专利名称：精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种体外诊断试剂及检测方法，具体地说是精浆弹性硬蛋白酶(Seminal Plasma PMN-Elastase)检测试剂及检测方法。
背景技术：
男性生殖道感染是男性不育的重要病因，占男性不育病因的4～10％。近年来，随着性传播疾病的蔓延，以及亚临床症状和隐性感染的增多，对男性生殖道感染的实验室诊断受到特别的重视。医学研究业已表明，采用过氧化物酶法检测精液中的白细胞与精浆弹性硬蛋白酶浓度呈良好相关性。
发明内容
目前体外诊断男性生殖道感染的测定方法，以显微镜镜下观察精液白细胞数量应用最为广泛。但此方法的结果报告主观性较强，且准确性受到标本新鲜度的影响。
本发明要解决的技术问题是提出一种方便实用、能够定量检测精浆弹性硬蛋白酶含量的试剂、试剂盒及其检测方法，通过定量检测精浆弹性硬蛋白酶的活性，从而确定免疫反应中粒细胞的释放量以及罹患炎性感染的程度，能为准确诊断包括隐性感染在内男性生殖道感染提供科学依据。
上述技术问题的解决方案一种精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂，包括标本稀释液、酶结合物、显色剂、洗涤液、终止液和含有用于定量检测的弹性硬蛋白酶的标准品。
一种精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂，基本上由标本稀释液、酶结合物、显色剂、洗涤液、终止液和含有用于定量检测的弹性硬蛋白酶的标准品组成。
所述检测试剂还包括微量孔板，所述微量孔板的底部包被有弹性硬蛋白酶单克隆抗体。
所述含有用于定量检测的弹性硬蛋白酶的标准品是至少两个弹性硬蛋白酶含量在0-4000纳克/毫升之间不同浓度的磷酸盐冻干粉或溶解液。弹性硬蛋白酶含量取值达4000纳克/毫升，是为了可涵盖人体精浆弹性硬蛋白酶含量的正常及异常值分布范围。
所述酶结合物是含有α1-抗胰蛋白酶与辣根过氧化物酶的复合物、酪蛋白的三羟甲基氨基甲烷与盐酸的混合缓冲液。
当标准品是冻干粉时，还包括起复溶和稳定作用的标准品溶解液，其组成及含量可选葡萄糖0.2～2.0％、氯化钠1.0～10.0％、酪蛋白0.1～1.0％的水溶液。
所述显色剂有两种，一种是含有过硼酸钠、氯己啶的柠檬酸与磷酸氢二钠的混合缓冲液；另一种是含有3，3′，5，5′-四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液。为了不至于使浓度低时反应速度慢，在规定的时间内达不到所需要的反应强度，浓度高时反应速度快，非特异性显色增多，影响检测的准确性，过硼酸钠含量在0.01～0.10％之间为宜，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺含量在10～100毫摩尔/升之间为宜。
一种精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂盒，包括标本稀释液、酶结合物、显色剂、洗涤液、终止液、含有用于定量检测的弹性硬蛋白酶的标准品和微量孔板，所述微量孔板的底部包被有弹性硬蛋白酶单克隆抗体。
一种包被有弹性硬蛋白酶单克隆抗体的微量孔板的制备方法，包括(一)用去离子水配制包被液；(二)在上述包被液中加入小牛血清、葡萄糖，配制成封闭液；(三)将洗涤液稀释；(四)作交叉实验，确定包被抗体与酶标抗体的最佳浓度，用包被液稀释包被抗体至最佳浓度，在微量孔板的各孔中加入包被抗体，使包被抗体充分包被在微量孔板的底部；(五)用洗涤液清洗微量孔板、拍干；(六)在微量孔板的各孔中加入封闭液，使封闭液中的大分子物质吸附在未被包被抗体所包被的微量孔板的底部；(七)用洗涤液再清洗微量孔板内未吸附的封闭液，拍干；(八)置入无菌室，抽湿干燥；(九)装袋、封口保存。
将精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂用于检测精浆弹性硬蛋白酶的方法，包括以下步骤(一)试剂准备(1)标本稀释液配备将浓缩标本稀释液稀释至应用浓度；(2)标准品制备将标准品冻干粉置入溶解液溶解后用标本稀释液稀释成不同浓度的标准品；
