专利名称：一种重组产气肠杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产气肠杆菌及其应用，特别是涉及一种重组产气肠杆菌及其应用。
背景技术：
氢气作为一种高效且对环境无污染的清洁能源，将来很有可能成为石化能源的替代品。但是，目前它的主要生产来源是石油和天然气，而后两者都是不可再生的稀缺能源。因此，从自然界中大量存在的生物量中获取氢气是最具潜力的制氢方法之一(B.Fabiano，P.Perego. Thermodynamic study and optimization of hydrogenproduction by Enterobacter aerogenes，International Journal of HydrogenEnergy，27149-156，2002；Tatsuya Noike，Hiroo Takabatake，Osamu Mizuno，Mika Ohba.Inhibition of hydrogen fermentation of organic wastes by lacticacid bacteria，International Journal of Hydrogen Energy，271367-1371，2002；Helena L.Chum，Ralph P.Overend.Biomass and renewable fuels，FuelProcessing Technology，71187-195，2001)。
常见的三种产氢细菌为发酵细菌、光合细菌和蓝细菌。使用发酵细菌较其它两种细菌有着独特的优势第一，产氢速度快(Shigeharu TanishoHydrogen productionby facultative anaerobe Enterobacter aerogenes，biohydrogenProceedings ofan International Conference on Biological Hydrogen Production，Hawaii USA，June 1997)；第二，无需供给光能；第三，可以利用有机化合物为碳源处理有机废水以及使生物量低分子化(John R.Benemann.The technology of biohydrogen，BiohydrogenProceedings of an International Conference on BiologicalHydrogen Product ion，Hawaii USA，June 1997)。
发酵制氢的瓶颈在于产氢率较低，实际值仅为理论值的8-20％。目前，产氢的发酵细菌主要有三类肠杆菌(Enterobacter)，芽孢杆菌(Bacillus)和梭菌(Clostridium)(F.R.Hawkes，R.Dinsdale，D.L.Hawkes，I.Hussy.Sustainablefermentative hydrogen productionchallenges for process optimization，International Journal of Hydrogen Energy，271339-1347，2002)。Enterobacter是兼性厌氧菌，后两者是绝对厌氧菌。产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)在好氧和厌氧条件下都能够生长，培养方法也要比专性厌氧菌简单，因而生产成本较低廉，是极有潜力的产氢菌种。到目前为止，利用该菌产氢的最高得率为58mol(H2)/mole(葡萄糖)(S.Tanisho and Y.Ishiwata，Continuous hydrogen production frommolasses by the bacterium Enterobacter aerogenes，International Journal ofHydrogen Energy，20541-545，1995)。提高产氢率是目前生物制氢领域研究的核心内容。采用多菌种混合培养，充分利用不同细菌的功能，是提高产氢率的有效方式。但是，目前的研究只限于工艺优化及其代谢途径研究等内容，几乎所有的研究人员都只关注该菌的纯培养过程，并且还没有采用过基因工程的方法对此进行研究。从技术可行性角度考虑，工业化的制氢过程也不可能采用纯培养方式。因此，建立混合培养体系，充分发挥目标微生物的功能是提高产氢率的一种方向。对产气肠杆菌混合培养体系的利用，不但可以进行生物制氢，还可以实现对产气肠杆菌其它功能的利用，如生产2，3-丁二醇等细胞代谢产物。
