专利名称：植物韧皮部和淀粉鞘特异表达的蛋白酶抑制剂基因启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学和植物基因工程领域，具体的说，涉及一个基因启动子。
背景技术：
韧皮部(phloem)是植物体内负责远距离运输的重要组织，其筛分子(sieve element)是一类高度特化的细胞。韧皮部不仅仅涉及运输有机养料(有机氮、碳水化合物等)，还包括种类繁多的mRNA、蛋白和其它大分子、信号分子等在植物体内的远距离运输(Thompsonet al.，Trends Plant Sci 4354-360，1999；Vilaine et al.，Plant J 3667-81，2003)。因而韧皮部的功能涉及到养料分配、信号转导、系统防御等等。
在韧皮部的伤流液中，发现有200多种蛋白，但只有少数几种蛋白的功能有所明确(Thompson et al.，Trends Plant Sci 4354-360，1999；Vilaine et al.，Plant J 3667-81，2003)，例如韧皮部凝集素蛋白(PP2，Bostwick et al.，Plant Cell 41539-1548，1992)，蔗糖载体(sucrosecarrier，Riesmeier et al.，EMBO J 114705-4713，1992；Riesmeier et al.，Plant Cell 51591-1598，1993；Riesmeier et al.，EMBO J 131-7，1994)，韧皮部硫氧还蛋白h(thioredoxin h，Ishiwatari et al.，Planta 195456-463，1995)等。通常韧皮部的蛋白都是在伴胞内合成再转运到筛管中(Golecki et al.，Plant Cell 11127-140，1999)。黄瓜(CucumisSativus)和Cucurbita maxima的嫁接实验证明筛管中确实存在蛋白质的长距离运输，并提示蛋白质的运输可能受到特别的调控(Golecki etal.，Plant Cell 11127-140，1999)。
除了作为韧皮部的结构蛋白或运输载体，韧皮部的蛋白也可能是进行长距离传导的信号分子，通过蛋白修饰或变构来被激活(Thompson et al.，Trends Plant Sci 4354-360，1999)。在水稻的筛管中发现有对光周期敏感的蛋白，其磷酸化和去磷酸化的两种形式都同时存在(Nakamura et al，Plant Cell Physiol 34927-933，1993)。多肽激素，例如18个氨基酸的系统素，在整个植物的韧皮部进行转运(Narváez-Vásquez et al，Planta 195593-600，1995)。系统素是一个诱导分子，可以引发创伤诱导的蛋白酶抑制剂的合成，参与植物的系统防御。因此，它很可能是作为信号分子在韧皮部存在的。在韧皮部还检测到蛋白酶抑制剂，它们具有抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性(Murray and Christeller，Biol Chem Hoppe Seyler 376281-287，1995)。
本发明所涉及的龙葵PIN2(SaPIN2a)，属于蛋白酶抑制剂II(PIN2)家族，是一种可以抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的丝氨酸型蛋白酶抑制剂。PIN2通常存在于茄科植物的花、果、块茎、受创伤诱导的叶等器官中，有抗虫的功能。但本发明涉及的SaPIN2a还在韧皮部中大量存在，这与同一基因家族的蛋白酶抑制剂SaPIN2b的分布明显不同(Xu et al.，Plant Mol Biol 22573-588，2001)。
发明内容
本发明的目的是提供一种新克隆的蛋白酶抑制剂基因SaPIN2a启动子，用于驱动外源基因在转基因植物的韧皮部和淀粉鞘中特异地表达。
本发明的另一个目的是提供一种含有上述启动子序列与所需的目的基因的编码区核苷酸序列连接后产生的基因的重组质粒。
本发明的另一个目的是提供一种由上述重组质粒转化的重组微生物。
本发明的另一个目的是提供上述重组微生物在转基因植物中的应用。
本发明的另一个目的是提供上述重组质粒在转基因植物中的应用。
本发明涉及发明人首次克隆的具有植物韧皮部和淀粉鞘特异性表达的龙葵蛋白酶抑制剂IIa(SaPIN2a)基因启动子的DNA序列。包含该DNA序列与GUS报告基因编码区融合的构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，及转化植物组织获得的在韧皮部和淀粉鞘表达报告基因的转基因植物。