(3)洗涤液配备将洗涤液稀释至应用浓度；(二)标本制备将采集的精液经液化、离心处理后，留取待检精浆标本并用标本稀释液稀释；(三)定量检测(1)准备适当数量的包被微量板孔，标准液、稀释标本加样量相等，标准液取不同浓度；(2)用封片膜封板，使标准液和稀释标本中的弹性硬蛋白酶与包被在微量孔板上的包被抗体充分反应；(3)弃去封板膜，用洗涤液洗板，洗去标准液和稀释标本中未被包被抗体特异性结合的其它物质并拍干；(4)每孔加酶结合物后，再用封片膜封板，使结合在包被抗体上的弹性硬蛋白酶与酶结合物中的α1-抗胰蛋白酶反应；(5)再次弃去封板膜，用洗涤液洗板，洗去未与弹性硬蛋白酶发生特异性结合的其它物质并拍干；(6)将两种显色剂均匀混合配制后的显色液加入微量孔内，使显色液被包被抗体-弹性硬蛋白酶-α1-抗胰蛋白酶-辣根过氧化物酶复合物上的辣根过氧化物酶催化反应；(7)每孔加终止液充分均匀混合后终止辣根过氧化物酶的催化反应，送至酶标仪；(8)通过酶标仪进行比色，得到检测结果。
采用上述技术方案，本发明有益的技术效果在于(1)由于弹性硬蛋白酶是一种中性蛋白酶，活性比较稳定，利用其特有的抗原性，在精浆弹性硬蛋白酶检测试剂中引入已知浓度含量的弹性硬蛋白酶标准液，通过使标准品和稀释标本中的弹性硬蛋白酶分别与弹性硬蛋白酶单克隆抗体的特异性结合，各自加入酶结合物，使结合在包被抗体上的弹性硬蛋白酶与酶结合物中的α1-抗胰蛋白酶反应，可以显效地增加反应的特异性和灵敏度，加入显色剂，使显色液被包被抗体-弹性硬蛋白酶-α1-抗胰蛋白酶-辣根过氧化物酶复合物上的辣根过氧化物酶催化反应，生成有颜色产物，利用颜色强度与辣根过氧化物酶含量成正比的关系，根据标准液中弹性硬蛋白酶的已知浓度含量，从而可以定量检测出精浆弹性硬蛋白酶含量，为更准确的诊断包括隐性感染在内男性生殖道感染提供科学依据，本发明试剂已进入临床试用阶段，适宜在治疗男性不育的医疗机构中推广应用。(2)由于本发明采用酶标仪进行比色，即使在处理或储藏过程中造成精液白细胞的破损，也不会影响检测结果。避免了显微镜镜下观察精液白细胞数量的结果报告主观性较强，且准确性受到标本新鲜度的影响(不新鲜的精液标本中的白细胞易破损)。由于采用了包被有单克隆抗体的微量孔板，制成固相载体，检验方法简单、实用。(3)标准品的线性范围广，从0至4000纳克/毫升，可涵盖正常及异常值分布范围。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明。
一种精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂，包括标准品 显色剂B标准品溶解液 浓缩洗涤液(20倍)浓缩标本稀释液(10倍) 终止液酶结合物 包被微孔板显色剂A其中，标准品包括标准品1弹性硬蛋白酶含量为4000纳克/毫升的样本稀释液。
标准品1的制备方法1)、准确称取葡萄糖0.5克，氨基乙酸0.220克，硫柳汞0.020克置烧杯，搅拌溶于pH7.40.05M适量磷酸盐缓冲液内，用磷酸盐缓冲液定容至100毫升。
2)、称取400微克弹性硬蛋白酶，溶于上述溶液内，分装冻干，4℃保存。
标准品2将标准品1向下倍比稀释制得弹性硬蛋白酶含量为2000纳克/毫升的样本稀释液；标准品3将标准品2向下倍比稀释制得弹性硬蛋白酶含量为1000纳克/毫升的样本稀释液；标准品4将标准品3向下倍比稀释制得弹性硬蛋白酶含量为500纳克/毫升的样本稀释液；标准品5弹性硬蛋白酶含量为0的样本稀释液。
标准品在置于4℃下保存时为冻干粉。
标准品溶解液是含有含有葡萄糖、氯化钠、酪蛋白的水溶液。
标准品溶解液的制备方法
3)、称取葡萄糖10克，氯化钠30mM，酪蛋白2克，硫柳汞0.020克，溶于800毫升双蒸水中。
4)、移入1000毫升装容量瓶内，用双蒸水定容至1000毫升，置4℃保存。
浓缩标本稀释液是含有氢化钠、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢钠、氯化钾、硫柳汞和小牛血清的水溶液。
浓缩标本稀释液的制备方法5)、准确称取氢化钠8.000克，磷酸二氢钾0.200克，十二水磷酸氢钠2.900克，氯化钾0.200克，硫柳汞0.100克，溶于50毫升双蒸水。
6)、加入已灭活小牛血清45毫升。调整pH值至7.4。加双蒸水定容至100毫升。4℃保存。