为了对混合培养体系进行有效的调控，需要对混合培养体系中的目标微生物的数量进行监控。目前，常规的对混合培养体系中的目标细菌的数量进行监控的方法有荧光原位杂交法(FISH)，16s rRNA定量法，醌测量法等，但这些方法存在不能快速定量，只能半定性定量，且具有破坏性等缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种可发荧光的重组产气肠杆菌。
本发明所提供的重组产气肠杆菌，是将含有绿色荧光蛋白基因的表达载体导入产气肠杆菌中得到的。
其中，用于构建所述含有绿色荧光蛋白基因的表达载体的出发载体可为pUC18、pUC19、pUC118、pUC119等。优选为pUC18或pUC19。
为了便于筛选，所述含有绿色荧光蛋白基因的表达载体还含有卡那霉素抗性基因。
以pUC18或pUC19为出发载体，构建得到的含有绿色荧光蛋白基因和卡那霉素抗性基因的表达载体为PUCKG。
上述含有绿色荧光蛋白基因的表达载体中还可插入tac启动子及其调控序列。
在PUCKG中插入tac启动子及其调控序列得到的表达载体为PUCKTG。
将PUCKTG导入产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)IAM1183(购自IAMCulture Collection)得到发荧光的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)PKG CGMCCNo.1193。
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)PKG CGMCC No.1193已于2004年07月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.1193。其菌落呈淡黄色、圆形、边缘光滑、表面湿润，细胞呈短杆状。
本发明的重组产气肠杆菌进行产氢的发酵培养基和发酵条件与其相应的出发菌株相同。
实验证明，将处于厌氧、微好氧状态的重组产气肠杆菌暴露于空气中，其荧光形成速度和荧光形成最大值这两个数值均与细胞的数量之间呈正相关关系，因而可用这两个参数表征细胞量，实现对产气肠杆菌的定量追踪。用此方法可快速实现对培养过程中产气肠杆菌的定量追踪(一个小时即可测出荧光形成最大值，5分钟甚至更短时间内可测出荧光形成速度)，并且对菌体细胞无破坏性，相对于其它半定性方法更能够准确定量培养体系内带荧光细胞的实际浓度。
本发明的重组产气肠杆菌可用于大规模发酵制备氢气，技术可行性强，此外还可对该菌进行荧光定量追踪，便于进行生产的工业化控制，因而本发明具有较高的实际应用价值和广阔的工业应用前景。
图1为gfp基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱图2为卡那霉素抗性基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱图3a为载体PUCK的物理图谱图3b为载体PUCKG的物理图谱图4为载体PUCKT的物理图谱图5为载体PUCKTG的物理图谱图6为重组产气肠杆菌的荧光显微镜照片图7为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)PKG CGMCC No.1193暴露于空气中产生的荧光随时间变化曲线图8为荧光形成速度、荧光最大值和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)PUCKG CGMCC No.1193细胞量相关关系曲线图9为荧光定量追踪产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)PUCKG CGMCCNo.1193细胞生长过程曲线图10为荧光形成速度、荧光恢复最大值与细胞光密度的拟合曲线具体实施方式
实施例1、表达载体PUCKG的构建1、gfp基因的获得以载体pQB-2(Metabolic Engineering of Escherichia coliIncrease of NADHAvailability by Overexpressing an NAD+-Dependent Formate DehydrogenaseMetabolic Engineering 4，217-229，2002)为模板，以引物2Pup5’AGAGAATTCCATGAGTAAAGGAGAAGAAC3’(划线部分碱基为EcoRI的酶切位点)和Pdo5’GGAGGTACCTTATTTGTATAGTTCATCCA3’(划线部分碱基为KpnI的酶切位点)为引物进行PCR扩增。其中，反应体系采用北京赛百盛公司提供的50微升傻瓜PCR反应体系；反应条件为94℃ 5min；94℃ 45s，54℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示(泳道1-3、5-7为gfp基因，泳道4为Marker)，表明得到大小约为700bp的条带，与gfp基因大小一致。