蚜虫等刺吸式昆虫以取食植物韧皮部汁液为生，不少病毒亦通过植物韧皮部进行感染，对农作物造成了巨大的损害。在抗虫、抗病基因工程中常用的组成型表达启动子，驱动目的基因在植物体内各部位平均表达，难以在受侵害组织形成较高的作用浓度，而在非侵害部位表达对植物本身是一种额外负担和能源及养分的浪费。如果利用韧皮部组织特异表达启动子使抗虫、抗病基因在韧皮部组织特异的高效表达，就可以更有效、更经济的发挥目的基因的作用，有针对性的防治从韧皮部入侵的害虫和病原微生物的危害，降低对害虫及病原微生物的选择压以及可能对环境产生的副作用，减轻由于表达抗虫、抗病基因而给转基因植物带来的代谢负担。另外，在双价或多价抗虫、抗病基因工程中使用与组成型启动子不同的韧皮部组织特异性启动子可以避免启动子之间同源序列的相互作用而导致基因沉默。
本发明采用基因组DNA步移法，根据龙葵SaPIN2a基因的cDNA序列(GenBank登记号为AF174381)设计引物，从龙葵基因组DNA文库中克隆了龙葵SaPIN2a基因启动子。该启动子的核苷酸序列见SEQ ID NO1。本发明首次获得的龙葵SAPIN2a启动子序列1557bp，其部分片段1549bp(序列如SEQ ID NO2所示)完全足以驱动目的基因编码区的核苷酸序列在转基因植物的韧皮部和淀粉鞘中特异表达。
本发明涉及龙葵SaPIN2a启动子的DNA序列，包含所说DNA序列的能有效的调控目的基因在植物韧皮部和淀粉鞘中特异表达的部分片段，所述的片段与目的基因序列连接并转化植物外植体及再生植株的方法，以及由此产生的显著地在韧皮部和淀粉鞘中特异表达目的基因的转基因植物。
本发明要求所述启动子的核苷酸序列的全部或部分片段与目的基因编码区的核苷酸序列相融合产生杂合基因构建体。在分子生物学中为本领域技术人员所熟知的常用方法都可用于对该启动子的核酸序列进行操作。例如将启动子的序列连接在目的基因编码区核苷酸序列的5’端或“上游区”。
本发明所述的“目的基因编码区的核苷酸序列”指任何能在mRNA水平表达的核苷酸序列。所表达的mRNA可以被翻译成蛋白或不被翻译成蛋白。
本发明中使用GUS基因作为报告基因。GUS基因编码β-葡萄糖苷酸酶，可以在体外催化裂解人工合成的X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸)底物，产生深蓝色化合物沉淀于植物组织。
本发明将首次克隆的SaPIN2a启动子片段(1.55kb)与GUS报告基因融合，产生可用于植物表达的载体pPABS，并转化入大肠杆菌和农杆菌，利用携带该质粒载体的农杆菌转化烟草。结果表明，SaPIN2a启动子能够驱动报告基因在转基因烟草韧皮部和淀粉鞘中特异表达。
本发明涉及调控目的基因编码区的核苷酸序列在韧皮部和淀粉鞘中特异表达的启动子。所述的“韧皮部和淀粉鞘中特异表达”指在韧皮部和淀粉鞘中的表达水平显著高于在植物其它部位的表达。
本发明所克隆的龙葵SaPIN2a启动子的序列与其他PIN2启动子的序列几乎不具有同源性，同时具有与其他PIN2启动子不同的韧皮部和淀粉鞘特异表达的特征。足以证明本发明的启动子是一个新的韧皮部和淀粉鞘组织特异性启动子。
本发明使用RLM-5’RACE(RNA ligase-mediated rapidamplification of 5’cDNA ends)分析方法检测了所克隆的SAPIN2a启动子驱动下游基因表达时的转录起始位点，为SEQ ID NO1或SEQID NO2中所示的标记为“+1”的腺苷酸“A”。
图1为植物表达载体pPABS的构建图；图2为SaPIN2a基因启动子驱动的GUS报告基因在转基因烟草中的组织化学定位(示茎横切面)；其中，图2中，A为X-gluc染色；B为碘-碘化钾染色；ep外韧皮部；ip内韧皮部；p叶肉薄壁组织；ss淀粉鞘；x木质部。
具体实施例方式
实施例1采用接头连接PCR(Adaptor-ligation PCR)法进行基因组DNA步移，从龙葵基因组DNA中扩增并克隆出SaPIN2a基因启动子序列。基因组步移所用试剂盒为Clontech公司的GenomeWalkerTMKit。具体步骤如下1.龙葵基因组DNA的提取取5克龙葵叶于液氮中研磨成粉后转移到30ml离心管中，加入15ml的提取缓冲液[100mM Tris(pH8.0)，50mM EDTA(pH8.0)，500mM NaCl，10mMβ-巯基乙醇]，混匀。接着向管中加入1ml 20％的SDS，充分混匀，于65℃温育10分钟。然后加入5ml 5M的乙酸钾，充分混匀后置于冰上20分钟。25000×g离心20分钟，取上清至另一干净离心管中，加入10ml的异丙醇，混匀后于-20℃静置30分钟。20000×g离心15分钟，去上清，DNA沉淀自然风干后溶于750μl TE[50mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)]。将上述DNA溶液转移到一Eppendorf管中，分别用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次。上清DNA溶液转移到另一Eppendorf管，再加入500μl异丙醇和75μl的NaAc(pH5.2)，混匀，于12000×g离心5分钟，沉淀用80％的乙醇洗涤，风干后溶于500μl TE(pH8.0)中。