显色剂有两种显色剂A和B，显色剂A是含有过硼酸钠、氯己啶、柠檬酸和磷酸氢二钠的混合缓冲液；显色剂B是含有3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)的二甲基亚砜溶液(DMA)。
显色剂A的制作工艺方法7)、称取过硼酸钠(NaBO3·4H2O)0.4625g，氯己啶(又称洗必太)0.010g，溶于0.05M柠檬酸/磷酸氢二钠(Na2HPO4)缓冲液溶解(pH4.0)800毫升内。
8)、调整pH值至4.0，用0.05M柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲液定容至1000毫升。4℃保存。
显色剂B的制作工艺方法9)、在分度值为万分之一的分析天平上准确称取3，3′，5，5′-四甲基联苯胺41mmol，溶于适量二甲基亚砜中，移入1000毫升装的容量瓶内，以DMA定容至1000毫升。
浓缩洗涤液(20倍)的制作工艺方法10)、称取氯化钠16.0克，磷酸二氢钾4.000克，十二水磷酸氢二钠58.0克，氯化钾4.000克，硫柳汞1.000克，溶于800毫升双蒸水中。
11)、取10毫升Tween-20加于上述溶液内，混匀。调节pH至7.4，用双蒸水定容至1000毫升，4℃保存。
G、终止液的制作工艺方法12)、量取83.4ml浓盐酸(37％)，用蒸馏水定容至1000ml。
13)、用1N氢氧化钠滴定并校正其浓度至1N。
终止液可以是盐酸含量为1.85～5.55％的水溶液。
H、酶结合物的制作工艺方法14)、取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于1ml 0.3mol/L，pH 8.1碳酸氢钠(NaHCO3)，加入1％二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶0.1ml，室温下轻微搅拌1小时。
15)、加1ml 0.06mol/L过碘酸钠(NaIO4)，室温下避光轻搅30分钟。
16)、加1ml 0.16mol/L乙二醇，室温下搅拌1小时，以终止氧化反应。
17)、装入透析袋，对0.01mol/LpH 9.5碳酸盐缓冲液1000ml，4℃透析过液，换液三次。
18)、取步骤17)制得的醛化HRP溶液3ml加入含5mg α1-抗胰蛋白酶(anti-humanalpha1-antitrypsin)的碳酸盐缓冲液1ml，室温避光轻搅拌2～3小时。
19)、加入5mg硼氢化钠(NaHB4)，4℃过夜。
20)、装入透析袋，对0.01mol/LpH 7.2的含氯化钠的磷酸盐缓冲液在4℃下透析24小时，去除未反应的硼氢化钠，换液三次。
21)、3000r/min离心30min，除去沉淀物。上清液通过Sephadex G-200凝胶柱层析，PBS洗脱并收集凝胶柱内的酶结合物。
22)、制备酶结合物稀释液称取0.5克酪蛋白，加入1000毫升pH7.520mmol/L的三羟甲基氨基甲烷与盐酸(Tris-HCl)缓冲液中，在磁力搅拌器上加热搅拌溶解。待其完全溶解后，加蒸馏水定容至1000毫升。称取1.0克牛血清蛋白(BSA)、0.010克苋菜红(AMARANTH)溶于上述溶液中，滤过除菌，4℃保存。此液即为酶结合物稀释液。
23)、用酶结合物稀释液稀释酶结合物至适当比例，4℃保存。
包被微孔板的制备方法，包括如下步骤(一)在优质去离子水中加入含180毫摩尔/升氯化钠、0.75％叠氮钠的0.015克分子浓度pH值为7.3的含氯化钠的磷酸盐缓冲液，配制包被液；(二)在上述包被液中加入6％小牛血清、11％葡萄糖，配制封闭液；(三)将洗涤液按比例1∶20稀释；(四)作交叉实验，确定包被抗体与酶标抗体的最佳浓度，用包被液稀释包被材料，使其至最佳浓度，在微量孔板的每孔中加入100微升包被材料，在4℃下放置12小时；(五)用洗涤液洗微量孔板两次，每次拍干；
(六)每孔加入封闭液100微升，在4℃下放置12小时；(七)用洗涤液再洗微量孔板一次，拍干；(八)置入无菌室，抽湿干燥12小时；(九)置入铝薄袋，封口，置于4℃下保存备用。