2、卡那霉素抗性基因的获得以载体pET28a(Novagene 69864-3)为模板，以引物1Pup5’CGTTGCTGGGACCTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGA3’(划线部分碱基为AvaII的酶切位点)和Pdo5’GCGGGTACGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATG3’(划线部分碱基为AvaII的酶切位点)为引物进行PCR扩增。其中，反应体系采用北京赛百盛公司提供的50微升傻瓜PCR反应体系；反应条件为94℃ 5min；94℃ 45s，63.5℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示(泳道1、3为Marker，泳道2为卡那霉素抗性基因)，表明得到大小约为1.7kbp的条带，与卡那霉素抗性基因大小一致。
3、tac启动子及其调控序列的获得以载体pMAL-p2X(NEB)为模板，以引物4Pup5’CGCCCCTCGAGTGGTGCAAAACCTTTC3’(划线部分碱基为XhoI的酶切位点)和Pdo5’CGGGGGAATTCATTATACGAGCCGATG 3’(划线部分碱基为EcoRI的酶切位点)为引物进行PCR扩增。其中，反应体系采用北京赛百盛公司提供的50微升傻瓜PCR反应体系；反应条件为94℃ 5min；94℃ 45s，60℃1min，72℃ 1min，30个循环；72℃5min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明得到大小为1.4kbp的条带，与tac启动子大小一致。
4、重组质粒载体PUCK及PUCKG的构建(1)重组质粒载体PUCK的构建将卡那霉素抗性基因和载体pUC18(GenBank，L09136)用AvaII限制性内切酶消化后再用T4DNA连接酶将两者连接起来，通过CaCl2法转化大肠杆菌JM109，以引物1为引物通过菌落PCR筛选转化子，并通过AvaII酶切进行结构验证，结果得到结构正确的重组质粒载体，命名为PUCK(其物理图谱如图3a所示)。
(2)重组质粒载体PUCKG的构建将利用引物2得到的克隆产物gfp基因片段用限制性内切酶EcoRI和KpnI消化，与载体PUCK通过相同的内切酶消化后得到片断连接，转化大肠杆菌JM109，利用引物2通过菌落PCR筛选转化子，并通过EcoRI和KpnI酶切进行结构验证。结果得到结构正确的重组质粒载体，命名为PUCKG(其物理图谱如图3b所示)。
5、重组质粒载体PUCKT及PUCKTG的构建(1)重组质粒载体PUCKT的构建以载体PUCK为模板，以引物3Pup5’GGGGGCGAATTCATGAGTAAAGGAGAAGAA 3’(划线部分碱基为EcoRI的酶切位点)和Pdo5’ATCACTCGAGAACGCAGGAAAGAACATGTGA 3’(划线部分碱基为XhoI的酶切位点)为引物扩增得到载体PUCK 1-229以外区域的片段，同时引入EcoRI和XhoI酶切位点。其中，PCR的反应条件和反应体系(除引物和模板外)与步骤2同。
将扩增得到的载体PUCK 1-229以外区域的片段和步骤3中得到的tac启动子及调控序列用EcoRI和XhoI用限制性内切酶消化后再用T4DNA连接酶将两者连接起来，转化大肠杆菌JM109，以引物4为引物通过菌落PCR筛选转化子，并通过EcoRI和XhoI酶切进行结构验证，结果得到结构正确的重组质粒载体，命名为PUCKT(其物理图谱如图4所示)。
(2)重组质粒载体PUCKTG的构建将质粒载体PUCKT和gfp基因用EcoRI和KpnI限制性内切酶消化后再用T4DNA连接酶将两者连接起来，转化大肠杆菌JM109，利用引物2通过菌落PCR筛选转化子，并通过EcoRI和KpnI酶切进行结构验证，结果得到结构正确的重组质粒载体，命名为PUCKTG(其物理图谱如图5所示)。
实施例2、重组产气肠杆菌的构建及其特性将载体PUCKG或PUCKTG采用CaCl2转化法分别导入产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)IAM1183(购自IAM Culture Collection)中，经筛选得到含有PUCKG或PUCKTG的重组产气肠杆菌，其中含有PUCKTG的重组产气肠杆菌为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)PKG CGMCC No.1193。