2.基因组DNA的酶切消化和接头连接，构建“基因组文库”将提取的龙葵基因组DNA用产生平末端的限制性内切酶(DraI，EcoRV，StuI，PvuII)进行酶切。100μl酶切反应体系中加入8U(U为酶活力单位)的限制性内切酶，于37℃恒温过夜，然后用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次。将上清DNA溶液转移至Eppendorf管，向管中加入2倍体积的冰冷无水乙醇，1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)和20μg的糖原，混匀。12000×g离心10分钟，沉淀所得DNA用80％的乙醇洗涤，风干后溶于20μl TE(pH7.5)。各自酶切后的基因组DNA分别与基因组步移接头进行连接，10μl反应体系中包含4μl纯化的酶切基因组DNA，1.9μl基因组步移接头(25μM)(接头长链5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3′；接头短链5′-PO4-ACCAGCCC-NH2-3′)，1.6μl10×连接缓冲液，0.5μlT4DNA连接酶(6U/μl)。混合液于16℃过夜反应后，于70℃保温5分钟以终止反应，得到“基因组文库”。
3.基因组DNA步移和扩增用上述构建好的“基因组文库”，进行PCR扩增，共两轮PCR。根据已测定的SaPIN2a cDNA(GeneBank登录号AF174381)序列，设计、合成基因特异引物2aGSP1和2aGSP2。2aGSP15’-CTGTGTATCACATTCGAAGGTACAATC-3’2aGSP25’-ATCTTTTGGGTTTCTAGGGTCAGATTC-3’首轮PCR。50μl反应体系中包含5μl 10×PCR反应缓冲液，2μl dNTP(各10mM)，2.2μl MgAc2(25 mM)，1μl接头引物1(AP1，10mM)(AP15′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)，1μl基因特异引物2aGSP1(10mM)，1μl Advantage Genomic Polymerase Mix，1μl DNA模板，36.8μl去离子水。PCR反应参数为(1)94℃25秒，72℃3分钟，7个循环；(2)94℃25秒，67℃3分钟，32个循环；(3)67℃保温7分钟。将首轮PCR产物稀释50倍，用于第二轮PCR。第二轮PCR。50μl反应体系中包含5μl 10×PCR反应缓冲液，2μldNTP(各10mM)，2.2μl MgAc2(25mM)，1μl接头引物2(AP2，10mM)(AP25′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′)，1μl基因特异引物2aGSP2(10mM)，1μl Advantage Genomic Polymerase Mix，1μl稀释了50倍的首轮PCR产物，36.8μl去离子水。PCR反应参数为(1)94℃25秒，72℃3分钟，5个循环；(2)94℃25秒，67℃3分钟，20个循环；(3)67℃保温7分钟。
4.序列测定及拼接第二轮PCR产物纯化回收后连接到pGEM-T Easy载体(Promega)上，转化大肠杆菌E.coli DH5a，在含有IPTG和X-gal的LB培养基上培养，挑选白色菌落并提取质粒DNA进行酶切鉴定。根据测序结果获得的SaPIN2a基因启动子序列见SEQ ID NO1。
通过对龙葵SaPIN2a基因进行RLM-5’RACE(RNAligase-mediated rapid amplification of 5’cDNA ends)分析，确定该基因的转录起始位点。
按照Invitrogen公司的RLM-5’RACE分析试剂盒推荐步骤扩增SaPIN2a cDNA的5’端用TRIzol试剂(Invitrogen)从龙葵花芽中提取总RNA；提取的总RNA用小牛肠磷酸酶CIP处理除去5’磷酸；然后用烟草酸性焦磷酸酶(TAP)处理，去除全长mRNA的5′端帽子结构；接着将GeneRacerTMRNA寡聚接头(GeneRacerTMRNA寡聚接头5′-CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3′)连接到处理后的mRNA 5’端；以连好接头的mRNA为模板，用2aGSP引物(5′-CTGAGCTCTTATAGCTCATCTTTGAAATAAGCAGTGGTCTTGG-3′)在SuperscriptTMII反转录酶催化下合成第一条cDNA链；以合成的cDNA链为模板，进行PCR扩增，50μl反应体系中包含5μl 10×PCR反应缓冲液，1μl dNTP(各10mM)，1μl 5’GeneRacerTM引物(5′-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3′)，1μl 2aGSP引物，1μl反转录后的cDNA，0.5μl Ex Tag酶(TaKaRa)，40.5μl灭菌水。反应参数为(1)94℃，2分钟，1个循环；(2)94℃30秒，62℃30秒，72℃80秒，35个循环；(3)72℃保温10分钟。扩增产物直接连接到pGEM-T Easy载体上，转化大肠杆菌E.coli DH5a，筛选阳性克隆，提取质粒酶切鉴定后测序，确定SaPIN2a基因的转录起始位点为SEQID NO1所示的“+1”位点的核苷酸“A”。
