时 12小时 24小时1 72.398.51002 65.291.21003 68.495.8100结果表明，5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮与乳化剂混合后可以提高毒杀M.arenaria线虫活性，提高率为4-6％。
权利要求
1.一类具有毒杀线虫活性的化合物，由生产菌株和辅料经发酵培养、甲醇提取、反复硅胶柱及氯仿/甲醇洗脱工序后分离得到，其特征在于(1)生产菌株为毛头鬼伞(Coprinus comatus LHA-7)，LHA-7菌株已于2003年5月26日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.0932；(2)分离得到的化合物经核磁共振波谱，质谱，红外光谱和紫外光谱确定为5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮，结构式依次为
2.权利要求1所说的化合物，其特征在于(1)5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮作为制备杀线虫制剂的应用；(2)将0.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于二甲亚砜，再用Tween-20水溶液稀释，得具杀线虫活性物质的乳浊液；乳浊液中，二甲亚砜的终浓度不超过3％，Tween-20的终浓度不超过0.3％；该乳浊液作为制备杀线虫制剂的应用。
全文摘要
本发明涉及一类具有毒杀线虫活性的化合物及其应用，属微生物生物农药技术领域。本发明由毛头鬼伞(Coprinus comatus)LHA－7菌株和辅料经常规工序后分离得到5－甲基－3－呋喃羧酸和5－羟基－3，5－二甲基－2(5H)呋喃酮。5－甲基－3－呋喃羧酸具有显著的毒杀线虫活性，对腐生线虫的ED
文档编号C12P17/02GK1631885SQ20041004079
公开日2005年6月29日 申请日期2004年9月30日 优先权日2004年9月30日
发明者刘亚君, 张克勤 申请人:云南大学