一种采用上述精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂制作的试剂盒，各组分含量为标准冻干粉溶解液50～150微升、标准液50～150微升、酶结合物50～150微升、显色剂A 50～150微升、显色剂B 1～4微升、终止液50～150微升和包被有弹性硬蛋白酶单克隆抗体的微量孔板。
一种优选方案，各组分含量为标准冻干粉溶解液100微升、标准液100微升、酶结合物100微升、显色剂A 100微升、显色剂B 2.5微升、终止液100微升和包被有弹性硬蛋白酶单克隆抗体的微量孔板。
上述精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂用于精浆弹性硬蛋白酶定量检验的步骤包括(一)试剂准备(1)标准品制备将弹性硬蛋白酶含量为4000纳克/毫升标准冻干粉，用标准冻干粉溶解液复溶至冻干前的体积，溶解0.5小时待用；将弹性硬蛋白酶含量为4000纳克/毫升标准液向下分别稀释为弹性硬蛋白酶含量为2000、1000和500纳克/毫升三种浓度。
(2)标本稀释液配备以10倍蒸馏水将浓缩标本稀释液稀释。
(3)洗涤液配备以20倍蒸馏水将浓缩洗涤液稀释。
(二)标本制备采集的新鲜精液液化后，迅速取部分精液以2000g离心处理10分钟，留取精浆立即检测，或在-20℃下储存待分析；检测前，将待检精浆标本1∶101稀释。
(三)定量检测
(1)准备一定数量的包被有弹性硬蛋白酶单克隆抗体的微量板孔标准液、稀释标本加样量都为100微升/孔。五种标准液弹性硬蛋白酶浓度依次为4000、2000、1500、500和0纳克/毫升，以标本稀释液作为0标准。
(2)用封片膜封板置于350～400转/分钟的孵育振荡器，在室温18～28℃下反应1小时。
(3)弃去封板膜、洗板以洗涤液注满微孔，每次浸泡1分钟，共洗板5次，拍干。
(4)每孔加酶结合物100微升用封板膜封板，置于350～400转/分钟的孵育振荡器，在室温18～28℃下反应0.75小时。
(5)再次弃去封板膜、洗板以洗涤液注满微孔，每次浸泡1分钟，共洗板5次，拍干。
(6)每孔加显色液100微升在室温18～28℃下避光反应1/3小时。
显色液在使用前0.5小时内临时配制，配制方法是按体积比40∶1，将两种显色剂均匀混合。
(7)每孔加终止液100微升充分均匀混合后终止反应，在1/4小时内送至酶标仪。
(8)酶标仪以450/630毫微米双波长进行比色，检测结果由酶标仪自动输出。
精浆弹性硬蛋白酶检验的临床参考值如下正常值＜290纳克/毫升；隐性感染290～1000纳克/毫升；确证感染＞1000纳克/毫升。
权利要求
1.一种精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂，包括标本稀释液、酶结合物、显色剂、洗涤液和终止液，其特征在于还包括含有用于定量检测的弹性硬蛋白酶的标准品。
2.一种精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂，基本上由标本稀释液、酶结合物、显色剂、洗涤液、终止液和含有用于定量检测的弹性硬蛋白酶的标准品组成。
3.按照权利要求1或2所述的精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂，其特征在于还包括微量孔板，所述微量孔板的底部包被有弹性硬蛋白酶单克隆抗体。
4.按照权利要求3所述的精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂，其特征在于所述含有用于定量检测的弹性硬蛋白酶的标准品是至少两个弹性硬蛋白酶含量在0-4000纳克/毫升之间不同浓度的磷酸盐冻干粉或溶解液。
5.按照权利要求3所述的精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂，其特征在于所述酶结合物是含有α1-抗胰蛋白酶与辣根过氧化物酶的复合物、酪蛋白的三羟甲基氨基甲烷与盐酸的混合缓冲液。
6.按照权利要求5所述的精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂，其特征在于还包括标准品溶解液，所述标准品溶解液是葡萄糖含量为0.2～2.0％、氯化钠含量为1.0～10.0％、酪蛋白含量为0.1～1.0％的水溶液。(起复溶和稳定作用)