用龙葵SaPIN2a基因启动子的1549bp长的片段与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因嵌合，转化烟草与龙葵，对所得到的转基因植株T0代与T1代进行组织化学染色分析，确定此启动子的表达模式，具体步骤如下。
1.双元表达载体的构建将PCR扩增出来的1549bp的SaPIN2a启动子片段插入到pBI101.1的EcoRI和HindIII位点上，命名为pPABS；用pPABS转化大肠杆菌E.coli DH5a，筛选出阳性克隆；然后提取质粒转化农杆菌A.tumefaciens LBA4404。构建过程见图1。
2.农杆菌介导的烟草转化首先从平板接种农杆菌单菌落于5ml YEB液体培养基(卡那霉素50μg/ml，利福平50μg/ml，链霉素200μg/ml)，28℃下180rpm振荡培养两天；然后用液体再生培养基稀释农杆菌液至OD600约为0.2～0.3(约稀释20倍)；将无菌的烟草叶切至0.5cm2，放入稀释的农杆菌液中，轻摇5分钟后取出用无菌滤纸吸干叶片表面的液体后，平展于再生固体培养基平板上，共培养2-3天；将共培养后的叶片外植体用MS液体培养基漂洗5次，然后置于滤纸上吸干，并转移到再生培养基固体平板(卡那霉素100μg/ml，羧苄青霉素250μg/ml)上，28℃培养，每两周换一次培养基；4至6周后，切下1～2cm的小芽移到组织培养瓶中生根壮苗，生根培养基中含100μg/ml的卡那霉素及100μg/ml的羧苄青霉素。
3.组织化学染色分析取新鲜样品置于X-gluc染色液
中，抽真空半小时后37℃保温过夜。用70％，80％，95％乙醇梯度脱色，直到除去叶绿素。脱色后的样品在光学显微镜下观察拍照或置于50％甘油中保存。染色结果(见图2)显示，在转SaPIN2a启动子与GUS融合基因烟草的茎中GUS表达具有显著的韧皮部和淀粉鞘特异性。而对照转pBI101植株中未检测到GUS活性。GUS染色检测转pPABS烟草再生植株共69株，其中GUS染色阳性的共54株，占78％。
综上所述，本发明克隆的SaPIN2a基因启动子序列与GUS报告基因融合构建成植物表达载体后，通过农杆菌介导转化烟草，证明该启动子序列能够驱动目的基因在植物韧皮部和淀粉鞘中特异地表达。该启动子可用于抗虫、抗病植物基因工程的研究和开发以及植物分子生物学中的基因表达调控和功能研究。
UN3304~1.txtSEQUENCE LISTING<110>中山大学<120>植物韧皮部和淀粉鞘特异表达的蛋白酶抑制剂基因启动子<130>
<160>2<170>
<210>1<211>1557<212>DNA<213>龙葵Solanum americanum<400>1-1508CTGCCATCAT TTTGCTTGTT GGAGGCCCCA ATCCGTGACT TGTCCTTTTG-1458ATTCCTTTTG AAAAAAAATA TTTTTAGAAT AGTATAGATA GAGTGTATTA-1408AAAACGTTGA GACTAGTAAT ACTAATTAGT TATACTAGAA AAAAAATTAT-1358TTACTATTTG ATTTGATGTA TATTAAGAAT AATTGTATTA CTAATATCAT-1308ACTTACTTAT GTATTAATAT TCATTGTATT ACTAATATCA TGATTTACTA-1258TGTAATAATC AAATTTTTTG TTGATTTCAA AATTTTATAT ATTAAAAAAT-1208AATTAAATTA TAAATTTATT TAATGTGGAA ACCTTTTTAA CTTATAGGCC-1158TTCAATGAGA GGTGCATTGT GCTTTTATTT TTGAGAAAAC TACACTAATT-1108GGACCAATTA TTGAAATTAA TTACATAAAT TGGACTCAGT CTATACTATT-1058TAGGCGAAAT GAACTTAAAT CTCAAAATAT TTACACCCAT GCCCCCTCCC-1008CCCGTTCGCT TTGCCCATGG CCCTGATTCC TCTTGTATAC CATCGGAGTA-958 