将上述两株菌于LB(含10μg/ml卡那霉素，1mM IPTG)液体培养基中，在37℃，150rpm条件下培养12h，用荧光显微镜观察，结果表明上述两株菌带荧光(图6)。
实施例3、重组产气肠杆菌的荧光定量追踪用乳糖培养基(每升含有15g乳糖，5g蛋白胨，14g K2HPO4，6g KH2PO4，2g(NH4)2SO4，1g柠檬酸三钠，0.2g MgSO4·7H2O，pH7.0)对产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)PKG CGMCC No.1193进行厌氧培养0h-22h，将处于厌氧状态的细胞用PBS缓冲液清洗、重悬后暴露于空气中(敞口摇瓶置于37摄氏度、170rpm摇床)，使分子氧与细胞内的原始绿色荧光蛋白结合形成成色基团，产生荧光，从而得到厌氧培养6h细胞暴露于空气中产生的荧光随时间变化的曲线(图7)，图7中带矩形的曲线，带圆点的曲线，带正三角形的曲线和带倒三角型曲线分别表示细胞光密度分别为0.31，0.155，0.0775，0.03875的荧光形成曲线，表明细胞浓度越大，荧光形成速度和荧光形成最大值也越大。对图7数据进行拟和，得到如图8所示的厌氧培养6h细胞的细胞量和荧光形成速度、荧光最大值相关关系曲线，图8表明荧光形成速度(带矩形的曲线)、荧光形成最大值(带圆点的曲线)这两个数值均与细胞的数量呈正相关关系([ΔF’]/Δt＝93.7×OD600；[F’]max＝162.9×OD，其中，[ΔF’]/Δt表示荧光形成速度，，[F’]max表示荧光形成最大值，F’表示任意时刻荧光恢复形成的荧光量)，从而可以用荧光形成速度和荧光最大值这两个参数表征细胞的数量，实现对细菌的定量追踪。用以上确立的荧光形成方法对在乳糖培养基中厌氧生长的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)PK6 CGMCC No.1193的生长及产气过程进行追踪，分别在2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22小时取样进行分析，监测该时刻荧光形成最大值，荧光形成速度，细胞光密度和总产气量。结果如图9所示(带实心圆点的曲线代表荧光形成最大值、带空心圆点的曲线代表荧光形成速度、带矩形的曲线代表细胞光密度OD600、带三角形的曲线代表培养过程的总产气量)，表明在细胞培养过程的前10小时，无论是荧光形成速度还是荧光形成最大值都与细胞光密度变化趋势相同，且成正相关关系。它们的拟合结果如图10所示，虚线和实线分别是荧光形成速度、荧光形成最大值与细胞光密度的拟合曲线，可以得到[ΔF’]/Δt＝360×OD600-50；[F’]max＝401×OD-44，也就是说在此期间可以对细胞浓度进行定量追踪。
权利要求
1.一种重组产气肠杆菌，是将含有绿色荧光蛋白基因的表达载体导入产气肠杆菌中得到的。
2.根据权利要求1所述的重组产气肠杆菌，其特征在于用于构建所述含有绿色荧光蛋白基因的表达载体的出发载体为pUC18、pUC19、pUC118、pUC119。
3.根据权利要求2所述的重组产气肠杆菌，其特征在于所述出发载体为pUC18或pUC19。
4.根据权利要求1、2或3所述的重组产气肠杆菌，其特征在于所述表达载体还含有卡那霉素抗性基因。
5.根据权利要求4所述的重组产气肠杆菌，其特征在于所述表达载体为PUCKG。
6.根据权利要求4所述的重组产气肠杆菌，其特征在于所述表达载体还含有tac启动子及其调控序列。
7.根据权利要求6所述的重组产气肠杆菌，其特征在于所述表达载体为PUCKTG。
8.根据权利要求7所述的重组产气肠杆菌，其特征在于所述重组产气肠杆菌为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)PKG CGMCC No.1193。
全文摘要
本发明公开了一种重组产气肠杆菌及其应用，其目的是提供一种可发荧光的重组产气肠杆菌及其应用。本发明所提供的重组产气肠杆菌，是将含有绿色荧光蛋白基因的表达载体导入产气肠杆菌中得到的。本发明的重组产气肠杆菌可用于大规模发酵制备氢气，技术可行性强，此外还可对该菌进行荧光定量追踪，便于进行生产的工业化控制，因而本发明具有较高的实际应用价值和广阔的工业应用前景。
文档编号C12N1/21GK1587388SQ20041007443
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月15日 优先权日2004年9月15日
发明者张翀, 邢新会 申请人:清华大学