7.按照权利要求6所述的精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂，其特征在于所述显色剂有两种，一种是含有过硼酸钠、氯己啶的柠檬酸与磷酸氢二钠的混合缓冲液；另一种是含有3，3′，5，5′-四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液，其中过硼酸钠含量为0.01～0.10％，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺含量为10～100毫摩尔/升。
8.一种精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂盒，包括标本稀释液、酶结合物、显色剂、洗涤液和终止液，其特征在于还包括含有用于定量检测的弹性硬蛋白酶的标准品和微量孔板，所述微量孔板的底部包被有弹性硬蛋白酶单克隆抗体。
9.一种包被有弹性硬蛋白酶单克隆抗体的微量孔板的制备方法，包括(一)用去离子水配制包被液；(二)在上述包被液中加入小牛血清、葡萄糖，配制成封闭液；(三)将洗涤液稀释；(四)作交叉实验，确定包被抗体与酶标抗体的最佳浓度，用包被液稀释包被抗体至最佳浓度，在微量孔板的各孔中加入包被抗体，使包被抗体充分包被在微量孔板的底部；(五)用洗涤液清洗微量孔板、拍干；(六)在微量孔板的各孔中加入封闭液，使封闭液中的大分子物质吸附在未被包被抗体所包被的微量孔板的底部；(七)用洗涤液再清洗微量孔板内未吸附的封闭液，拍干；(八)置入无菌室，抽湿干燥；(九)装袋、封口保存。
10.将精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂用于检测精浆弹性硬蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步骤(一)试剂准备(1)标本稀释液配备将浓缩标本稀释液稀释至应用浓度；(2)标准品制备将标准品冻干粉置入溶解液溶解后用标本稀释液稀释成不同浓度的标准品；(3)洗涤液配备将洗涤液稀释至应用浓度；(二)标本制备将采集的精液经液化、离心处理后，留取待检精浆标本并用标本稀释液稀释；(三)定量检测(1)准备适当数量的包被微量板孔，标准液、稀释标本加样量相等，标准液取不同浓度；(2)用封片膜封板，使标准液和稀释标本中的弹性硬蛋白酶与包被在微量孔板上的包被抗体充分反应；(3)弃去封板膜，用洗涤液洗板，洗去标准液和稀释标本中未被包被抗体特异性结合的其它物质并拍干；(4)每孔加酶结合物后，再用封片膜封板，使结合在包被抗体上的弹性硬蛋白酶与酶结合物中的α1-抗胰蛋白酶反应；(5)再次弃去封板膜，用洗涤液洗板，洗去未与弹性硬蛋白酶发生特异性结合的其它物质并拍干；(6)将两种显色剂均匀混合配制后的显色液加入微量孔内，使显色液被包被抗体-弹性硬蛋白酶-α1-抗胰蛋白酶-辣根过氧化物酶复合物上的辣根过氧化物酶催化反应；(7)每孔加终止液充分均匀混合后终止辣根过氧化物酶的催化反应，送至酶标仪；(8)通过酶标仪进行比色，得到检测结果。
全文摘要
本发明公开了一种精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂及检测方法，检测试剂包括标本稀释液、酶结合物、显色剂、洗涤液、终止液和含有用于定量检测的弹性硬蛋白酶的标准品。进一步地，酶结合物是含有α1－抗胰蛋白酶与辣根过氧化物酶的复合物、酪蛋白的三羟甲基氨基甲烷与盐酸的混合缓冲液。试剂中还包括包被有弹性硬蛋白酶单克隆抗体的微量孔板。通过弹性硬蛋白酶单克隆抗体包被材料和酶结合物，可以显效地增加反应的特异性和灵敏度。本发明还公开了上述检测试剂的检测方法，检测方法比较简单、实用，采用标准曲线的检测结果，可以从配用的酶标仪自动输出。综上所述，本发明通过引入标准浓度的弹性硬蛋白酶，从而可以定量检测出精浆弹性硬蛋白酶含量，为更准确的诊断包括隐性感染在内的男性生殖道感染提供科学依据。适宜在治疗男性不育的医疗机构中推广应用。
文档编号C12Q1/37GK1754964SQ20041004079
公开日2006年4月5日 申请日期2004年9月30日 优先权日2004年9月30日
发明者傅剑华, 刘瑜, 胡家纯, 何林, 何小红 申请人:深圳华康生物医学工程有限公司