TACAAGAGTA AATTATATAC TATGATGGTA TACAAGTTGT TTCTTCTTGA-908 TACCATCAGA ATATACATGA TTTCTCTTGT ATACCATCGG AGTATACAAG-858 AGTAAAATAT ATACTCTGAT GGTATACAAG AGGAATCATG TATACTCTGA-808 TGGTATCAAG AAGACTTCTT GATACCATCA AAGTATATAT TTTACTCTTG-758 TATACTCCGA TGGTATACAA TGCGCGAAAT ACATATGTAC TTAGTTATTT-708 TGGGGGGCAT GATAGCAATG GGATAGGCAA CTATAATTAT TTTCAGTTTT-658 TGGGGCATTC TTATTCTTTT CCCTTTATTT TTTATCCATA GATTAAGATA-608 TGGGTAAATT TAGAATTAAT TAAGCGGGAT TTGTCTACAA TTAACTCTGT-558 TGCCGCATGA ACTTCAATGG CAAATAGGAA AAGTTTTAAA ATTAAGGAAG-508 TCTTATATAC CTCAAATAAA GAACGATTAA TAAGTAAATT TGTTAATTAA-458 TTTTAATTTA TAATTATTAA CAAAGTAACT AAAATGAAAG TGTATTTAAA-408 CAAAGGAATT TTTTAGGGGG TTTTAGTTTT CCAAATGTTA GGAGCTCCAA-358 CGTAACTCAT TATCTAATAG CCAAAGTTAA GTCATTTCAA AATGTTAAAT-308 AATTTTTAAA ATAATAAATG ATAATTTTAT CTAGTATAAT TTTTTTAATA-258 TACGATAAAA AATTTAATCA ACATTTTTAA AAGTAGATGT ACTTTTAGAG-208 CAATATATAT AGATGGTCTC TTACACCAAA TTAATAAAAT CTTTCTCTAA-158 TAACTATAGG TGGGTCACAC AACTTTTGTT TGCCATATAT TTATCCACAA-108 TTGGACAAAT TAAAATAAAA TATATTTTTA GTACAATAAA TAAATAAAAA
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权利要求
1.一种新克隆的蛋白酶抑制剂基因启动子，其特征在于具有核苷酸-1508至+49的1557bp的序列，如SEQ ID NO1所示。
2.根据权利要求1所述的蛋白酶抑制剂基因启动子，其特征在于-1508至+41的1549bp核苷酸序列足以驱动外源基因在转基因植物的韧皮部和淀粉鞘中特异表达，其序列如SEQ ID NO2所示。
3.一种含有权利要求1或2所述的核苷酸序列与所需的目的基因的编码区核苷酸序列连接后产生的基因的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于能在植物韧皮部和淀粉鞘中特异表达。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，它是pPABS。
6.一种重组微生物，其特征在于该微生物是由权利要求4或5所述重组质粒转化微生物得到的。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于其原始微生物菌种是埃希氏大肠杆菌DH5α。
8.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于其原始菌种是土壤根癌农杆菌LBA4404。
9.权利要求7或8所述的重组微生物在转基因植物中的应用。
10.权利要求3所述的重组质粒在转基因植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种植物韧皮部和淀粉鞘特异表达的蛋白酶抑制剂基因启动子。本发明提供了采用基因组DNA步移法克隆的龙葵蛋白酶抑制剂IIa(SaPIN2a)基因启动子的序列。用5’cDNA末端快速扩增法确定了SaPIN2a转录起始位点；用包含所述的SaPIN2a启动子DNA序列与β－葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因融合构建植物表达载体；用所产生的载体转化烟草，对所获得的转基因植株进行检测，表明GUS报告基因在植物韧皮部和淀粉鞘中特异地表达。
文档编号C12N15/29GK1657622SQ20041007771
公开日2005年8月24日 申请日期2004年12月29日 优先权日2004年12月29日
发明者徐增富, 黄小乐, 邓宇歌, 刘进 申请人:中山大学